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摘要： 设计并合成了一系列1,2,4-三唑-3-硫醚衍生物,目标化合物的化学结构经1H NMR、13C NMR、质谱和元素分析确证;采用单晶X射线衍射法测定了(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基-4H-1,2,4-三唑-3-丙硫醚(1c)的晶体结构.目标化合物体外神经氨酸酶(Neuraminidase,NA,H1N1)抑制活性测试结果表明,大部分化合物1具有较好的NA抑制活性,其中(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基-4H-1,2,4-三唑-3-乙硫醚(1b)和1c的NA抑制活性最佳,其IC50值分别为(6.86±2.08)和(9.1±1.56)μg/mL.
关键词: 1 ；2 ；4-三唑-3-硫醚衍生物 ；合成 ；晶体结构 ；神经氨酸酶抑制活性
被引量
5
摘要： 流感是一种影响人类生活的病毒性急性呼吸道传染病,抗流感药物的研究和生产备受关注,自1983年关键性的流感病毒神经氨酸酶(NA)晶体结构被确定,为抗流感药物的研究提供了有利条件,神经氨酸酶抑制剂的研究成为热点.磷酸奥斯他韦,又名达菲,属于环己烯衍生物结构(见图1)的神经氨酸酶抑制剂,环己烯环具有化学及酶的稳定性,具有3-戊氧基取代基的奥斯他韦有非常强的神经氨酸酶抑制活性[1],为口服型抗流感药物,可同时抑制甲型和乙型流感病毒,不易引起抗药性[2],……
被引量
1
【专利/发明】 • CN201910613148.5 •
+1位作者
•
申请日：2019-07-09,
公开日：2019-08-23
申请人： 湖南大学
公开（公告）号： CN110156704A
摘要： 本发明公开了结构式Ⅰ所示的1,2,4‑三唑硫醚衍生物及其药学上可接受的盐，晶体结构、及药物组合物以及其在制备流感病毒神经氨酸酶抑制剂中的应用：其中，R选自：氢、2‑OH、3‑OH、4‑OH、2,4‑(OH)2、2,3,4‑(OH)3、2‑COOH、4‑COOH、2‑OH‑3‑OCH3、3‑OH‑4‑OCH3或4‑OH‑3‑OCH3；R1选自：C1～C2烷基、C3～C5直链烷基或C3～C5支链烷基、苄基、4‑硝基苄基、4‑氰基苄基或羧甲基；Y选自：H、C1～C2烷基、C3～C7直链或C3～C7支链烷基；Z选自：H、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、氨基、甲氧基或羟基。
【专利/发明】 • CN201910613148.5 •
+1位作者
•
申请日：2019-07-09,
公开日：2023-06-09
申请人： 湖南大学
公开（公告）号： CN110156704B
摘要： 本发明公开了结构式Ⅰ所示的1,2,4‑三唑硫醚衍生物及其药学上可接受的盐，晶体结构、及药物组合物以及其在制备流感病毒神经氨酸酶抑制剂中的应用：其中，R选自：氢、2‑OH、3‑OH、4‑OH、2,4‑(OH)2、2,3,4‑(OH)3、2‑COOH、4‑COOH、2‑OH‑3‑OCH3、3‑OH‑4‑OCH3或4‑OH‑3‑OCH3；R1选自：C1～C2烷基、C3～C5直链烷基或C3～C5支链烷基、苄基、4‑硝基苄基、4‑氰基苄基或羧甲基；Y选自：H、C1～C2烷基、C3～C7直链或C3～C7支链烷基；Z选自：H、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、氨基、甲氧基或羟基。
摘要： 流行性感冒,其简称为流感(influenza或者flu),可直接影响人的呼吸道和免疫系统,严重时可危急人类生命并导致人类死亡。流感病毒的特点为:快速的传播速度、极强的传染性、迅速变异的能力、短暂的潜伏期、很强的致病性。神经氨酸酶(NA)通过裂解末端唾液酸残基与血凝素糖蛋白之间的糖苷键,对新产生的病毒粒子的释放起到重要的作用,神经氨酸酶抑制剂(NAIs)已成为抗击流感病毒的一种重要手段。目前,已有一批对甲型和乙型流感都有效的NAIs被开发出来,如扎那米韦、奥司他韦、兰那米韦和帕拉米韦。但是伴随NAIs在临床的广泛使用,针对不同抑制剂的耐药株被相继报道,尤其是对奥司他韦,因此研发新型、高效、抗耐药性的NA抑制剂是当前急需解决的问题。本课题组通过已报道的晶体结构分析了 N1神经氨酸酶与奥司他韦的结合方式,发现奥司他韦C-5位氨基在空间上与150-腔最接近,对该位点进行修饰,可以在该位点使用一些疏水性基团,使其占据150-腔,可提高化合物的抑酶活性、抗耐药性和选择性。本论文针对现有神经氨酸酶抑制剂的缺陷和本课题组前期的发现,在NA/NAI适配性研究和150-腔结构特征分析的基础上,同时运用生物电子等排和多位点结合等设计策略,设计合成了两个系列共42个奥司他韦衍生物:硫脲类奥司他韦衍生物(A系列)22个化合物和联苯取代的奥司他韦衍生物(B系列)20个化合物。本论文对合成的化合物进行了生物活性筛选。A1对H3N2(IC50=1.64 μM)与H1N1(IC50=2.08 μM)NAs均表现出中等强度的抑制活性。虽然细胞活性与OSC相比有较大差距,但也为新型奥司他韦衍生物的设计提供了宝贵经验。B系列化合物的整体活性较好,其中化合物B20对H1N1 NA(IC50=0.021 μM)表现出优于阳性对照OSC(IC50=0.024 μM)的抑制活性。该化合物对H5N1-H274Y耐药亚型(IC50=9.73 μM)也展现出了良好的抑制活性,与OSC(H5N1-H274Y,IC50=6.59 μM)相当。此外,化合物B20在细胞水平的抗流感病毒活性也与奥司他韦相近。总结:本论文通过靶向NA的150-腔设计合成了两系列C-5位氨基修饰的奥司他韦衍生物。B20,可将其作为先导化合物提供进一步的研究。通过对A系列和B系列化合物构效关系(QSAR)的进一步研究,为今后奥司他韦衍生物的发展提供了重要的指导。
关键词: 流感 ；神经氨酸酶 ；奥司他韦 ；150-腔
被引量
2
摘要： 流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,其多次在世界范围内的爆发流行,均对人类生命健康及社会经济造成严重危害及影响。流感病毒表面大量分布着两种重要的唾液酸结合蛋白:血凝素（Hemagglutinin,HA）与神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）。HA通过结合宿主细胞表面寡糖链末端唾液酸残基介导病毒感染前期与宿主的识别、粘附。NA能够水解糖链末端的唾液酸糖苷键,使子代病毒顺利释放,阻止子代病毒聚集。同时NA也具有裂解呼吸道粘膜表面唾液酸,加快病毒在呼吸道内的传播的作用。相比于HA的较易突变特性,NA的活性中心有一段序列高度保守的11个氨基酸,因此目前广泛使用的临床一线药物是以奥司他韦、扎那米韦及拉尼米韦等为代表的一系列NA抑制剂。此类药物在结构上是模拟NA水解唾液酸中间体过渡态,通过占据NA活性位点,竞争性抑制NA与唾液酸底物相结合,达到抑制流感病毒增殖的目的。但是,随着流感病毒不断变异,以奥司他韦为代表的上市药物逐渐出现了病毒耐药株,因此寻找结构新颖的新型流感病毒抑制剂迫在眉睫。本课题以流感病毒表面NA和HA的天然配体唾液酸结构为研究对象,结合上市药物的成功案例,在对药物活性位点、作用机制、构效关系进行综合分析的基础上,设计并通过20步化学反应合成了以氨基和胍基修饰唾液酸C-4位;C-2位引入硫原子用于抵抗NA对唾液酸糖苷键的水解作用,且末端修饰含叠氮的连接臂便于为后续多价修饰提供反应位点;氟原子修饰C-3位用于提高与NA活性位点亲和力的唾液酸衍生物,希望得到高效的NA抑制剂。在此基础上,依据“糖簇效应”原理,依次选用人血清白蛋白及多聚甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物作为骨架,通过无铜催化Click反应及酸酐氨解反应制备了新型多价蛋白缀合物及高分子马来酸酐聚合物。建立了核磁共振氢谱、基质辅助激光解析飞行时间质谱、分子排阻色谱等方法表征缀合物及高聚物表面偶联的寡糖数目及分子量的方法,后续的定量活性评价奠定了基础。使用神经氨酸酶抑制实验、细胞生长抑制实验、细胞病变实验在病毒及细胞水平全面评价了所合成化合物的抗流感活性。结果表明,C-4位胍基修饰及C-3位氟代均能够提高单体唾液酸的抗流感活性,并且多价修饰对活性的提升更加显著,体现在多价蛋白缀合物细胞水平活性较单体唾液酸衍生物提高45倍,高聚物神经氨酸酶抑制活性优于临床抗流感用药扎那米韦。更进一步的SPR实验、血凝抑制实验、动态光散射实验、病毒捕获实验表明多价蛋白缀合物及高聚物主要通过三重机制抑制流感病毒的复制与增殖:即与病毒表面的HA结合、干扰病毒与宿主的粘附;与NA结合,干扰子代病毒的释放;通过与HA和NA的结合作用,使病毒粒子聚集,干扰病毒前期粘附、内吞与后期释放。与此同时,借助糖簇效应,上述的多价蛋白缀合物及高聚物对于H274Y的耐奥司他韦突变NA蛋白的结合力也得到了明显的提高,其NA抑制活性IC50和蛋白结合常数KD均达到了亚微摩尔水平。上述结果为今后基于多价唾液酸衍生物的抗流感药物设计奠定了理论和实验基础。在综合以上C-3位单氟取代结构的基础上,又进一步合成了C-2、C-3位双氟取代的唾液酸衍生物。神经氨酸酶抑制实验表明,C-3位平伏键取代的氟原子,与NA具有更高的亲和力,并能够进一步提高唾液酸衍生物的NA抑制活性,其抑制活性较直立键氟原子取代衍生物有显著提高。基于此结果,又设计了C-3位氟原子取代,C-1位磷酸取代的唾液酸衍生物,并完成了关键中间体的合成。上述工作为基于唾液酸的神经氨酸酶抑制剂的设计提供了新的思路,丰富了唾液酸的改造策略,加深了唾液酸-神经氨酸酶结合的构效关系的认识,为今后设计并开发新型流感病毒抑制剂奠定了基础,扩展了制糖工程的学科外涵和内延。
关键词: 流感 ；抑制剂 ；神经氨酸酶 ；血凝素 ；唾液酸 ；多价
被引量
1
