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摘要： 目的:以蛋白质组学方法筛选2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)致先天性腭裂发生的差异表达蛋白。方法:以TCDD诱导建立胎鼠先天性腭裂模型,行腭部的大体解剖及组织学检查。取实验组和对照组胎鼠的腭组织,分别提取组织总蛋白。通过双向电泳和质谱分析,筛选出实验组和对照组腭组织的差异表达蛋白,并用免疫组化对鉴定出的相关蛋白质进行验证。结果:成功诱导胎鼠腭裂模型。筛选出10种差异表达的蛋白,其中7个蛋白点在试验组上调,3个蛋白点在实验组下调。过氧化物还原酶1(Peroxiredoxin 1,Prx 1)与鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDP-dissociation inhibitor,GDI)在实验组表达明显增强。结论:Prx 1、GDI表达的明显增强可能与TCDD所致胎鼠先天性腭裂有关。
关键词: 23,,7,8-四氯二苯二噁英 ；腭裂 ；蛋白质组学
被引量
5
会议名称： 第八届中国医师协会美容与整形医师大会暨第一届全国激光美容大会(第二届全国颅颌面专题研讨会
会议时间： 2011-09-16
摘要： 目的：以蛋白质组学方法筛选2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD) 致先天性腭裂发生的差异表达蛋白。方法：以TCDD 诱导建立胎鼠先天性腭裂模型，行腭部的大体解剖及组织学检查。取实验组和对照组胎鼠的腭组织，分别提取组织总蛋白。通过双向电泳和质谱分析，筛选出实验组和对照组腭组织的差异表达蛋白，并用免疫组化对鉴定出的相关蛋白质进行验证。结果：成功诱导胎鼠腭裂模型。筛选出10 种差异表达的蛋白，其中7 个蛋白点在试验组上调，3 个蛋白点在实验组下调。过氧化物还原酶1（Prx 1）与鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDI)在实验组表达明显增强。结论：过氧化物还原酶1（Prx 1）、鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDI)表达的明显增强可能与TCDD 所致胎鼠先天性腭裂有关。
关键词: 2,3,7,8-四氯二苯二噁英 ；腭裂 ；蛋白质组学 ；差异蛋白 ；组织学检查
摘要： 目的:探讨Akt/mTOR通路在2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英(TCDD)诱导的胎鼠腭裂发生中的作用。方法:将C57BL/6N孕鼠随机分为TCDD组(n=15)和对照组(n=15),在妊娠第10.5天(GD10.5)分别给予64μg/kg TCDD或玉米油灌胃。对两组胎鼠GD14.5腭组织行非靶向代谢组学检测,对差异累积代谢物进行KEGG和GO富集分析。TUNEL染色观察GD14.5小鼠胚胎腭突间充质(MEPM)细胞及腭中嵴上皮缝(MES)细胞凋亡情况。透射电镜观察GD14.5胎鼠腭突细胞自噬情况,Western blot法检测Akt、磷酸化AKT(p-Akt)、mTOR、p-mTOR及自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1和P62)的表达。结果:非靶向代谢组学分析显示差异累积代谢物与包括PI3K-Akt及mTOR在内的多种信号通路有关。与对照组比较,TCDD组MEPM细胞凋亡增加,MES细胞凋亡减少(P均<0.05),TCDD组胎鼠MEPM细胞和MES细胞自噬体形态不规则、数量减少,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1表达降低,P62表达升高,p-Akt和p-mTOR蛋白表达增加(P均<0.05)。结论:TCDD可能通过激活Akt/mTOR信号通路抑制胎鼠腭组织MEPM、MES细胞自噬,影响细胞凋亡进程,进而干扰腭部的正常发育,最终导致腭裂的发生。
关键词: 2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英 ；腭裂 ；Akt/mTOR通路 ；代谢组学 ；小鼠
