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1. 认领

【期刊论文】 • JM Cassady,丛浦珠,RG Cooks,R Roush,CJ Chang,RG Powell • 《药学学报》 • 1988年第05期 351 - 355，共5页

机构： [1] Purdue

摘要： 三尖杉树皮粗提取物中的一个新生物碱—高三尖杉酯碱酰胺(homoharringtonamide)的结构,经质谱—质谱分析,初步建议为16。类似的酰胺类生物碱,例如三尖杉碱酰胺(cephalotaxamide,6)、11-羟基三尖杉碱酰胺(11-hydroxycephalotaxamide,9)、三尖杉酯碱酰胺(harfingtonamide,14)或异三尖杉酯碱酰胺(isoharringtonamide,15)也可能存在,后三者(9,14,15)尚未见报道。

摘要译文

关键词: 高三尖杉酯碱酰胺 ；质谱—质谱

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被引量 2

2. 认领

【学位/博士】 • 李舒心 • 北京协和医学院 • 导师：魏辉 • 2023年

摘要：研究目的:在4例CEBPA双突变AML患者中首次发现了重现性DPF2突变,其突变位点为PHD2结构域上的349位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D349N)。本课题拟揭示DPF2突变在CEBPA双突变急性髓系白血病发病中的作用及机制。研究方法:建立D349N突变DPF2(DPF2D349N)及野生型DPF2(DPF2WT)表达载体,用荧光共定位研究突变对DPF在细胞内定位的影响,荧光共定位及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)研究DPF2突变型蛋白与野生型蛋白相互结合的情况。用Co-IP研究突变对DPF2结合乙酰化组蛋白及组装形成SWI/SNF复合物能力的影响。构建表达DPF2WT、DPF2D349N及敲降DPF2白血病细胞系模型,检测DPF2突变对白血病细胞系增殖的影响。用荧光共定位和Co-IP研究DPF2与CEBPA的结合情况。构建DPF2和CEBPA共表达白血病细胞系模型,研究DPF2对表达CEBPA白血病细胞系增殖的影响,在分子和细胞水平阐明DPF2与CEBPA的相互作用。研究结果:通过荧光显微镜观察,我们发现与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins,GFP)融合表达的DPF2wt与Hoechst33342染色的细胞核位置重合,与红色荧光蛋白(Red Fluorescent Proteins,RFP)融合表达的 DPF2D349N也与Hoechst33342染色的细胞核位置重合,提示DPF2WT DPF2D349N均定位于细胞核。同时,我们发现DPF2D349N与DPF2WT荧光位置重合。进一步通过Co-IP证实DPF2WT可结合DPF2D349N。细胞经过组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠处理后,我们通过Co-IP发现野生型DPF2可以与乙酰化组蛋白相结合。与野生型DPF2相比,突变DPF2与乙酰化组蛋白的结合能力下降。SMARCC1是SWI/SNF复合物的重要亚基,通过Co-IP,我们发现DPF2D349N和DPF2WT都可以和SMARCC1相结合,且两者的结合能力没有明显差异。这些结果提示DPF2D349N可以与DPF2WT竞争结合形成SWI/SNF复合物,但DPF2D349N结合乙酰化组蛋白的能力下降,影响SWI/SNF 合物的功能,对DPF2WT具有负显性抑制作用。构建表达DPF2WT或DPF2D349N白血病细胞系模型,我们发现K562细胞中表达DPF2WT组72h 450nmOD值扩增初始的3.27倍,与vector组(3.13倍)相仿(P=0.426),表达DPF2D349N组扩增至初始的3.19倍,也与vector组相仿(P=0.725)。MOLM-13 细胞中,表达 DPF2WT组72h 450nmOD 值扩增至初始的 4.53倍,与vector组(4.88倍)相仿(P=0.077),表达DPF2D349N组扩增至初始的4.44倍,也与vector组相仿(P=0.083)。以上结果提示表达DPF2WT和DPF2D349N均不影响白血病细胞系增殖。构建DPF2敲降细胞系模型,发现K562细胞中短发夹RNA1敲降DPF2组(简写作DPF2sh1)72h 450nmOD值扩增至初始的2。