摘要： 神经氨酸酶（NA）在流感病毒的生命周期中发挥着重要作用,能够使唾液酸和糖蛋白之间的糖苷键水解,是现在设计抗流感药物的重要靶点。目前已上市的神经氨酸酶抑制剂包括扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦等,但随着新型流感病毒的潜在威胁和流感病毒耐药株的不断出现,抗流感药物的治疗效果有待提高。因此,开发出口服生物利用度高、耐药性好的抗流感药物具有重要意义。天然存在的唾液酸本身就是一种弱的神经氨酸酶抑制剂,早期研究发现,通过增加唾液酸C-5位功能基团的链长,唾液酸衍生物表现出了进一步提高的神经氨酸酶抑制活性。该研究结果表明C-5位乙酰氨基具有进一步改造修饰的空间。基于此,本课题拟通过对唾液酸C-5位进行基团衍生,引入多种不同类型的取代基,以筛选出能够与NA产生强力结合的取代基类型,为神经氨酸酶抑制剂的设计和合成提供重要信息。本文的具体研究内容和结果如下:（1）以乳糖为起始原料,通过6步化学反应,以45%的收率得到了还原端含有丙基叠氮的乳糖受体LacβPro N3;（2）以氨基甘露糖盐酸盐为给体,LacβPro N3为受体,利用表达纯化重组大肠杆菌来源的醛缩酶（Pm Aldolase）、CMP-唾液酸合成酶（Nm CSS）和多杀性巴氏杆菌来源的唾液酸转移酶Pm ST1三种酶,经过“一釜三酶”反应,以73%的收率获得了氨基唾液酸乳糖糖苷;（3）以氨基唾液酸乳糖糖苷为原料,采用不同缩合条件进行缩合反应以及氨解反应合成14个唾液酸乳糖糖苷衍生物;（4）利用表面等离子共振技术（SPR）,对所合成的14个化合物进行筛选,确定出活性较优的化合物;（5）通过对筛选后得到的活性较好的化合物分子进行分子模拟对接,深入考察抑制剂结构与靶蛋白之间的相互作用。实验结果为:成功应用化学酶法高效合成了系列全新的唾液酸三糖糖苷,并且筛选出化合物12对神经氨酸酶H3N2具有较好的结合能力,KD值可达到95μM。这一实验结果的发现为抗流感病毒糖类药物的研制和开发提供了参考。
关键词: 化学酶法合成 ；神经氨酸酶抑制剂 ；唾液酸化 ；流感病毒
摘要： 流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性上呼吸道传染病,具有高致病率和高致死率的特点,严重威胁人类的健康和生命。全球每年因季节性流感造成的严重病例高达300-500万,死亡人数达25-50万人。因此,对流感的预防与治疗已成为世界公共卫生领域非常紧迫的任务。鉴于神经氨酸酶(NA)在流感病毒生命周期中的关键作用,已成为目前抗流感病毒药物设计的重要靶点。迄今为止,已经有四种神经氨酸酶抑制剂(NAI)上市,分别是扎那米韦、奥司他韦、帕拉米韦和拉尼娜米韦。但是耐药性毒株的广泛出现和给药不便等问题使目前的抗流感形势依旧严峻,因此开发新型、高效、抗耐药的NA抑制剂仍具有重要意义。最新研究发现:邻近NA活性口袋的Arg430-Thr439等氨基酸形成的430-环具有较高的柔韧性,以致于形成了一个体积很大的空腔,被命名为430-腔,它直接与活性中心相连,可以作为附加的NAI的结合区域。同时,通过对NAI/NA的三维晶体复合物的分析,我们还发现奥司他韦的C-1位羧基正朝向NA的430-腔,可作为靶向于430-腔的修饰位点。本论文基于以上发现,运用基于靶标结构的“多位点结合”的药物设计策略,以奥司他韦为先导化合物,在其C-1位羧基上进行修饰,使其侧链伸入430-腔,通过最大程度的占据该受体口袋,以有效提高配体与靶点的结合力,提高化合物的抗病毒活性;同时使侧链与430-腔内关键(保守)氨基酸形成“附加”作用力,以弥补其它位点氨基酸突变造成的结合力缺失,从而提高化合物的抗耐药性。本论文设计合成了三系列共38个靶向于430-腔的奥司他韦衍生物,并通过生物活性测定,评价了它们的抗流感活性。本论文具体包括以下三部分内容:第一部分:通过文献调研我们发现430-腔中含有较多疏水性氨基酸残基,于是我们将脂肪胺和芳香胺等多种含有疏水性基团的取代胺基通过酰化反应引入奥司他韦的C-1位侧链,使侧链伸入430-腔,与其中的疏水性氨基酸形成输水性作用,进而增强两者的结合能力。最终设计合成了 21个目标化合物。体外抑酶活性实验显示,该系列衍生物大部分对H5N1和H5N6亚型具有的抑酶活性,其中活性最好的是C-1位侧链上含有联苯基团的化合物A-17(H5N1:IC50=0.96 μM;H5N6:IC5=0.99μM)。通过分子对接研究发现,正是因为联苯基团增加了侧链的长度,使侧链末端的苯环可以深入430-腔内部,在更大程度上占据了 430-腔,从而展现出优于该系列其它化合物的NA抑制活性。第二部分:在第一部分工作的基础上,我们以增加侧链长度和增强连接片段与430-腔的相互作用为出发点,通过Clcik反应将药物化学领域的明星片段1,2,3-三氮唑基团引入奥司他韦C-1位侧链。以该基团作为连接片段,可以使侧链增加5 A的长度,使侧链触及430-腔深处,占据空腔内更大的空间,此外1,2,3-三氮唑基团自身既是氢键供体又是氢键受体可以与430-腔开口处的精氨酸形成A系列中苯环无法形成的氢键作用,进一步增加化合物与活性中心的结合作用。基于此我们设计合成了 11个目标化合物。体外抑酶活性实验显示,本系列奥司他韦衍生物大部分对H5N1和H5N6都具有较好的抑酶活性,特别是目标化合物B-5的活性(H5N1:IC50=0.24μM;H5N6:IC50=0.18μM)明显优于第一系列化合物,这一发现印证了将三氮唑基团引入神经氨酸酶抑制剂的修饰是一种极具前景的策略,但是该系列化合物的活性依旧不如先导化合物OSC(Oseltamivir carboxylate),且对耐药株H5N1-H274Y的NA抑制活性也远低于OSC。第三部分:本论文中前两部分设计合成的化合物失去了与活性中心正电性区域三个精氨酸的氢键作用,这是化合物活性降低的关键原因。为克服此问题,该部分研究选择在C-1位侧链上引入不同的氨基酸,通过氨基酸上的羧基保持与原位点的氢键作用,同时氨基酸分子的其他部位则可以探入430-腔中与其内部氨基酸形成额外作用。根据该思路我们设计合成了 6个目标化合物,体外抑酶活性实验显示,本系列衍生物对H5N1和H5N6都具有较好的抑酶活性,其中活性最高的化合物 C-2 的抑酶活性(H5N1:IC50=0.088 μM;H5N6:IC50=0.096 μM)和细胞活性(H5N1:EC50=4.26μM;H5N6:EC50=1.31μM)与 OSC 相当,对耐药株H5N1-H274Y的抑酶活性也与OSC接近。在鸡胚抗流感病毒模型中,化合物C-2在10 mml/L的浓度下对H5N6毒株展现了比OSC更强的抗流感病毒活性。总结:本论文根据NA/NAI的三维晶体复合物的分析,以最新发现的与NA活性中心直接相连的430-腔为辅助结合位点,按照基于靶标结构的“多位点结合”药物设计策略,设计合成了三个系列38个化合物,这些化合物分层次地对430-腔的适配性进行了探索,并在之前工作的基础上不断进行优化,最终得到了和先导化合物活性相当的化合物C-2,该化合物在鸡胚模型中对H5N6毒株展现了优于先导化合物OSC的抗流感病毒活性。同时,本论文对430-腔化学空间的探索为新一代NAI的研发提供了重要信息。
关键词: 流感病毒 ；神经氨酸酶抑制剂 ；多位点结合 ；430-腔 ；奥司他韦衍生物
摘要： 联苯类新木脂素是一类具有广泛生物活性的天然产物。其中和厚朴酚作为最受关注的联苯类新木脂素，其药理学研究已较为深入，但结构改造和构效关系仍有待进一步研究。以往对于联苯类新木脂素的研究局限于传统的联苯二酚型结构，近年才报道了 5-芳基苯并呋喃型的联苯类新木脂素。这种新型结构可能伴随着独特的生物活性，具有重要的研究价值。因此，本文拟对这两种联苯类新木脂素的结构修饰和生物活性进行研究。 5-芳基苯并呋喃新木脂素的天然含量极低，为促进其在各个领域的研究，有必要开发一条高效可行的合成路线。因此本文还对 5-芳基苯并呋喃新木脂素的半合成进行研究。具体研究内容和结果如下： （1）和厚朴酚的结构修饰 对和厚朴酚的苯环进行结构修饰，引入硝基、亚硝基、氨基、酰胺、叔丁基等基团，合成了9种和厚朴酚衍生物A1~A9;对和厚朴酚的烯丙基侧链进行结构修饰，合成了5种和厚朴酚衍生物A10~A14。对亚硝化反应进行了探讨，对已报道化合物A3的合成工艺进行了优化。对环氧化反应和水解反应条件进行了优化;对酚羟基的邻位效应进行了探讨。 （2）5-芳基苯并呋喃新木脂素的半合成 以和厚朴酚为原料，通过常压钯催化氧化环合和高压钯催化氧化环合两种方法，合成了天然5-芳基苯并呋喃新木脂素B1;通过酸催化环合反应合成了5-芳基苯并二氢呋喃新木脂素B2。以5-芳基苯并呋喃新木脂素B1为原料，通过催化加氢合成了5-芳基苯并二氢呋喃新木脂素B3。对合成的天然产物B1，以及新化合物B2和B3进行了结构表征;对构建苯并呋喃和苯并二氢呋喃的相关反应进行了探讨。 （3）5-芳基苯并呋喃新木脂素的结构修饰 对5-芳基苯并呋喃新木脂素的苯环进行结构修饰，包括对酚羟基邻位取代基的简单修饰制备了C1~C9，对酚羟基的醚化制备了C10和C11，以及合成了噁嗪酮衍生物C12、噁嗪二酮衍生物C13、噁唑衍生物C14、噁唑-2-醇衍生物C15、Schiff碱衍生物C16~C19、Mannich碱衍生物C20~C24、氨基乙酰胺衍生物C25~C30和5-芳基苯并二氢呋喃衍生物B4。对噁嗪酮的合成方法进行了工艺优化。 对5-芳基苯并呋喃新木脂素的烯丙基侧链进行结构修饰，包括对烯丙基的简单修饰制备了D1~D3;合成了5-芳基苯并呋喃新木脂素腙衍生物D4~D22和5-芳基苯并呋喃新木脂素肼衍生物D23~D26。对所有结构进行了表征;对Wacker氧化反应进行了探讨，并提出钯催化氧化环合与Wacker氧化反应的一锅法。 （4）抗肿瘤活性研究 评估了和厚朴酚、5-芳基苯并呋喃新木脂素及其衍生物的抗肿瘤活性。整体而言，和厚朴酚衍生物的抗肿瘤活性优于5-芳基苯并呋喃新木脂素衍生物。在和厚朴酚衍生物中，优选化合物A6和A9对K562细胞的增殖抑制活性优于和厚朴酚，对K562细胞的IC50分别为5.04μM和7.08μM，在抗肿瘤领域具有进一步研究价值。在5-芳基苯并呋喃新木脂素衍生物中，部分化合物的抗增殖活性优于天然产物B1，其中C20和D6的抗增殖活性较天然产物B1有了明显提升。对其抗肿瘤作用进行了深入研究，发现C20和D6可以诱导肿瘤细胞凋亡。进一步研究结果显示，C20通过调节caspase、Bax/Bcl-2和p53/p21途径诱导细胞凋亡。此外，结合文献报道的联苯类新木脂素衍生物，借助分子建模和量化计算，对构效关系进行了全面的分析。 （5）流感病毒神经氨酸酶抑制活性研究 评估了和厚朴酚、5-芳基苯并呋喃新木脂素及其衍生物对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用。其中和厚朴酚及其衍生物的NA抑制活性较差，而5-芳基苯并呋喃新木脂素衍生物D13~D16展现出较好的NA抑制活性。利用分子对接手段对药物-靶点的作用模式进行了分析，并对多酚类NA抑制剂的构效关系进行了讨论，发现酚羟基数目、分子大小以及酚羟基之间的距离对多酚类NA抑制剂的神经氨酸酶抑制活性有着重要影响。 （6）杀菌和杀虫活性研究 评估了5-芳基苯并呋喃新木脂素衍生物的杀菌和杀虫活性。部分衍生物的杀菌和杀虫活性优于天然产物B1。优选化合物C26在25μg/mL下对黄瓜灰霉病菌和油菜菌核病菌的抑制率分别为87.04%和85.77%，在500μg/mL下对粘虫的杀死率为100%，且细胞毒性低;化合物C27在0.5 mg/mL下对蚕豆蚜的杀死率为100%;这二种化合物具有进一步研究价值。
关键词: 联苯类新木脂素 ；5-芳基苯并呋喃 ；结构修饰 ；生物活性 ；和厚朴酚