摘要： 目的:通过检测DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在四氯二苯并对二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-paradioxin,TCDD)诱导的腭裂小鼠体内的表达,探讨其与腭裂发病机制的相关性。方法:TCDD通过对腭部中嵴上皮细胞的毒性作用,导致胎鼠腭裂发生。应用TCDD(64μg/kg)处理胚胎处于第10.5天(E10.5)的C57BL/6J怀孕小鼠建模。分别获取E13.5、E14.5、E15.5和E17.5胎鼠的口腔组织,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色检测胎鼠腭裂组织。逆转录-定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测以上各组胎鼠DNMT1mRNA表达水平的变化,Western blot检测DNMT1蛋白表达水平的变化。结果:HE染色结果显示TCDD组腭裂发生率为98.25%,对照组无腭裂发生。RTqPCR结果显示TCDD组DNMT1mRNA水平与对照组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果表明与对照组比较,TCDD组DNMT1蛋白表达水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:在TCDD诱导胎鼠腭裂的形成过程中,DNMT1发挥重要的作用。
关键词: 非综合征型唇腭裂 ；甲基化 ；四氯二苯并对二噁英 ；DNA甲基转移酶1
被引量
2
摘要： 目的检测在2，3，7，8-四氯二苯二噁英（2，3，7，8-tetrachlorod-ibenzo-P-dioxin，TCDD）诱导的C57BL／6J小鼠腭裂过程中组蛋白H4乙酰化的表达水平，探讨TCDD诱发腭裂与组蛋白H4乙酰化的相关性。方法48只C57BL／6J近交系孕鼠完全随机分为实验组和对照组，在小鼠妊娠第10．5天（gestationday，GD10．5）时，一次性给予孕鼠分别灌服20μg/kgTCDD（实验组）和等剂量玉米油（对照组），分别在GD13．5、GD14．5、GD15．5剖腹取胎鼠头部标本，作冠状位组织切片，采用免疫组织化学染色观察组蛋白H4乙酰化在腭突中的表达，Western Blotting检测胎鼠腭组织组蛋白H4乙酰化的相对表达量。应用SPSS24．0进行统计分析，统计方法采用单因素方差分析和方差同质性检验，方差齐采用Bonferroni检验，方差不齐者采用校正t检验，P〈0．05表示差异有统计学意义。结果组蛋白H4乙酰化主要表达在腭突上皮细胞中，间质细胞少许表达；在腭发育各个主要时期GD13．5、GD14．5、GD15．5腭突上皮细胞的相对表达量分别是：对照组为0．60±0．25、0．92±0．09和0．90±0．09；TCDD组为1．02±0．28、1．61±0．27和1．28±0．13，2组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论TCDD诱导的C57BL／6J胎鼠腭裂的发生可能与组蛋白H4乙酰化修饰有关。
关键词: 组蛋白H4 ；乙酰化 ；2 ；3 ；7 ；8-四氯二苯二噁英 ；腭裂
被引量
2
摘要： 目的检测2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导的胎鼠腭裂模型中腭突组织细胞周期相关分子的表达变化,初步探讨细胞周期相关分子在腭裂发生中的作用机制.方法使用随机数字表法将48只C57BL/6J孕鼠随机分为TCDD处理组与对照组,每组24只.TCDD处理组在胚胎日第10天(the embryonic day10.5,E10.5),按28μg/kg的量(含5μg/mlTCDD的玉米油)给予孕鼠一次性灌胃,对照组等量玉米油灌胃.分别在E13.5、E14.5及E15.5取出各组胎鼠腭突组织,提取总核糖核酸和总蛋白,分别用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测细胞周期相关分子的信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表达水平.以不同浓度TCDD(0.01、0.1、0.5和1nmol/L)处理人肾胚293t细胞(HEK293t),并用噻唑蓝(MTT)检测其细胞增殖活力.以IBMSPSS24.0进行统计分析,两样本间均值比较均采用独立样本t检验,所有结果作K-S检验均符合正态分布,方差不齐者采用校正t检验,P<0.05表示差异有统计学意义.