66倍,明显低于scramble shRNA(简写作SCR)组(7.80倍)(P=0.018),短发夹RNA2敲降DPF2组(简写作DPF2sh2)扩增2.10倍,也明显低于SCR组(P=0.019)。MOLM-13细胞中,DPF2sh1组72h 450nmOD值扩增至初始0.74倍,明显低于SCR组(4.88倍)(P<0.001);sh2敲降组扩增0.73倍,也明显低于SCR组(P<0.001)。以上实验提示DPF2敲降减慢细胞增殖。构建DPF2敲降挽救K562细胞模型,发现DPF2WT+DPF2sh1组72h 450nmOD值扩增至初始的4.25倍,明显快于vector+DPF2sh1组(2.56倍)(P=0.002),DPF2D349N+DPF2sh1组扩增至 0.58 倍,明显慢于 vector+DPF2sh1组(P<0.001)。DPF2WT+DPF2sh2组在72h 450nmOD值扩增至初始的3.63倍,明显快于vector+DPF2sh1组(2.58 倍)(P=0.043),DPF2D349N+DPF2sh2 组扩增至 1.07 倍,明显慢于vector+DPF2sh1组(P=0.021)。以上结果提示DPF2WT可部分挽救DPF2敲降表型,DPF2D349N不仅无法挽救,还会进一步减慢细胞增殖。这些结果进一步证实DPF2D349N负显性特征。通过荧光显微镜观察,我们发现与GFP相融合的DPF2和与RFP相融合的CEBPA荧光位置重合,即DPF2与CEBPA荧光定位重合。通过Co-IP发现DPF2WT和DPF2D349N均结合CEBPA。构建DPF2和CEBPA共表达白血病细胞系模型,我们发现,K562细胞中Dox诱导后,CEBPAWT+DPF2WT 72h 450nmOD值扩增至初始的2.32倍,与CEBPAWT+vector组(2.24倍)相仿(P=0.436),CEBPAWT+DPF2D349N组扩增至1.15倍,明显慢于 CEBPAWT+vector 组(P=0.006)。当 CEBPA 为突变型(CEBPAV314VW)时,CEBPAV314VW+DPF2WT组在72h 450nmOD值扩增至初始的3.92倍,与CEBPAV314VW+vector组(4.14倍)相仿(P=0.493),CEBPAV314VW+DPF2D349N组扩增至 2.64 倍,明显慢于 CEBPAV314VW+vector 组(P=0.002)。MOLM-13 细胞中Dox诱导后,CEBPAV314VW+DPF2wt组在72h 450nmOD值扩增至初始的4.25倍,与CEBPAV314VW+vectctor组(4.15倍)相仿(P=0.649),CEBPAV314VW+DPF2D349N组扩增至1.30倍,明显慢于CEBPAV314VW+vector组(P<0.001)。以上结果表明,表达DPF2D349N会减慢表达CEBPA的白血病细胞系的增殖,提示DPF2与CEBPA存在相互作用。研究结论:DPF2D349N为负显性突变,DPF2与CEBPA间存在相互作用,突变的DPF2通过其负显性作用可能参与了 CEBPA突变白血病的发生发展。研究目的:研究高三尖杉酯碱(homoharringonine,HHT)对CEBPA蛋白的影响及其机制,探讨HHT治疗CEBPA双突变急性髓系白血病的作用机制。研究方法:构建K562 CEBPA p30表达细胞系,用Wetern Blot法测定HHT、柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-C)处理前后K562 CEBPA p30表达细胞系以及U937、MOLM-13细胞系中外源和内源性CEBPA蛋白的表达量的变化,测定蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂对CEBPA蛋白表达量的影响。用转录组RNA-seq分析与柔红霉素处理相比,HHT处理后基因表达和通路富集的差异。研究结果:无论是U937和MOLM-13细胞系中的内源性CEBPA蛋白还是K562 CEBPA p30表达细胞系中的外源性CEBPA蛋白,HHT均可降低其表达量(P<0.05),而DNR和Ara-C无此效果。蛋白酶体抑制剂可增加CEBPA蛋白的表达量(P<0.05),蛋白合成抑制剂可减少CEBPA蛋白的表达量(P<0.05)。HHT处理上调了K562 CEBPAp30细胞的核糖体生成相关通路,DNR则不具有这种作用。研究结论:HHT可抑制CEBPA的合成,降低CEBPA蛋白的表达水平,这可能是HHT治疗CEBPA双突变AML的作用机制。