摘要： 本文根据基于配体的合理药物设计原理,通过药效团、骨架跃迁和生物电子等排体原理引入具有多种药理活性的优势骨架腙和酰腙,设计合成了结构新颖的抑制流感病毒NA活性的147个化合物,测试了它们的NA抑制活性,讨论了它们的构效关系,利用分子对接模拟活性化合物与NA的相互作用模型,以期开发新型、高效和安全的抗流感病毒药物。（1）构建共同特征药效团模型及目标化合物设计对天然产物类NA抑制剂进行分析研究,发现它们的分子骨架由两个芳环体系和一个连接片段组成,构建了基于天然产物类NA抑制剂的共同特征药效团模型。共同特征药效团模型的主要特征为含有一个氢键供体和两个氢键受体。基于药效团模型和分子骨架的特点,通过骨架跃迁及生物电子等排体原理,以优势结构腙和酰腙替换连接片段,设计了具新颖分子骨架的芳香腙衍生物A、芳香酰腙衍生物B和芳香双腙衍生物C,并对氢键受体和供体进行修饰优化。（2）芳香腙衍生物及查耳酮衍生物的合成以甲酰胺、丙二酸二乙酯、2-氯-5-三氟甲基吡啶、2-氯-3-硝基吡啶、2-氯-5-硝基吡啶、3,6-二氯哒嗪和2,4-二硝基苯肼作为起始原料,设计了简单高效的合成路线,以良好的合成收率获得了2,4-二硝基苯芳香腙衍生物A1A5、吡啶芳香腙衍生物A6A22、哒嗪芳香腙衍生物A23A29、嘧啶芳香腙衍生物A30A51、嘧啶双腙衍生物A52A57及查耳酮衍生物Y1和Y2。并优化了中间体4,6-二氯嘧啶、4-氯-6-氨基嘧啶和3-氯-6-羟基哒嗪的合成方法。（3）芳香酰腙衍生物的合成采用简单高效的合成路线,以苯甲酸衍生物或苯甲酸甲酯衍生物作为起始原料,经酯化反应后与水合肼反应获得相应的中间体,再经脱水缩合反应,以良好的合成收率制备了芳香酰腙衍生物B1B57。（4）芳香双酰腙衍生物的合成以对苯二甲酸二甲酯、间苯二甲酸二甲酯、吡啶-3,5-二甲酸二乙酯、碳酸二甲酯、草酸二乙酯和丙二酸二乙酯作为起始原料,通过简单高效的合成路线,以良好的合成收率获得了相应的对苯二甲二酰腙衍生物C1C4、间苯二甲二酰腙衍生物C5C20、3,5-吡啶二甲酸二酰腙衍生物C21C24、碳酰二腙衍生物C25C28和草酰二腙及丙二酰腙衍生物C29C33。（5）神经氨酸酶抑制活性及构效关系对设计合成的147个目标化合物进行流感病毒NA抑制活性测试和构效关系研究,以期发现具有更强NA抑制活性的先导化合物。测试结果表明,57个芳香腙衍生物A中有11个化合物的NA抑制活性优于查耳酮衍生物Y2,4个化合物对NA的抑制活性为良好级别,达到中等及以上级别的化合物占49%,其中化合物A52表现出最强的体外NA抑制活性(IC50=24.20±3.30μmol/L);57个芳香酰腙衍生物B中有18个化合物的NA抑制活性优于查耳酮衍生物Y2,10个化合物对NA的抑制活性为良好级别,60%化合物为中等及以上级别,其中化合物B29和B31显示最强的NA抑制活性,IC50值分别为23.37±0.78和23.89±4.33μmol/L;33个芳香双酰腙衍生物C中有27个化合物的NA抑制活性优于查耳酮衍生物Y2,23个化合物对NA的抑制活性为良好级别,94%化合物为中等及以上级别,其中化合物C4、C19和C29显示较强的NA抑制活性,其IC50值分别为20.72±2.00、20.78±2.98和20.81±3.00μmol/L。Lipinski五规则和化学信息学属性分析结果表明部分合成的目标化合物可能是潜在的口服活性候选药物。分子对接研究表明化合物A52、B29和C4显示良好的结合构象与NA活性位点相互作用,结合能分别为-7.49、-5.84和-9.09 kcal/mol。构效关系分析表明,芳香双酰腙分子骨架优于芳香腙和芳香酰腙分子骨架,且3,5-吡啶二甲酸二酰腙结构为最优秀的芳香双酰腙类分子骨架。此外,在分子骨架上引入可同时作为氢键供体和氢键受体的活性药效团有助于NA抑制活性的提高。
关键词: (酰)腙 ；合成 ；神经氨酸酶抑制活性 ；构效关系 ；分子对接
摘要： 由流感病毒感染引起的流感每年可导致约50万人死亡,而近年来动物源性流感病毒特别是禽流感病毒跨越物种屏障感染人类的病例不断出现,更是加大了流感防控的难度。此外,流感可与新冠共存,两者合并感染的重症及死亡风险大增。因此,流感的防治依然是当前及未来医药卫生领域重点关注的课题。尽管目前已有多种抗流感药物获批上市,但是它们的广泛临床应用却面临着诸多限制,其中最严重的是耐药性问题。由于流感病毒固有的高变异性,具有耐药属性的突变毒株会在药物进入临床使用后快速出现并严重削弱药物的疗效,例如对金刚烷胺耐药的M2-S31N突变毒株、对奥司他韦耐药的NA-H274Y突变毒株和对巴洛沙韦耐药的PA-I38T突变毒株。因此,优化、改进现有药物和研发高效、抗耐药的新型药物对流感的防治具有十分重要的现实意义。流感病毒是一种RNA病毒,可以编码至少12种功能蛋白,这些蛋白发挥各自的生物调节功能维持着流感病毒生命周期的有序进行,而通过抑制这些蛋白的生物学功能来阻断病毒生命周期的正常进行是小分子抗流感药物研发的基础。基于此,本论文分别针对流感病毒神经氨酸酶的新结合位点150-腔和新颖靶标聚合酶PA-PB1相互作用进行基于靶标结构的药物设计,最终得到了 3类共计71个目标化合物,并对它们进行了抗流感病毒活性评价和初步成药性评价。此外,本论文还运用基于细胞的表型筛选技术对实验室自有(in-house)化合物库中近百个具有抗流感优势结构的小分子进行了活性筛选和作用机制探讨。1.靶向神经氨酸酶150-腔的抗流感病毒候选药物的发现NA(Neuraminidase)在流感病毒复制的末期发挥着关键作用。本部分基于NA-奥司他韦晶体复合物结构解析及课题组前期获得的构效关系,以奥司他韦的C-5位氨基为修饰位点,对Group-1 NA中新发现的150-腔的内部亚结构区域进行了系统的探索。首先,运用多位点结合策略和骨架跃迁策略对课题组前期发现的14和16的侧链进行了靶向于150-腔开口区域或/和底部区域的修饰,得到了21个含稠环结构的目标化合物;随后通过分析150-腔内部的空间结构及其与奥司他韦C-5位侧链的位置关系,运用多样性取代修饰策略围绕着化合物14的侧链进行了精细的结构修饰,最终得到了 29个含有联苯结构的奥司他韦衍生物。生物活性评价显示,第一类化合物中的ⅠD-3d和第二类化合物中的ⅡB-4b和ⅡB-4e表现出极强的NA抑制活性和抗流感病毒活性。ⅠD-3d(IC50=0.27-0.73 nM)对H1N1-NA、H5N1-NA和H5N8-NA的抑酶活性较奥司他韦的活性形式OSC提高了 14-53 倍,ⅡB-4b(IC50=0.12-0.91 nM)和 ⅡB-4e(IC50=0.50-1.33 nM)对这三种亚型NA的抑酶活性较OSC分别提高了 38-86倍和10-69倍。ⅡB-4b和ⅡB-4e还能够强烈抑制最常见的两种奥司他韦耐药突变H274Y-NA,ⅡB-4b对它们的抑酶活性较OSC分别提高了 34倍和39倍,ⅡB-4e对这两个耐药突变亚型的抑酶活性较OSC也分别提高了 8倍和51倍。此外,化合物ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e在细胞水平对人流感H1N1毒株和禽流感H5N1、H5N8毒株的抑制活性也明显超越了阳性药物OSC,且CC50值大于250 μM。成药性评价显示:这三个化合物具有良好的人肝微粒体代谢稳定性和较低的CYP酶抑制活性;大鼠体内药代动力学研究显示ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e的口服生物利用度分别为13.7%、11.8%和3.9%,优于或与OSC相当;安全性评价显示,小鼠对这三个化合物的耐受性良好,LD50均大于1000mg/kg。在动物感染模型中ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e同样展现出强大的抗流感病毒效力,极大地提高了实验动物的生存率。总之,ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e是极具临床应用前景的NA抑制剂,可作为抗流感候选药物供进一步开发。2.以聚合酶PA-PB1相互作用为靶标的小分子抑制剂的发现RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)是由PA、PB1和PB2亚基组成的异源三聚体,干扰这三个亚基之间的相互作用可以有效破坏RdRp的活性,抑制病毒的增殖。与传统的以RdRp中单体亚基PA、PB1或PB2为靶标的药物发现策略不同,本研究聚焦于蛋白-蛋白相互作用这一药物靶标新理念,开展了以PA-PB1相互作用为靶标的药物设计。通过文献调研,我们选取与PA-PB1作用界面结合能力最强的2-氨基-3-甲酰胺基-环庚烷并噻吩片段(cHTC)为核心结构,在其3位甲酰胺基侧链引入已发现的适配性最强的2-吡啶基团,同时对其2位氨基侧链进行改造,以期在最大程度上占据蛋白-蛋白相互作用的疏水性界面并满足相应药效团模型的要求,由此得到了 2 1个结构新颖的cHTC衍生物。靶标活性测试显示,该系列中13个化合物对PA-PB1相互作用表现出抑制作用,其中活性最好的化合物Ⅲ-6a和Ⅲ-6q的IC50值分别为75μM和85μM。化合物Ⅲ-6a和Ⅲ-6q还展现出广谱的抗流感病毒活性(EC50=14.6-69.8μM),虽然它们的活性与OSC还存在一定差距,但已接近同类型抑制剂(含有cHTC结构)中活性最强化合物40的水平。此外,该类化合物的细胞毒性极低,且在鸡胚模型中展现出了明确的抗流感病毒活性。总之,本研究为研发新型、广谱的抗流感药物提供了新的可能性。3.基于表型筛选的新型抗流感先导化合物的发现表型筛选是快速发现具有特定药理活性的新型小分子的有效途径,而基于细胞表型分析的药物筛选由于其高效、便捷、直观等特点更是受到了广泛的关注。本部分研究对in-house化合物库中极具抗流感病毒潜力的二芳基嘧啶(DAPY)衍生物和查尔酮衍生物进行了抗流感表型筛选,最终发现了具有良好的、广谱的抗流感病毒活性的DAPY衍生物A4和查尔酮衍生物B23。作用机制研究显示,A4可以通过促进NP的非功能性聚集和阻断NP的核输入过程来抑制病毒的复制,而B23则可以通过抑制NP的核输出过程来发挥抗流感病毒作用。初步成药性评价显示A4和B23具有良好的人血浆稳定性,对主要CYP酶无明显抑制作用,且在1000 mg/kg剂量下对小鼠无急性毒性。总之,鉴于A4和B23良好的抗流感病毒活性和成药潜力,以及与上市药物完全不同的结构骨架和新颖作用机制,可以作为新型抗流感先导化合物供后续研究。综上所述,本论文以发现新型、高效、抗耐药的抗流感先导化合物及候选药物为目的,从基于经典靶标NA全新结合位点150-腔的药物设计和基于新颖靶标PA-PB1相互作用的药物设计出发,综合运用骨架跃迁、多样性取代修饰等药物化学策略,设计并合成了 3类共计71个目标化合物,经过靶标活性、细胞活性和成药性评价,最终发现了 3个(ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e)兼具极强抗流感病毒能力和良好成药性的NA抑制剂。此外,通过基于细胞的表型筛选技术发现了具有较强抗流感病毒活性的DAPY衍生物A4和查尔酮衍生物B23,作用机制研究显示它们可以通过抑制流感病毒NP的核转运过程来抑制病毒增殖。总之,本论文研究不仅发现了极具临床应用价值的抗流感候选药物,还发现了具有新骨架和新机制的抗流感先导化合物,为抗流感药物的研发奠定了坚实的物质基础并为新靶标新机制的药物研发提供了新的线索和方向。