结果E13.5、E14.5和E15.5,干扰素调节因子6(Irf6)蛋白在对照组(1.26±0.13、1.67±0.14、1.42±0.15)较TCDD组(0.81±0.08、1.04±0.02、0.86±0.12)表达水平高,差异有统计学意义(t=2.836、3.662、2.867,P=0.0471、0.0146、0.0241);E14.5和E15.5时细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(P21)蛋白在对照组(2.26±0.21、1.99±0.21)较TCDD组(1.43±0.12、0.93±0.22)表达水平高,差异有统计学意义(t值为3.398、3.378,P值为0.8726、0.0273).细胞周期相关分子的mRNA表达水平:各个时间点,细胞周期蛋白D1(cyclinD1)对照组(1.00±0.02、0.94±0.03、1.11±0.09)表达水平较TCDD组(0.28±0.01、0.33±0.06、0.88±0.01)高(t=22.53、22.35、14.27,均P<0.001);TCDD组cyclinE1、cyclinA2、cyclinB1、细胞周期蛋白依赖性激酶6(Cdk6)、Cdk2、Cdk1表达均较对照组高,差异有统计学意义(均P<0.05),其中E13.5cyclinB1和E15.5Cdk2在2组间差异无统计学意义(均P>0.05).0.1nmol/LTCDD处理1、2、3d,HEK293t细胞增殖活力(0.70±0.05、1.05±0.03、1.39±0.04)均较对照组(0.49±0.04、0.98±0.03、1.55±0.02)增加,差异有统计学意义(t=2.829、1.395、2.692,P=0.0198、0.1320、0.0247).结论TCDD下调Irf6和P21蛋白的表达水平,并干扰细胞周期相关分子正常表达,可能干扰了腭中缝上皮细胞退出细胞周期及增殖活力,细胞周期相关分子在腭发育过程中时空表达的紊乱可能与TCDD诱导腭裂的发生机制有关.
关键词: 细胞周期 ；2,3,7,8-四氯二苯二噁英 ；腭裂 ；腭中缝上皮
被引量
2
摘要： 目的观察在不同四氯二苯二噁英(TCDD)剂量的作用下,胎鼠腭裂形成过程中的形态学、组织学变化,以筛选TCDD诱导腭裂模型的最适剂量。方法C57BL/6J孕鼠于妊娠第10天随机分为对照组和实验Ⅰ～Ⅳ组,每组6只;对照组以玉米油0.1ml灌胃,实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别以TCDD32、28、24、20μg/kg灌胃。妊娠第17.5天处死孕鼠,称量孕鼠及胚胎体重,记录活胎鼠数、腭裂数、吸收胎及死胎鼠数。另取15只C57BL/6J孕鼠随机分组同前,处理方法同前;各组分别于妊娠第13.5、14.5和15.5天剪取胎鼠头部,解剖显微镜下观察;并行苏木精-伊红染色(HE染色),观察。结果各组孕鼠增加的体重及活胎鼠的体重差异均无显著性。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组较对照组双侧腭突发育瘦小,上抬延迟;Ⅳ组双侧腭突发育及上抬与对照组相比无明显差异。Ⅰ～Ⅳ组胎鼠腭裂发生率分别为97.37%、93.02%、65.12%、56.82%,对照组未见胎鼠腭裂形成。结论 TCDD28μg/kg是建立C57BL/6J胎鼠腭裂模型的最适剂量。
关键词: 腭裂 ；四氯二苯二噁英 ；C57BL/6J ；小鼠 ；发育 ；形态学 ；组织学
被引量
21
摘要： 目的应用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术结合质谱分析筛选2，3，7，8-四氯二苯二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）与维甲酸致胎鼠腭裂发生的共同差异表达蛋白质。
方法将36只C57BL/6J孕鼠按照随机数表法分为3组，每组12只。分别以28 μg/kg TCDD、80 mg/kg维甲酸在C57BL/6J孕鼠第10.5个妊娠日（gestational day 10.5，GD10.5）灌胃，建立胎鼠腭裂模型，对照组给予等量玉米油灌胃，于GD17.5观察胎鼠腭部的解剖学及组织学改变；取TCDD组、维甲酸组与对照组GD17.5胎鼠的腭组织，从中提取总蛋白质，采用iTRAQ技术联合二维液相色谱-串联质谱分析和鉴定实验组与对照组的差异表达蛋白质；用Western Blot对Annexin A1、14-3-3 sigma差异蛋白进行表达验证。实验数据应用SPSS17.0软件进行统计分析，腭裂发生率的比较采用卡方检验，3组目的蛋白相对表达量比较采用单因素方差分析，方差齐性分析采用Levene检验，组间比较采用Turkey HSD检验，P〈0.05为差异有统计学意义。