摘要译文

关键词: DPF2 ；CEBPA ；AML ；高三尖杉酯碱 ；CEBPA双突变AML ；RNA-seq

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3. 认领

【学位/硕士】 • 王凤赫 • 北京协和医学院 • 导师：扈金萍 • 2023年

摘要： I黄酮类化合物对有机阴离子转运体3的调控及分子机制研究有机阴离子转运体3(organic anion transporter 3,OAT3)是由溶质载体家族22A8(SLC 22A8)基因编码的摄取型转运体,主要表达在肾小管基底外侧膜上,介导体内许多内源性物质及外源性药物摄取进入肾脏,在其底物的肾排泄过程中发挥重要作用。有研究发现,抑制OAT3可减少肾毒性的底物药物进入肾脏,从而缓解药物引起的急性肾损伤(AKI)。因此,寻找高效低毒的OAT3抑制剂对缓解临床上OAT3介导的AKI具有重要意义。黄酮类化合物是我们日常饮食中常见的膳食多酚类化合物,具有众多药理活性且安全性好。但近年来有研究发现有些黄酮可以通过抑制转运体功能引起药物-药物相互作用(Drug-drug interactions,DDIs)。本研究应用人源化高表达的OAT3-HEK293细胞模型,研究了水果、蔬菜及中草药中富含的97种黄酮类化合物对OAT3转运活性的影响,筛选出对OAT3具有较强抑制作用的黄酮。在细胞和整体动物模型中进一步评价黄酮对OAT3抑制的生物学效应,考察对呋塞米的药代动力学影响及对甲氨蝶呤诱导的大鼠肾损伤的改善。然后构建药效团模型,阐明黄酮类化合物与OAT3的构效关系,为黄酮化合物的结构优化以及预测临床潜在的食物/中草药-药物相互作用提供实验依据。实验结果摘要如下:1.黄酮类化合物对OAT3的抑制作用以及生物学效应评价1.1 OAT3-HEK293细胞摄取实验初筛结果表明,97种黄酮中有17种对OAT3具有较强的抑制作用(抑制率>50%),包括毛蕊异黄酮、染料木素、香叶木素、柚皮苷、山奈酚、艾黄素、木犀草素、高车前素、草质素、鹰嘴豆芽素A、异橙黄酮、甜橙黄酮、千层纸素A、α-萘黄酮、β-萘黄酮、7-羟基黄酮和松属素;49种黄酮对OAT3的抑制作用较弱(抑制率20%-50%);其余31种黄酮对OAT3的转运活性无显著影响(抑制率<20%)。1.2在OAT3-HEK293细胞中,对抑制率大于50%的黄酮进行了抑制强度IC50的测定,结果表明异橙黄酮(IC50=9.60 μM)对OAT3的抑制作用最强,其次是高车前素(IC50=12.21 μM)、香叶木素(IC50=18.59μM)、α-萘黄酮(IC50=26.02 μM)、7-羟基黄酮(IC50=38.71 μM)、艾黄素(IC50=40.83 μM)、木犀草素(IC50=42.35 μM)、柚皮苷(IC50=42.35 μM)、松属素(IC50=43.37μM)、毛蕊异黄酮(IC50=46.92 μM)、千层质素A(IC50=62.17 μM)、甜橙黄酮(IC50=70.02 μM)、β-萘黄酮(IC50=81.02 μM)、草质素(IC50=84.62μM)、山奈酚(IC50=88.77 μM)、染料木素(IC50=90.97 μM)和鹰嘴豆芽素A(IC50=93.75 μM)。