关键词: 流感病毒 ；神经氨酸酶 ；PA-PB1相互作用 ；表型筛选 ；候选药物 ；先导化合物
被引量
1
摘要： 流感是一种可迅速传播的流行性疾病，随着当前已上市的几个抗流感药物的耐药性逐渐被发现，新型高效的药物亟待开发。本文以拼合原理为指导，将具有广泛药理活性的噻唑环与腙结合在一起，并引入取代芳环，设计并合成了噻唑腙衍生物，测试了它们的神经氨酸酶抑制活性，并对这些化合物进行量子化学计算及构效关系讨论。 以乙酰丙酮为原料，经NBS溴代得3-溴乙酰丙酮，再将氨基硫脲、取代苯甲醛和3-溴乙酰丙酮在乙醇回流条件下反应得13个苯甲醛（4-甲基-5-乙酰基-2-噻唑）腙类化合物（A1～A13）。采用相应的取代苯甲醛或苯乙酮与氨基硫脲反应得中间体2-（2-苄亚肼基）硫代甲酰胺，再将中间体与3-溴乙酰丙酮进行环合得10个苯甲醛/苯乙酮（4-甲基-5-乙酰基-2-噻唑）腙（A14～A19和B1～B4）。化合物A15芳环上硝基经铁粉还原得化学物A20;将化合物A20芳环上氨基经CDI（N,N-羰基二咪唑）与乙酸经酰胺化得化合物A21。所有化合物经1H NMR、13C NMR和MS等确证结构。 测试了25个噻唑腙类化合物的神经氨酸酶抑制活性。活性检测结果表明芳环上取代基为4-OH-3-OCH3、4-COOH和4-COOCH3具有较高的活性，其中化合物A12活性最好，在40μg/mL时，对神经氨酸酶的抑制率达93.33±0.69%，IC50为23.35±2.62μM。运用分子对接，进一步说明了化合物A12与神经氨酸酶可能的相互作用方式。 通过选取适当的量子化学计算参数，利用这些参数的差异将目标化合物与奥司他韦和奥司他韦酸进行对比，探讨影响目标化合物对神经氨酸酶抑制活性的主要因素。研究结果对于设计活性更好的新型神经氨酸酶抑制剂具有一定的参考价值。
关键词: 4-甲基-5-乙酰基-2-噻唑腙 ；噻唑腙衍生物 ；腙类化合物 ；神经氨酸酶 ；抑制活性
摘要： 流感病毒(Influenza virus,IFV)的爆发给人类的健康和生命造成了严重危害,时常出现的致病性禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)感染同样会给人类带来致命性威胁,给世界各国带来极大的恐慌。在流感病毒的生命周期中,神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)负责催化水解宿主细胞表面唾液酸与流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)之间的糖苷键,使成熟的病毒从被感染的细胞表面释放出来从而继续感染其它细胞。另外,NA裂解完子代病毒粒子的HA与宿主细胞之间连接的唾液酸残基后还要行使另外两种重要功能:①阻止子代病毒粒子从宿主细胞释放后发生凝聚;②裂解呼吸道黏膜中的唾液酸,从而阻止子代病毒颗粒灭活,加速流感病毒在呼吸道中的传播,因此,NA是抗流感病毒药物设计的理想靶点。环己烯类NA抑制剂(Neuraminidase inhibitors,NAIs)磷酸奥司他韦具有高效、低毒、生物利用度高的优点,是目前唯一的口服NAI。但是由于流感病毒固有的高变异性,快速出现的耐药株(如N1-H274Y和N2-E119V突变株)严重削弱了该药物的防治作用。目前,抗流感病毒药物在临床使用中面临的最大障碍是耐药性问题,因此,研发新型、高效和抗耐药性NAIs已成为抗流感病毒领域的主要方向之一。从NAs的进化关系上看,可分成几个不同的组:group-1 NAs,其中包含N1、N4、N5和N8亚型,group-2 NAs,其中包含N2、N3、N6、N7和N9亚型。N10和N11亚型被认为是NA样蛋白,这是由于它们缺乏正常唾液酸酶活性,从而形成一个独特的组,可以暂时命名为第三组(group-3)。NAs的X射线晶体学研究表明,在group-1 NAs中,催化中心附近存在开放的150-loop和150-cavity,催化中心通过150-loop与150-cavity连通,而在group-2 NAs中150-loop和150-cavity始终是闭合的。尽管H1Nlpdm09NA(09N1)属于group-1 NAs,但晶体结构研究显示它的150-loop是闭合的,它也不具有开放的150-cavity。该研究表明晶体状态下09N1的150-loop不同于group-1 NAs,而与group-2 NAs相似。但是,最近研究表明,09N1和group-2 NAs的150-loop和150-cavity在一定条件下也可以呈开放状态。此外,与NA催化中心紧邻的还有一个430-loop,催化中心通过它与430-cavity连通。晶体学结构显示430-loop与150-loop相邻,从构成二者的氨基酸残基上看,二者有一定程度的重叠,这就直接导致两个loop之间存在构象或功能的相互影响。由于靠近催化中心而使150-cavity和430-cavity对开发新的抗流感病毒药物具有十分重要的作用。因此,深入理解催化中心、150-loop和430-loop的关系,可以为设计新型、同时靶向两个或三个位点的抗流感病毒药物提供新策略。本论文针对现有神经氨酸酶抑制剂的不足,通过对奥司他韦与神经氨酸酶NAs复合物结构生物学信息的分析,运用多位点结合策略,对奥司他韦进行基于靶标结构和多样性导向的结构优化,从而发现新型高活性尤其是在抗耐药性方面有所突破的抗流感病毒候选药物。研究工作分为以下几方面:靶向于神经氨酸酶催化中心和150-cavity的双位点结合型奥司他韦衍生物的设计、合成与活性研究。本部分以课题组前期发现的N1选择性抑制剂和其它报道的N2选择性抑制剂为先导化合物,以NAs的催化中心和150-cavity为药物设计的靶点,运用多位点结合思路设计并合成了 11个新型的奥司他韦衍生物。在抑酶活性实验中,I-3b和I-3c强烈抑制group-1和-2 NAs,对09N1、N2、N6和N9亚型的抑制活性分别是奥司他韦羧酸(OSC)的6.8-12.5倍和1.2-3.9倍。它们对N1-H274Y和N2-E119V的抑制活性也优于OSC,并且抑制B型流感病毒NA的能力与OSC相当;在细胞水平的抗病毒活性实验中,它们抑制H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性优于OSC。此外,I-3b抑制H1N1和H3N2株的活性也与OSC相当。I-3b在体内(鸡胚)中的抗禽流感病毒(H5N2)活性也优于OSC。同时,I-3b显示出较高的代谢稳定性和较低的体内外毒性。分子动力学研究阐明了I-3b对group-1和-2 NAs具有强效抑制活性的原因。总之,该研究首次以新合成的活性化合物验证了 09N1和group-2 NAs的150-1oop和150-cavity可以被诱导打开的猜想,发现了一个具有研究前景的候选药物I-3b,为进一步通过靶向催化中心和150-cavity来发现高效、高选择性和抗耐药性的NAIs提供了重要思路。特异性抑制group-1 NAs和N1-H274Y耐药株的奥司他韦衍生物的发现。在上一部分研究的基础上,为进一步探讨150-cavity作为结构修饰位点的化学空间及发现具有高效抗耐药性的新型奥司他韦衍生物,本部分继续以奥司他韦为母核结构,同时参考早期发现的化合物58和59的特征,运用基于生物电子等排、分子杂合等策略设计并合成了五小类共25个靶向NAs的催化中心和150-cavity的N-取代奥司他韦衍生物,并测试了其在细胞水平的抗病毒活性和抑酶活性。结果发现,化合物Ⅱ-15h在细胞水平抑制H1N1、H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性优于OSC或与之相当。此外,在抑酶活性实验中,Ⅱ-15h对N1、N8和N1-H274Y的抑制活性是OSC的5-86倍。特别地,Ⅱ-15h能够强烈抑制09N1亚型,该发现再次证实09N1的150-1oop更倾向于以开放的形式存在。在体内(鸡胚)抗禽流感病毒活性评价中,Ⅱ-15h抗H5N2的活性优于OSC。分子动力学模拟为Ⅱ-15h对group-1和N1-H274Y突变型NAs的强抑制活性提供了合理的解释。此外,Ⅱ-15h具有较低的体内急性毒性和较高的代谢稳定性,尽管其口服生物利用度有待提高,但仍不失为具有进一步研究潜力的先导化合物。其它取代类型的双位点结合型奥司他韦衍生物的设计、合成与活性研究。在第二章和第三章化合物结构的基础上,本部分运用多位点结合策略,设计并合成了包含多样性取代基类型的双位点结合型奥司他韦衍生物,取代基涵盖取代苄基、取代或未取代的芳杂环、取代或未取代的苯丙烯基、酰基和磺酰基等。细胞水平的活性测试表明,化合物的C-5位氨基取代基上如含有较强吸电子基团,对活性不利;C-5位取代基含有酰胺和磺酰胺基团的衍生物抗禽流感病毒活性很低;与之形成对比的是,如含有狭长共轭结构的苯丙烯基则可能有利于与150-cavity结合,从而表现出较强的抗group-1 NAs亚型禽流感病毒活性和抑酶活性,甚至达到与OSC相当的水平。此外,大部分含有C-5位氨基联芳杂环的OSC衍生物选择性抑制禽流感病毒及其对应的group-1 NAs,甚至达到了与OSC相当的水平。总体来看,本章活性化合物的抑酶活性与细胞水平的抗禽流感病毒的活性趋势基本一致,并得到分子模拟的验证。“三位点结合型”奥司他韦衍生物的设计、合成与活性研究。本部分根据上述双位点结合型神经氨酸酶抑制剂的成功经验,依据神经氨酸酶的结构特征与430-cavity的适配性要求,采用分子杂合等药物设计策略,在奥司他韦的C-1位羧基和C-5位氨基位点同时进行修饰,设计合成了一系列(20个)同时靶向催化中心、150-cavity和43 0-cavity的“三位点结合型”奥司他韦衍生物。通过抑酶活性测试发现,此系列化合物,如IV-9e,对禽流感病毒NAs的抑制能力显著下降,而在本章中作为对比的双位点结合型化合物IV-1le抑制野生型N1和突变型N1-H274Y的活性分别是OSC的1.5和1.8倍;IV-lle在细胞水平上的抗H5N1活性也优于OSC,且体内外毒性较低。总之,尽管本研究未发现活性突出的三位点结合型NAIs,但获得的构效关系为新一轮设计多位点结合型神经氨酸酶抑制剂提供了参考。综上所述,本论文针对现有流感病毒神经氨酸酶抑制剂的耐药性问题,在对奥司他韦与靶标结合模式分析的基础上,充分利用NAs催化中心、150-cavity和430-cavity的结构特征、与配体结合的适配性要求以及group-1和-2神经氨酸酶的结构差异性,运用多位点结合、片段杂合等策略,保持奥司他韦母核不变,分别在其C-1位羧基和(或)C-5位氨基进行多样性的修饰,设计合成了五类双位点结合型和一类三位点结合型奥司他韦衍生物。通过抑酶活性、细胞水平及动物(鸡胚)水平的抗病毒活性评价,发现多个具有高活性、高选择性、抗耐药的先导化合物。特别是,化合物I-3b在细胞水平抑制H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性及在体内(鸡胚)抑制抗禽流感病毒(H5N2)的活性均优于奥司他韦;II-15h在细胞水平抑制H1N1、H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性优于奥司他韦或与之相当,抑制N1、N8和N1-H274Y酶活的能力是OSC的5-86倍;在进一步的初步成药性评价中,发现I-3b和II-15h均具有较高的代谢稳定性和较低的体内外毒性,是具有广阔开发前景的候选药物。此外,本研究还首次通过小分子化合物验证了 09N1和group-2 NAs的150-loop和150-cavity可以诱导打开的猜想,为以后基于靶标结构发现高活性、高选择性和抗耐药性的神经氨酸酶抑制剂奠定了坚实的基础。
关键词: 流感病毒神经氨酸酶 ；奥司他韦 ；药物设计 ；多位点结合 ；150-cavity ；430-cavity ；成药性评价
被引量
5
摘要： 甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是一种能引起人严重呼吸道疾病的病原微生物,对人类的健康和经济发展有着严重的影响。目前临床上应用的抗流感药物包括M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂,然而随着耐药毒株的出现和多例不良的临床副反应,两类药物逐渐失去其临床价值。核酸内切酶（Polymerase acidic protein N-termination,PAN）作为新一代广谱抗流感药物研发的重要靶标,在病毒生命周期发挥着重要的作用。最近研究表明,抑制PAN活性可有效抑制病毒基因组的转录,进而抑制流感病毒的增殖,是目前研发新型广谱抗病毒药物的新靶标。大量晶体学和生物化学的研究表明,PAN催化活性中心含有双核金属Mn2+活性位点,结合结构中的Mn2+可有效抑制该酶的活性。此外,PAN存在着多个活性空腔,结合多位点的抑制剂可有效增强抑制剂与PAN的亲和力。因此,本论文选择具有较大前景的多酚类化合物作为先导化合物,综合运用经典药物化学策略,结构生物学信息,计算机辅助药物设计优化先导化合物,研发新型高活性的多位点抗IAV药物。研究工作分为以下两方面:1)基于PAN的空间结构以及多酚药效团的构成要素（支架/金属螯合区、疏水作用区及氢键作用区）,根据分子杂合,生物电子等排原理和构象限制的药物设计策略,分别构建3,4-二羟基苯乙胺类和3,4-二羟基四氢异喹啉类衍生物。通过抗病毒活性测试,Ia-7和IIa-2具有良好的H1N1毒株抑制活性(Ia-7 EC50=2.46μM和IIa-2 EC50=2.58μM),抑制活性优于Peramivir(EC50=2.58μM)。但对比Ia-7,IIa-2具有微弱的细胞毒性(CC50=150.85μM),通过在C3位修饰羧基甲酯可显著降低细胞毒性。在分子水平,Ia-7和IIa-2具有良好PAN酶活抑制能力(Ia-7 EC50=312.36 n M和IIa-2 EC50=489.39 n M)。2)基于多位点结合设计策略,结合计算机辅助药物设计技术,对目前发现的多酚类Laudanosoline片段进行骨架衍生。在固定Laudanosoline构型的基础上,对Laudanosoline的C3位和N端进行疏水修饰,构建了新型的四氢罂粟碱结构骨架。通过抗病毒活性测试,IIIb-9具有良好的H1N1毒株抑制活性(EC50=0.38μM),强的酶活抑制能力(EC50=365.05 n M)和PAN亲和力（KD=56.02 n M）。对比前两系列化合物,III系列化合物具有一定的细胞毒性(IIIb-9 CC50=69.80μM)且LE值过低,具有进一步修饰的空间。此外,IIIb-9的生物机制验证了IIIb-9可有效增强细胞抗病毒感染能力并可能作用于病毒的翻译和装配过程,进而提升IIIb-9的抗病毒能力。本论文在初步探讨各类目标化合物的构效关系基础上,利用sybyl软件对活性化合物进行了Surflex-Dock和3D-QSAR研究,深化了构效关系,证明金属螯合区对位修饰疏水芳香性基团的重要性和构象限制对活性的不利影响,为进一步结构修饰提供了合理的指导。本研究总设计合成43个结构新颖的多酚类抗病毒化合物。经体外抗病毒活性筛选及部分良好目标化合物的酶活测试,发现了25个结构新颖且抗病毒活性优于Peramivir的有效化合物,为以后开发髙活性、高选择性和抗耐药性的PAN抑制剂奠定了坚实的基础。
关键词: 甲型流感病毒 ；计算机辅助药物设计 ；PAN抑制剂合成 ；多酚衍生物 ；构效关系
摘要： 流感是一种爆发频繁,致死率高,严重威胁人类健康的疾病。用于治疗流感的四种神经氨酸酶抑制剂均有耐药病株出现,开发新型的抗流感药物迫在眉睫。本课题选用具有广泛生物活性和多个取代位点的1,2,4-三唑硫酮环为母核,以4-((4-（二甲基氨基）苯基亚甲基)氨基)-5-（6-甲基吡啶-3-基）-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-硫酮（36f）为先导化合物,对其各个取代位点进行逐步优化,设计并合成了33个1,2,4-三唑硫酮（醚）亚胺衍生物,测试了它们的神经氨酸酶抑制活性,依据活性结果进行构效关系和分子对接研究。采用一步法或三步法制得关键中间体4-氨基-5-基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-硫酮（C1-C12）,收率为53.4%90.1%。化合物C1-C12与芳香醛经缩合反应制得（E）-4-芳基亚甲氨基-5-基-2,4-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-硫酮（A1-A28）,收率为55.2%89.0%。选用A类化合物中活性最佳的化合物A17与溴代物经硫烷基化反应合成（E）-4-（4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基）-3-乙基-4H-1,2,4-三唑-5-硫醚衍生物（B1-B5）,收率为48.2%78.7%,并对该类硫烷基化反应条件进行了工艺优化,筛选出最佳的反应条件为:化合物A17与溴丙烷,碳酸钾和乙醇的物质量比为1:2.0:0.6:70,反应时间为13.5 h。33个目标化合物经1H NMR、13C NMR确证结构,部分化合物经IR和MS进一步确证结构,化合物A17和化合物B2经单晶X-射线衍射测试确证了A类化合物为硫酮式结构,B类化合物为硫醚式结构,A,B类均为E式构型。33个化合物的神经氨酸酶抑制活性测试结果表明,A类化合物中活性最佳的为化合物A17和A20,其IC50值分别为14.97±0.70、14.68±0.49μg/mL,B类化合物中活性最佳的为化合物B1和B2,其IC50值分别为6.86±2.08、9.1±1.56μg/mL。经构效关系和分子对接研究,发现当苯环上取代基（R）为4-羟基-3-甲氧基,1,2,4-三唑环5位取代基（Y）为乙基或羟乙基,1,2,4-三唑环3位取代基（R1）为乙基时,表现出较好的NA抑制活性。本课题研究结果表明1,2,4-三唑硫酮（醚）类衍生物具有一定的NA抑制活性,化合物B1具有作为先导化合物进一步研究的价值。
关键词: 1,2,4-三唑硫酮(醚)亚胺类衍生物 ；合成 ；神经氨酸酶活性测试 ；神经氨酸酶抑制活性 ；构效关系 ；分子对接
摘要： 流行性感冒是由流感病毒引发的急性呼吸道传染病,春、秋季高发,具有传染性强、流行面广、潜伏期短并能够引起多种并发症等特点,每年都会造成20-50万人死亡,对儿童、老人等高危人群有较大威胁。近年来,流感病毒不断变异,人畜共患病的威胁不断增加,使得目前的抗流感形势日益严峻,给社会造成了极大恐慌。M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂等的广泛应用给流感的治疗带来了希望,但耐药病毒株的出现严重降低了现有药物的疗效。因此,开发新型、安全、高效和抗耐药性的流感病毒抑制剂已成为非常紧迫的任务。流感病毒的生命周期包括吸附、内吞、融合、复制、翻译、装配、出芽和释放。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)和血凝素(Hemagglutinin,HA)作为流感病毒表面两种关键的功能糖蛋白,在病毒整个生命周期中发挥了重要作用。随着结构生物学的蓬勃发展,多种NA和HA的晶体结构相继被解析,以这两个蛋白为靶点的多种抑制剂也陆续被报道,为本论文继续该靶点的药物研究奠定了基础。流感病毒HA抑制剂的设计、合成与活性评价。本章节参考阿比多尔与血凝素的晶体结构信息,针对阿比多尔存在的药理活性低,水溶性差的科学问题,运用分子杂合策略和生物电子等排等药物设计策略,对阿比多尔母环的C-4位、C-5和C-6位进行改造,同时向其C-2位侧链引入多样化酸性基团,以期与血凝素的Arg54产生相互作用,提高HA抑制活性,增加水溶性。基于此,我们设计合成了 31个目标化合物,并对所有化合物进行了抗流感病毒活性(H1N1和H3N2)测试,部分化合物进行了HA的相互作用研究。结果表明,大部分化合物活性较弱,其中A-1活性最强,抑制H3N2流感病毒的EC50为9.86μM,KD(解离常数)为1.7 μM,与阿比多尔相当。此外,A-1在不同pH条件下的水溶性达到了14.20-16.43 μg/mL,显著优于阿比多尔,有进一步研究的价值。分子对接研究显示,目标化合物A-1与目标Arg54形成了氢键作用,并与周围的氨基酸产生了附加作用力,但缺失了母环原来与Lys307和Gln311的氢键作用力,这可能是化合物活性不如阿比多尔的主要原因。总之,该系列化合物为后续血凝素抑制剂的设计提供了参考。流感病毒NA抑制剂的设计、合成与活性评价。本论文基于流感病毒NA催化中心和与之毗邻的150-腔,根据二者的结构特征与配体适配性要求,运用分子杂合的修饰策略,以扎那米韦为先导化合物进行结构优化,设计合成了 9个双位点结合型NAIs,以期解决扎那米韦生物利用度低的缺点并发现高特异性、高活性和抗耐药性的先导化合物。抑酶活性测试发现,大多数化合物表现出一定的NA抑制活性,其中活性最好的化合物为B-9,对H5N1和H5N6的抑酶活性IC50分别为0.25μM和1.69 μM,但仍与阳性药物差距较大。尽管如此,本部分的研究仍是有意义的探索,为发现活性更强、抗耐药性更好的扎那米韦衍生物积累了经验。综上,本论文第二章主要针对阿比多尔存在的药理活性低、水溶性差的科学问题,运用骨架拼接策略和生物电子等排策略,设计合成了一系列共31个目标化合物,并对其进行了各项生物活性测试以及水溶性测试,最终得到了和先导化合物活性相当的化合物A-1,为新一代HA抑制剂的研发提供了重要信息。本论文第三章以发现高特异性、高活性和抗耐药性的抑制剂为目标,以扎那米韦为先导,采用基于配体结构的修饰策略和优势片段拼接的设计策略,设计合成了 9个目标化合物。抑酶活性测试结果和构效关系分析为该类化合物的后续结构优化提供了参考。