1.3在马兜铃酸I(AA-I)诱导的OAT3-HEK293细胞损伤模型中,阳性抑制剂丙磺舒和5种较强的黄酮抑制剂异橙黄酮、高车前素、香叶木素、α-萘黄酮和7-羟基黄酮均能使AA-I的细胞毒性减小,细胞存活率上升,其中,7-羟基黄酮的作用最为明显,使AA-I在10-100μM浓度范围内的细胞存活率曲线显著上移。上述结果提示,黄酮抑制剂可通过抑制OAT3转运活性降低AA-I的摄取,从而降低其细胞毒性。1.4在SD大鼠体内,黄酮化合物对OAT3抑制作用的生物学评价结果表明,大鼠提前30min 口服上述5种黄酮抑制剂后,与对照组相比呋塞米的AUC0-t增加11.54%-59.08%,但弱于阳性抑制剂丙磺舒(310.48%)。上述结果提示,黄酮抑制剂在SD大鼠体内对OAT3的调控可影响到底物药呋塞米的体内暴露量。1.5在甲氨蝶呤(MTX)诱导的SD大鼠肾损伤模型中,阳性抑制剂丙磺舒和上述5种黄酮抑制剂均能不同程度的降低大鼠血清BUN和CREA水平,且使肾内甲氨蝶呤浓度与单独给药组相比减少22.68%-44.33%。上述结果提示,黄酮抑制剂可能通过抑制OAT3介导的摄取作用减少甲氨蝶呤进入肾脏,从而发挥肾保护作用。2.黄酮类化合物与OAT3的构效关系研究黄酮类化合物对OAT3产生抑制作用的构效关系研究结果表明,黄酮类化合物4、7位的氢键受体和4'位的疏水基团是黄酮对OAT3产生抑制作用的关键药效团,当这些位置与空间位阻较大的基团结合时,黄酮对OAT3的抑制作用减小甚至消失,上述结果可为黄酮类化合物的结构改造提供实验依据。综上所述,本研究应用人源化高表达的OAT3-HEK293细胞模型对97种黄酮类化合物进行初步筛选,并对体内外抑制作用的生物学效应进行评价,5种较强黄酮抑制剂可通过抑制OAT3转运活性降低AA-I的细胞毒性、改变呋塞米的药代动力学特征和减轻甲氨蝶呤造成的急性肾损伤。药效团模型的构建可初步阐明黄酮类化合物和OAT3之间的构效关系,为指导黄酮类化合物的结构优化,开发高效低毒的OAT3抑制剂来减轻AKI提供有价值的参考依据。Ⅱ生物碱类化合物对葡萄糖转运体1的调控及分子机制研究葡萄糖转运体1(glucose transporter 1,GLUT1)是由溶质载体家族2A1(SLC 2A1)基因编码的膜蛋白,与细胞的糖摄取和能量代谢密切相关。GLUT1在人体绝大多数的组织细胞中均有分布,通常以较低水平表达。但是,在肺癌、乳腺癌、肝癌等多种高发病率的癌细胞中GLUT1会异常高表达,为癌细胞的增殖迁移提供充足能量。研究发现,抑制GLUT1不仅可以通过减少糖摄取靶向抑制肿瘤生长,还可增加抗癌药物的敏感性,改善肿瘤耐药性问题。因此,目前GLUT1抑制剂的研究已成为全球研发热点。天然产物一直是抗癌药物开发的重要来源,已报道姜黄素、槲皮素、棉酚等天然产物的抗肿瘤活性可能与抑制GLUT1介导的葡萄糖摄取过程有关。生物碱类化合物是一大类主要存在于植物中的含氮天然产物,且具有突出的抗癌活性,紫杉醇、高三尖杉酯碱等生物碱已广泛应用于多种癌症的临床治疗。因此,在生物碱中寻找GLUT1抑制剂可为研发高效的多靶点抗癌药物提供新思路。本研究利用高表达人源化GLUT1的HEK293t细胞模型,研究植物中常见的130种生物碱对GLUT1功能的调控作用,从中筛选出对GLUT1具有较强抑制活性的生物碱,在人肝癌(HepG2)细胞中进一步考察生物碱对GLUT1抑制的生物学效应。然后,应用CDOCKER分子对接技术探究生物碱类化合物抑制GLUT1的分子机制。构建药效团模型阐明二者之间的构效关系,为预测未经检测的生物碱类化合物对GLUT1的活性影响,及GLUT1抑制剂的结构优化和改造提供实验依据。