关键词: 流感 ；血凝素 ；神经氨酸酶 ；先导化合物 ；药物设计
被引量
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摘要： 季节性流感病毒(Seasonal influenza virus)每年感染全球5%～15%的人口,导致约50万人死亡。近年来出现的高致病性禽流感病毒,如H5N1和H7N9,同样给人类造成致命威胁。此外,流感病毒与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)共感染也会大大增加重症比例与死亡风险。因此,流感的防治依然是不可小觑的公共卫生与健康问题。迄今为止,已有三类抗流感病毒药物批准上市,分别是M2离子通道阻滞剂、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抑制剂和核酸内切酶抑制剂。但随着各类药物的广泛应用,越来越严重的耐药性问题逐渐暴露出来。因此,研发新型、高效、抗耐药性或具有新骨架的抗流感病毒药物具有重要意义。神经氨酸酶和核酸内切酶分别在流感病毒的传播和mRNA转录过程中发挥重要作用。它们在A型和B型流感病毒中高度保守,是药物设计的理想靶标。本论文针对上市药物神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦存在的耐药性问题,一方面通过靶向神经氨酸酶的活性位点和150-cavity,采用多位点结合策略对奥司他韦C-5位氨基进行修饰,设计并合成了五个系列新型奥司他韦衍生物;另一方面通过靶向核酸内切酶,采用“优势骨架再定位”策略,设计并合成了一个系列具有新骨架的核酸内切酶抑制剂。一、新型含苄氧基苄基类奥司他韦衍生物的设计、合成与活性评价基于对奥司他韦羧酸(Oseltamivir carboxylic acid,OSC)与NA复合晶体结构的分析,发现 OSC 的 C-5 位氨基朝向由 Glu119、Leu134、Ile117、Va1116、Phe115、Ala138、Glu136、Arg156和Asp151等氨基酸残基构成的150-cavity。本章以OSC为先导化合物,根据150-cavity中氨基酸残基的分布特征及课题组前期对150-cavity探索所获的构效关系,综合运用多位点结合、生物电子等排等策略,保留靶向入口区域的苄基优势片段,通过在苄基对位引入结构多样性的取代基,充分探索150-cavity中间区域和底部区域的优势基团,设计并合成了系列I共39个新型含苄氧基苄基类奥司他韦衍生物。体外抑酶活性结果显示,除化合物I-21c、I-27c和I-28c外,其余化合物均为group-1 NAs选择性抑制剂,它们对野生型(H1N1和H5N1)和突变型(H5N1-H274Y)NAs表现出中等到优异的抑制活性。其中,I-5c对H1N1、H5N1和H5N1-H274Y NAs的抑制活性最为突出,其IC50值分别为0.3、0.09和0.3 μM,略弱于或优于OSC(H1N1,IC50=0.01 μM;H5N1,IC50=0.03 μM;H5N1-H274Y,IC50=1.6 μM)。体外抗病毒活性结果显示,I-5c 对 H1N1(EC50=0.07 μM)和 H5N1(EC50=1.0 μM)的抑制活性与 OSC(H1N1,EC50=0.06μM;H5N1,EC50=0.8 μM)相当,且无细胞毒性(CEFs,CC50>200μM;MDCK,CC50>250μM)。分子对接表明,I-5c具有与OSC相似的作用模式,新引入的4-(3-甲氧基苄氧基)苄基伸向150-cavity,其末端甲氧基与保守氨基酸残基Asp151形成新的氢键。此外,理化性质预测结果表明,Ⅰ-5c具有良好的类药性。总之,鉴于Ⅰ-5c的高效抗耐药性特征,可作为先导化合物供进一步优化。二、新型含硼酸类奥司他韦衍生物的设计、合成与活性评价化合物Ⅰ-5c与NA的作用模式表明,形成额外氢键作用可显著提升化合物的抗耐药性。本章第一节以Ⅰ-5c为先导化合物,采用生物电子等排策略将其末端甲氧基替换为含丰富氢键供受体的取代基,设计并合成了系列ⅡA共18个新型奥司他韦衍生物。基于系列ⅡA的活性结果,发现含4-(3-硼酸苄氧基)苄基取代的化合物ⅡA-2c的活性最佳,其末端硼酸可与N1-H274Y的150-cavity中Glnl36和Val149形成多重氢键。因此,为进一步提高其活性,本章第二节以ⅡA-2c为先导化合物,保留其末端硼酸取代的苯环,采用多样化导向的结构修饰和分子杂合策略分别对其连接linker和连接苯环进行系统的构效关系研究,设计并合成了系列ⅡB共35个新型含硼酸类奥司他韦衍生物。体外抑酶活性结果显示,系列ⅡA对野生型(H1N1、H5N1和H5N8)NAs具有中等到较弱的抑制活性。部分化合物(ⅡA-2c、ⅡA-3c、ⅡA-12c、ⅡA-14c和ⅡA-17c)对H5N1-H274Y NA表现出与OSC相当或更高的抑制活性,尤其是ⅡA-2c的抑制活性比OSC提高近4倍。在系列ⅡB中,对连接linker修饰的化合物抑酶活性急剧下降,而对连接苯环修饰的化合物表现出中等到强效的抑制活性。其中,ⅡB-26c～ⅡB-35c(IC50=0.007～32.6 μM)对野生型(H1N1、H5N1 和 H5N8)和突变型(H5N1-H274Y 和 H1N1-H274Y)NAs表现出相当于或优于OSC(IC50=0.06～55.2 μM)的抑制活性。值得一提的是,化合物ⅡB-27c对两种突变型NAs的抑制活性分别是OSC的78.9和3.5倍,ⅡB-33c 分别是 OSC 的 74.6 和1.6 倍。同时,ⅡB-27c(EC50=0.008～1.3 μM)和 ⅡB-33c(EC50=0.008～5.4 μM)对H5N1、H5N8和H1N1的抗病毒活性强于或相当于OSC(EC50=0.06～8.6 μM)。此外,ⅡB-27c和ⅡB-33c在H5N1和H5N8病毒感染的鸡胚模型中表现出与OSC相当或略高的鸡胚保护作用。初步成药性评价显示,ⅡB-27c和ⅡB-33c在人血浆和人肝微粒体中具有与OSC相当的稳定性;在大鼠体内药代动力学评价中,它们表现出中等的药代动力学性质。综上,本研究拓展了适配于NAs 150-cavity的结构类型,通过结构优化得到体外和体内活性优异的先导化合物ⅡB-27c和ⅡB-33c,值得进一步研究。三、新型含环烷烃类奥司他韦衍生物的设计、合成与活性评价本章在上一章研究的基础上,以课题组前期发现的联苯类奥司他韦衍生物JMC20I为先导化合物,为进一步提高其活性并改善其理化性质,进行了系统的结构修饰及构效关系探讨。首先,采用多位点结合、生物电子等排等策略,将JMC20I末端苯环替换为环烷烃或含环烷烃的稠环,通过提高化合物的Fsp3值来改善其理化性质,设计并合成了系列ⅢA共25个新型奥司他韦衍生物。基于系列ⅢA的NA抑制活性,以ⅢA-4c为先导化合物,保留其环戊烯优势片段,采用分子杂合策略,对连接苯环进行精细的结构修饰,通过占据150-cavity更多的化学空间来提高其活性,设计并合成了系列ⅢB共14个新型奥司他韦衍生物。在系列ⅢA化合物中,ⅢA-4c的抑酶活性最佳,对H1N1、H5N1、H5N8和H5N1-H275YNAs(IC50=0.4～4.1 μM)的抑制活性与 JMC20I(IC50=0.3～4.9 μM)相当。在系列ⅢB中,活性最好的化合物ⅢB-2c(IC50=0.03～0.3 μM)对野生型H1N1、H5N1和H5N8NAs的抑制活性相当于或优于OSC(IC50=0.05～0.07 μM)和JMC20I(IC50=0.3～0.7 μM)。尤其是,ⅢB-2c对突变型H5N1-H274Y和H1N1-H274YNAs的抑制活性分别是OSC的62.7和5.0倍,是JMC20I的7.7和4.4倍。在体外抗病毒实验中,ⅢB-2c(EC50=0.2～2.3 μM)对 H1N1、H5N1 和 H5N8 表现出与 OSC(EC50=0.06～12.3μM)相当或更高的抗病毒活性,且没有细胞毒性(CEFs,CC50>200 μM;MDCK,CC50>250μM)。此外,在H5N1和H5N8病毒感染的鸡胚模型中,ⅢB-2c具有优于OSC的鸡胚保护作用。分子对接阐明了 ⅢB-2c与NAs的结合模式并合理解释了构效关系。初步的成药性预测表明,ⅢB-2c具有比OSC更优的理化性质和ADMET性质。综上所述,ⅢB-2c是具有研究前景的先导化合物。四、新型吡啶并嘧啶酮类核酸内切酶抑制剂的设计、合成与活性评价唯一上市的核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦已报道了耐药突变株(PAI38T/M),其他结构类型的核酸内切酶抑制剂存在骨架种类少、透膜性差等问题。本章根据现有核酸内切酶抑制剂的药效团特征,基于核酸内切酶与HIV-1整合酶、HIV-1 RNase H和HCVNS5B聚合酶活性位点的序列同源性,采用“优势骨架再定位”策略,将课题组前期在HIV-1整合酶/RNase H双靶标抑制剂中证明的吡啶并嘧啶酮优势骨架作为核酸内切酶金属离子螯合骨架,同时采用分子杂合策略,引入巴洛沙韦衍生物中优势的疏水性片段,设计并合成了 19个吡啶并嘧啶酮类核酸内切酶抑制剂。细胞实验结果显示,所有目标化合物在CEFs中均无细胞毒性(CC50>200 μM)。体外抗病毒活性结果表明,在50 μM浓度下,化合物Ⅳ-5k、Ⅳ-5p和Ⅳ-5q对H5N1和H5N8病毒表现出与OSC和利巴韦林相当的抑制率,但弱于BXA。进一步测试它们的EC50 值发现,化合物 Ⅳ-5k(H5N1,EC50=17.2 μM;H5N8,EC50=31.6μM)对这两种病毒具有中等的抗病毒活性,与利巴韦林相当或弱于利巴韦林(H5N1,EC50=11.0 μM;H5N8,EC50=5.1μM)。令人意外的是,Ⅳ-5k(IC50=3.6 μM)在体外抑制PAN的活性优于BXA(IC50=10.5 μM)。分子对接显示,Ⅳ-5k与BXA具有相似的结合模式,分子中吡啶并嘧啶酮骨架螯合二价金属离子,4,4'-二甲氧基二苯胺延伸到两个疏水口袋,与设计理念相符。总之,Ⅳ-5k为具有新骨架的核酸内切酶抑制剂的进一步研发提供了结构基础。总体而言,本论文基于流感病毒对目前上市的抗流感病毒药物产生的日益严重的耐药性问题,针对神经氨酸酶和核酸内切酶开展了两方面的研究工作。在基于靶标结构的药物设计理念指导下,一方面综合运用多位点结合和生物电子等排策略,设计并合成了五个系列靶向活性位点和150-cavity的新型奥司他韦衍生物。经酶水平、细胞水平、鸡胚体内活性测试,以及人血浆和肝微粒体稳定性、大鼠药代动力学实验等,发现了3个分别含2-甲基-4-(3-硼酸苄氧基)苄基、2-氯-4-(3-硼酸苄氧基)苄基和3-氟-4-环戊烯苄基取代的奥司他韦衍生物,具有优异的抗耐药性和良好的理化性质。另一方面,通过“优势骨架再定位”和分子杂合策略,发现了一个系列具有全新结构的吡啶并嘧啶酮类核酸内切酶抑制剂,为后续抗流感药物研发奠定了基础。
关键词: 流感病毒 ；奥司他韦衍生物 ；150-cavity ；核酸内切酶 ；优势骨架
摘要： 海洋来源的丝状真菌（尤其是曲霉属和青霉属真菌）所产生的各种骨架类型的天然产物往往具有良好的生物活性。海藻及红树林来源真菌是海洋来源真菌的重要组成部分,也是天然产物研究的重要资源宝库。但是,随着研究的深入和已报道天然产物数量的增多,已知化合物的重复发现变得越来越频繁,新化合物的发现则变得越来越困难。鉴于许多微生物次级代谢产物的合成基因簇在常规培养条件下多是沉默的,近年来多种研究策略像共培养、表观遗传修饰和基因组发掘等被广泛应用于激活这些沉默代谢途径,也因此而发现、报道了若干新化合物。本论文以海藻和红树林来源的三株曲霉属真菌（阿拉巴马曲霉Aspergillus alabamensis EN-547、聚多曲霉A.sydowii EN-534和构巢曲霉A.nidulans MA-143）和两株青霉属真菌（梅花状青霉Penicillium herquei MA-370和桔青霉P.citrinum EN-535）为研究对象,采用改变培养基类型（MA-370和EN-547）、共培养（EN-534&EN-535）和添加诱导分子（MA-143）等策略来激活真菌的沉默代谢途径,从中共分离鉴定不同结构类型的化合物109个,其中新化合物29个（含1个新骨架化合物）,新天然产物2个,结构类型涵盖了吲哚二酮吗啉类、喹啉酮类、喹诺唑啉酮类、桔青霉素类、蒽醌类、氧杂蒽酮类、α-吡喃酮类、甾体类、甘油酯类等多种骨架。对获得的所有新化合物和部分已知化合物进行了抗细菌、抗农业病害真菌和神经氨酸酶抑制活性的评价。从梅花状青霉MA-370的发酵粗提物中分离鉴定了39个不同结构类型的化合物,其中新化合物22个,化合物HI 1为一个新骨架类型的非那烯衍生物,另外还有两个新的α-吡喃酮类化合物（HI 8和HI 9）被分离鉴定。首次对分离得到的非那烯类化合物进行了手性HPLC分析工作并对其异构化的机理进行了分析和讨论,完成了部分对映异构化合物的手性拆分工作并通过ECD计算确定了其绝对构型。从阿拉巴马曲霉EN-547的发酵粗提物中分离鉴定化合物21个,包括2个新的吲哚二酮吗啉类衍生物（AL 1和AL 2）、1个新的多羟基麦角甾酮类衍生物（AL 3）和1个新的生物碱类天然产物（AL 4）。对聚多曲霉EN-534和桔青霉EN-535进行了共培养研究,从其发酵粗提物中分离鉴定化合物33个,包括2个新的桔青霉素类衍生物（SC 1和SC 2）。从构巢曲霉MA-143的发酵粗提物中分离鉴定化合物16个,包括1个新的蒽醌类衍生物（ND 1）、1个新的氧杂蒽酮类衍生物（ND 2）和1个新的生物碱类天然产物（ND 3）。抗菌活性测试结果表明,化合物HI 2对受试细菌中的藤黄微球菌Micrococcus luteus,铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa,溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和副溶血性弧菌V.parahemolyticus有较好的抑制活性,部分活性与阳性对照氯霉素相当;化合物HI 3和HI 4对受试农业病害真菌中的小麦纹枯病菌Ceratobasidium cornigerum,苹果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和苹果腐烂病菌Valsa mali表现出一定的抑制活性,最小抑菌浓度（MIC值）变化范围为16-64μg/mL。化合物AL 1和AL 2对大肠埃希氏杆菌Escherichia coli,藤黄微球菌M.luteus,小麦纹枯病菌C.cornigerum,苹果炭疽病菌C.gloeosporioides,小麦赤霉病菌Fusahum graminearum,番茄枯萎病菌F.oxysporum和苹果腐烂病菌V.mali均表现出一定的抑制活性,MIC值变化范围为16-64μg/mL;化合物AL 1和AL 3对溶藻弧菌V.alginolyticus表现出一定的抑制活性,MIC值均为64μg/mL;化合物AL 2和AL 3对铜绿假单胞菌P.aeruginosa表现出一定的抑制活性,MIC值变化范围为32-64μg/m L。化合物SC 1和SC 2对鲇鱼爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri,铜绿假单胞菌P.aeruginosa,溶藻弧菌V.alginolyticus,小麦赤霉病菌F.graminearum,番茄枯萎病菌F.oxysporum和苹果腐烂病菌V.mali均表现出一定的抑制活性,MIC值变化范围为16-64μg/m L。化合物ND 1和ND4对大肠埃希氏杆菌E.coli,鲇鱼爱德华氏菌E.ictaluri,藤黄微球菌M.luteus,溶藻弧菌V.alginolyticus和副溶血性弧菌V.parahemolyticus均表现出一定的抑制活性,MIC值变化范围为1-32μg/mL,部分抑菌效果与阳性对照药物氯霉素相当;化合物ND 2对小麦赤霉病菌F.graminearum,番茄枯萎病菌F.oxysporum和苹果腐烂病菌V.mali均表现出一定的抑制活性,MIC值变化范围为8-64μg/m L。神经氨酸酶抑制活性测试结果表明,化合物SC 1-SC 5对神经氨酸酶均具有一定的抑制作用,以化合物SC 3的抑制活性最好,IC50值为12.9 nM。本论文的研究内容不仅证实了改变培养基类型、添加诱导分子和共培养等策略在微生物天然产物研究工作中的有效性,也丰富了海洋来源天然产物的化合物类型,为海洋药物的研发提供了物质基础和数据支撑。更多还原
关键词: 海藻 ；红树林 ；真菌 ；沉默代谢途径 ；共培养 ；诱导剂 ；次级代谢产物 ；生物活性评价
被引量
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摘要： 天然产物是药物先导化合物的重要来源,许多天然产物被研发、批准成为药物。据1981-2019年的统计数据表明约有65%的FDA批准上市的药物与天然产物相关。然而在经历了天然产物发现的黄金时期后,新天然产物的发现几率开始下降,重复发现率升高。为应对这些问题,本论文通过从深海极端环境中获取微生物资源,结合基因组及转录组等组学分析,深入挖掘菌株次级代谢潜力,获得了结构新颖且活性显著的天然产物。
本论文从南海冷泉及麦哲伦海山采集到的动物样品中分离得到内生真菌,并对其通过不同培养基进行筛选,采用高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)为检测、评估手段,最终选定菌株Curvularia verruculosa CS-129及Penicillium steckii AS-324为目标菌株,对其进行规模发酵。采用大米固体培养基静置发酵,后经乙酸乙酯处理得到粗提物,并对其粗提物进行分离纯化最终得到单体化合物。
从南海冷泉动物来源内生真菌C.verruculosa CS-129中共分离鉴定了20个单体化合物,其中8个为新化合物(CV1-CV8),2个为新天然产物(CV9-CV10),出新率约为50%,通过核磁共振、高分辨质谱、NOESY谱图、DP4+分析、ECD计算以及X射线单晶衍射等实验确定了新化合物的绝对构型。所分离获得的20个单体化合物中19个为细胞松弛素类化合物,1个为弯孢菌素类化合物。对所得化合物进行了抗肿瘤活性、血管紧张素转换酶抑制活性以及抗菌活性测试,发现化合物CV1具有较强的血管紧张素转化酶抑制活性,化合物CV6、CV13和CV16具有显著的细胞毒活性,大多数细胞松弛素类化合物对人类及水产病害细菌表现出较强的抑制活性。
从麦哲伦海山动物来源内生真菌P.steckii AS-324中分离得到34个单体化合物,均为聚酮类化合物,其中24个为新化合物(PS1-PS23和PS33),通过核磁共振、高分辨质谱、NOESY谱图、ECD计算以及X射线单晶衍射等实验确定了新化合物的结构。主要结构类型为tanzawaic acid类化合物及其衍生物,另外包括一个新的和一个已知的烯内酰胺类化合物。对所有化合物进行了抗肿瘤活性、神经氨酸酶抑制活性、抗菌活性及抗氧化活性测试,结果表明化合物PS1、PS9、PS18、PS26、PS29对水产病害细菌具有较强的抑制活性。
利用生物信息学的手段,结合基因组及转录组分析,对海藻来源真菌鲜红青霉P.chermesinum EN-480次级代谢产物进行了深入挖掘。实验室前期研究发现该菌株使用大米固体培养基进行培养时可产生一系列结构新颖的混源萜类化合物,且具有较强的抗菌活性。通过对菌株基因组测序及数据库比对发现,其具有合成萜类、聚酮类、混源萜类、多肽类等多种次级代谢产物的潜力。为了进一步激发其代谢潜力,促进沉默基因的表达,采用一菌多产物(OSMAC)策略,通过对不同培养基及发酵方式的筛选,转录组分析,最终确定其规模发酵方式。对改进的大米培养基及MH2培养基的发酵产物进行选择性的分离,从中分离得到8个新化合物(PCR1-PCR5以及PCM1-PCM3),其中4个为结构新颖的混源萜类化合物(PCR1-PCR4),1个为骨架类型新颖的甾体类化合物(PCR5),3个为法尼基酯化成环形成的特殊结构类型的倍半萜类化合物(PCM1-PCM3)。对新化合物进行了抗菌活性测试,所有化合物均表现出较强的抗人类及水产病害细菌、抗植物病害真菌活性。
本论文通过获取深海极端环境中不同动物来源内生真菌资源,结合多种组学手段及生物信息学分析,对海洋真菌次级代谢产物进行深入挖掘,从南海冷泉潜铠虾来源内生真菌C.verruculosa CS-129、麦哲伦海山珊瑚来源内生真菌P.steckii AS-324和海藻来源内生真菌P.chermesinum EN-480中共分离鉴定62个次级代谢产物,其中40个新化合物,2个新天然产物,提高了菌株次级代谢产物的出新率以及新天然产物的发现效率,活性筛选表明若干结构新颖的化合物具有显著的生物活性,为海洋真菌次级代谢产物的研究及应用提供了科学依据。