实验结果摘要如下:1.生物碱类化合物对GLUT1转运功能的影响以及生物学效应评价1.1 GLUT1-HEK293t细胞摄取实验初筛结果表明,千金藤素、二氢小檗碱、酒石酸长春质碱、盐酸小檗胺和延胡索甲素这5种生物碱对GLUT1有较强的抑制作用(抑制率>50%)。另有46种生物碱对GLUT1的抑制作用较弱(抑制率为20%-50%),其余79种生物碱在100μM或最大无毒浓度下对GLUT1无明显抑制作用(抑制率<20%)。1.2在GLUT1-HEK293t细胞中,对抑制率大于50%的生物碱进行了抑制强度IC50的测定,结果表明,二氢小檗碱对GLUT1转运2-NBDG的抑制作用最强(IC50=39.78 μM),其次为盐酸小檗胺(IC50=44.06μM),延胡索甲素(IC50=50.68 μM),酒石酸长春质碱(IC50=59.1 μM),千金藤素(IC50=67.28 μM)。1.3在人肝癌(HepG2)细胞中评价生物碱对GLUT1抑制活性的生物学效应,结果显示,二氢小檗碱、延胡索甲素和酒石酸长春质碱均可使索拉非尼的细胞毒性显著增加,其中,二氢小檗碱的作用最强,使索拉非尼在HepG2细胞中的IC50值从14.38 μM下降至5.43 μM,显著低于阳性抑制剂槲皮素的IC50值10.87 μM。上述结果提示,GLUT1的生物碱抑制剂可增强HepG2细胞对索拉非尼的敏感性,发挥抗肿瘤协同作用,且优于阳性抑制剂槲皮素。2.生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的分子机制以及构效关系研究2.1生物碱与人GLUT1蛋白的分子对接结果表明,GLUT1蛋白内腔中的Gln283、Asn288、Asn317、Asn411、Trp412和Ile164氨基酸残基可能是发生抑制作用的关键位点。此外,氢键和Pi-烷基键的形成可能是生物碱类化合物对GLUT1抑制作用的关键因素,且形成数量与抑制强度呈正相关。2.2生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的构效关系研究结果表明,氢键受体和疏水基团是生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的重要药效团。结合体外研究结果发现,生物碱中的疏水作用的基团在抑制活性中发挥关键作用,如烃基、甲氧基、酯基、酰胺基等。综上所述,本研究应用人源化高表达的GLUT1-HEK293t细胞模型系统地研究了中草药中常见的130种生物碱类化合物对GLUT1转运活性的影响。筛选出对GLUT1具有较强抑制作用的5种生物碱,在HepG2细胞中进一步证实抑制GLUT1可增强癌细胞对索拉非尼的敏感性。分子对接结果表明,氢键和Pi-烷基键的形成是生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的关键因素。药效团模型结果提示疏水基团在生物碱抑制GLUT1功能中发挥关键作用。上述结果为指导生物碱化合物的结构改造,开发高效低毒的GLUT1抑制剂改善肿瘤治疗提供有价值的参考依据。

摘要译文

关键词: OAT3 ；黄酮类化合物；抑制作用；急性肾损伤；构效关系；葡萄糖转运体1 ；生物碱类化合物；抑制作用；分子机制；构效关系

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