关键词: 冷泉及海山 ；内生真菌 ；基因组及转录组 ；次级代谢产物 ；生物活性
摘要： 蛋白激酶（protein kinase）是细胞信号转导通路的关键因子,其异常调控在一些恶性肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病以及心血管疾病的发病机制中起着重要作用,已成为21世纪最重要的药物靶点之一。然而由于激酶具有高度保守的结构,针对特定激酶靶标研发特异性小分子抑制剂是一项极具挑战的任务。本人在攻读博士期间,针对RIPK1、TRK和TNIK三种激酶开展了特异性小分子抑制剂的发现、生物活性和作用机制研究,具体内容介绍如下: 第一部分:RIPK1特异性小分子抑制剂的发现、抗炎活性和作用机制研究 RIPK1（受体相互作用蛋白激酶1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与多种与细胞存活有关的信号通路的调控,是细胞程序性坏死（necroptosis）的关键调节因子。RIPK1介导的细胞程序性坏死在炎症、缺血再灌注损伤、神经系统疾病和癌症等疾病的发病和进展中发挥着重要作用,故而被认为是治疗程序性坏死相关疾病的一个有潜力的靶点。虽然目前已有RIPK1抑制剂报道,其中部分抑制剂对RIPK1具有较高抑制效果,但大都存在核心骨架类似、特异性不高、药代动力学性质不理想等问题,严重影响了后期的药物开发。因此,研发新型高活性、特异性并具有良好成药性的RIPK1小分子抑制剂对程序性坏死相关疾病的治疗具有重要意义。 在本研究中,我们首先构建了基于深度学习的分子生成模型,并将其用于靶向RIPK1的虚拟筛选库的分子生成;进一步,通过多层次虚拟筛选与化学合成,得到了具有全新骨架的靶向RIPK1的苗头化合物,并通过激酶活性、细胞活性和细胞毒性筛选,得到了靶向RIPK1的先导化合物5-（2-异丁酰氨基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基）-1-甲基-N-（1-苯乙基）-1H-吲哚-3-甲酰胺（RI-962）。RI-962对RIPK1激酶的抑制活性IC50值为35.0 n M,同时显示了极高的激酶选择性。细胞水平上,RI-962可以剂量依赖地保护HT29、L929、J774A.1和U937细胞免受程序性坏死,EC50分别为10.0 n M、4.2 n M、11.4 n M和17.8 n M。我们进一步对其作用机制进行了探索,CRISPR/Cas9和Western Blot实验表明,RI-962通过抑制RIPK1的激酶活性来阻断程序性坏死通路信号传导,从而保护细胞免于程序性坏死。体内实验结果表明RI-962对TNFα诱导的小鼠全身炎症反应综合征（SIRS）模型和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病（IBD）模型均有保护作用,显示出了良好的抗炎效果。但RI-962的活性还有进一步提升的空间,另外,该化合物的药代动力学性质还不理想,例如口服生物利用度还较低（F=8.8%）。 为进一步提升RI-962的活性,我们解析了RI-962与人RIPK1激酶结构域的复合物晶体结构,并基于此对RI-962进行改构优化,得到了一系列靶向RIPK1的RI-962衍生物,并从中挑选出活性较高和口服生物利用度较好（F=35.0%）的候选药物（S）-N-(7-(3-(2-（4-氟苯基）吡咯-1-羰基)-1-甲基-1H-吲哚-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)环丙甲酰胺（1326）进行深入研究。1326具有良好的RIPK1激酶抑制活性和细胞抗程序性坏死活性(RIPK1,IC50=33.0 n M;HT29,EC50=20.6 p M)。激酶选择性研究表明,化合物1326具有较好的RIPK1选择性,除对MLK1-4有轻微脱靶效应外,对其他测试的402种激酶没有显著的抑制活性。SIRS模型和胶原诱导的关节炎（CIA）模型结果显示,1326体内抗炎症效果显著,能剂量依赖性缓解小鼠全身炎症或局部炎症的发展进程,改善模型小鼠的器官损伤症状。此外,初步成药性评价显示,1326具有较高的口服药物暴露量和生物利用度,同时具有良好的安全性,药物安全窗口大。综上所述,化合物1326是一个新型高效高特异性且具有良好成药性的RIPK1抑制剂,具有进一步开发成为临床候选药物的潜力和价值。 第二部分:TRK特异性小分子抑制剂的发现、抗肿瘤活性和作用机制研究 TRK（原肌球蛋白受体激酶）属于受体酪氨酸激酶家族,由TRKA、TRKB和TRKC三个成员组成,并分别由神经营养受体酪氨酸激酶（NTRK）1、2和3基因编码。TRK的失调与多种癌症的发生发展密切相关,因此TRK被认为是多种癌症的有吸引力的治疗靶点。NTRK融合引起的TRK受体激活被认为是最常见的致癌因素,由于TRK蛋白经跨膜融合后,经常会缺乏细胞外结构域,所以基于单克隆抗体的靶向治疗难以见效。因此,使用TRK激酶小分子抑制剂是治疗具有NTRK融合基因的癌症主要方法。目前已有两种第一代TRK抑制剂（larotrectinib和entrectinib）被批准上市,但患者用药一段时间后会产生获得性耐药,这严重限制它们在临床上的应用。目前已有多家公司布局开发第二代TRK抑制剂来克服一代抑制剂治疗产生的获得性耐药,但结构相对单一,大多为大环类化合物。另外据报道,进入临床研究的第二代抑制剂LOXO-195和TPX-0005也产生了耐药。因此,发现具有新骨架、高活性、高选择性和可克服多重耐药的新一代TRK抑制剂是一项重要且有价值的工作。 在本研究中,我们建立了Ba F3-TEL-TRKA和Ba F3-TEL-TRKCG623R(TRKCG623R是第一代TRK抑制剂临床使用中主要的获得性耐药突变之一)两种细胞筛选模型,筛选了我们内部的激酶抑制剂化合物库（约200种化合物）,发现一个苗头化合物1-(4-氯-3-（三氟甲基）苯基)-3-(4-(（6,6-二甲基-7-羰基-7,8-二氢-6H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噁嗪-4-基）-氨基)苯基)脲（Cpd-1）,该化合物对这两种细胞均有抑制活性,IC50值分别为1.126μM和1.352μM。激酶测试结果显示Cpd-1能够有效抑制TRKA/B/C,IC50值分别为0.211μM、0.381μM和0.516μM。接下来我们通过分子对接和化学合成对Cpd-1进行了结构优化和构效关系（SAR）研究,以提高对野生型TRK及其耐药突变体的抑制活性。最终得到了一系列Cpd-1衍生物,其中活性最高的是1-(3-（叔-丁基）-1-（4-氯苯基）-1H-吡唑-5-基)-3-(4-(（6,6-二甲基-7-羰基-7,8-二氢-6H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噁嗪-4-基）氨基)-3-甲苯基)脲（11g）,我们进一步对该化合物进行了体内外的抗肿瘤活性研究。 化合物11g对TRKA/B/C以及各种耐药突变体表现出高抑制活性并显示出良好的激酶选择性。在细胞中11g表现出优异的体外抗肿瘤活性。机制研究表明11g可以抑制TRK及其下游信号分子ERK、AKT和PLCγ1的磷酸化,同时可剂量依赖的将细胞阻断于G0-G1期,并诱导细胞发生凋亡。在体内研究中,化合物11g在Ba F3-TEL-TRKA和Ba F3-TEL-TRKCG623R同种异体移植小鼠模型中表现出良好的抗肿瘤活性,并可降低肿瘤组织中p-TRK、p-ERK和p-AKT的水平,且没有表现出明显的毒性。总之,化合物11g是一个新型可克服耐药的靶向TRK的先导化合物,值得进一步研究。 第三部分:TNIK特异性小分子抑制剂的发现、抗结直肠癌活性和作用机制研究 TNIK（Traf2和Nck相互作用激酶）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,是Wnt/β-catenin通路中的下游信号蛋白,也是TCF4和β-连环蛋白转录复合物的重要调节成分,与多种癌症的发生发展密切相关,故而被认为是治疗Wnt通路相关癌症（如结直肠癌）的一个有潜力的靶点。到目前为止,虽然已有多个TNIK抑制剂报道,但大多存在特异性不高、药代性质差、抗肿瘤效果不理想等问题,严重影响了后期的药物开发。因此,研发新型高活性、特异性并具有良好抗肿瘤效果的TNIK小分子抑制剂对结直肠癌的治疗具有重要意义。 本研究中,我们基于计算机辅助药物设计,利用TNIK的晶体结构（PDB:5AX9）设计对接模型对本课题组的内部化学库（包含大约30000种化合物）进行了虚拟筛选,并经化学合成获得了30种化合物,随后在10μM的固定浓度下进行TNIK激酶抑制活性测定,发现了苗头化合物2-甲氧基-N-（3-甲氧苯基）-4-（1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基）苯甲酰胺（1）。化合物1对TNIK表现出中等活性,IC50值为1.337μM。我们进一步通过分子对接和化学合成对其进行改构优化,最终获得高活性的TNIK小分子抑制剂苯并氧氮杂?酮类衍生物（21k）,并对其进行了深入的生物活性和作用机制研究。 21k在体外激酶抑制活性测试中,对TNIK激酶的IC50值为0.026μM,且显示出良好的激酶选择性,并在结直肠癌细胞系HCT116和DLD-1及其他测试细胞系的增殖活性测定中显示出较好的细胞选择性。化合物21k还以浓度依赖的方式抑制结直肠癌细胞系HCT116和DLD-1的克隆形成与迁移。此外,化合物21k在HCT116异种移植小鼠模型中显示出较好的抗肿瘤效果,且在小鼠上展示出良好的药代动力学特性。总之,我们发现了一个具有新骨架、高选择性和良好药代动力学特性的TNIK抑制剂21k,为结肠癌的靶向治疗提供有效的先导化合物。 综上所述,本人在攻读博士期间开展了靶向RIPK1、TRK及TNIK三种激酶的特异性小分子抑制剂的发现、生物活性及作用机制研究,主要取得了以下成果:（1）获得了一个新型高效高特异性且具有良好成药性的RIPK1抑制剂1326,该化合物在体内外显示出了优秀的抗程序性坏死活性,并在动物模型上具有显著的抗炎效果;（2）获得了一个新型高活性的可克服耐药的TRK抑制剂11g,体内外均具有较好的抗肿瘤活性;（3）获得了一个具有新骨架、高选择性和良好药代动力学特性的TNIK抑制剂21k,体内外均具有较好的抗结直肠癌活性。总之,本研究为靶向RIPK1、TRK及TNIK的抗炎、抗肿瘤的创新药物研发奠定了良好基础。
关键词: 激酶抑制剂 ；RIPK1 ；TRK ；TNIK ；生物活性 ；作用机制 ；成药性
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