结果①成功建立了胎鼠腭裂模型，TCDD组与维甲酸组腭裂发生率分别为97.1%（68/70）和98.6%（70/71），2组比较差异无统计学意义（χ2＝0.00，P〉0.05），腭裂表型在形态学上相似。②共鉴定出2 996个蛋白质，TCDD组、维甲酸组与对照组比较，分别筛选出差异蛋白75个和90个，2个实验组共同表达的差异蛋白有18个。③Western Blot结果显示，Annexin A1蛋白表达水平对照组为0.52±0.11，TCDD组和维甲酸组分别为0.99±0.34和0.98±0.31，分别与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）；14-3-3 sigma蛋白表达水平对照组为0.55±0.15，TCDD组和维甲酸组分别为0.86±0.17和0.93±0.13，分别与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0.05），与iTRAQ检测结果一致。
结论应用iTRAQ技术能够快速、有效地筛选TCDD与维甲酸致C57BL/6J胎鼠腭裂发生的共同表达的差异蛋白，这些差异蛋白可能与TCDD、维甲酸致胎鼠腭裂发生密切相关。
关键词: 蛋白质组学 ；腭裂 ；疾病模型 ；动物 ；2, ；3, ；7 ；,8-四氯二苯二噁英 ；维甲酸
被引量
2
摘要： 目的 探讨组蛋白H3乙酰化在2,3,7,8-四氯二苯二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD）所致的C57 BL/6J胎鼠腭裂畸形发生中的作用及其机制.方法 共36只C57BL/6J孕鼠,将18只随机分为TCDD组和对照组,每组9只,TCDD组于受孕后第10天（gestation day,GD10）以TCDD 28 μg/kg灌胃1次;对照组于GD10以等量玉米油灌胃;分别于GD13.5、GD14.5及GD15.5处死孕鼠,收集胎鼠的上腭组织提取核蛋白,用比色法检测组蛋白乙酰转移化酶（histone acetyltransferases,HATs）活性.另18只孕鼠随机分为TCDD组和对照组（分组及各组只数同前）,分别在上述时间点提取核蛋白,用Western-blot方法检测乙酰化的组蛋白H3（acetylated histone H3,Ac-H3）在上腭的表达情况.结果 各个时间点HATs相对活性在GD13.5,GD14.5、GD15.5所测吸光度A值对照组分别为0.4097±0.0147、0.5223±0.017 1和0.643 5±0.0139,TCDD组分别为0.8650±0.0129,0.719 1±0.0178和0.551 2±0.016 8;TCDD组HATs活性在GD13.5、GD14.5分别高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）;而在GD15.5 TCDD组HATs活性低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）.各个时间点Ac-H3相对表达量在GD13.5,GD14.5、GD15.5,对照组分别为0.745 0±0.113 5,1.055 9±0.249 4和1.795 5±0.081 9,TCDD组分别为1.4490±0.1460,1.6418±0.0997和1.512 l±0.1502; TCDD组Ac-H3表达在GD13.5、GD14.5分别高于对照组GD13.5、GD14.5,差异均有统计学意义（P＜O.01,P＜0.05）;而在GD15.5,TCDD组Ac-H3表达低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 组蛋白H3酰化参与了TCDD所致的C57BL/6J胎鼠腭裂的发生,可能是TCDD诱导腭裂发生的机制之一.
关键词: 组蛋白H3 ；乙酰化 ；2,3,7,8-四氯二苯二噁英 ；腭裂
被引量
9
摘要： 目的初步研究组蛋白去甲基酶UTX在2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导胎鼠腭裂模型中的作用机制。方法选取18只C57BL/6J孕鼠随机分为TCDD组和对照组,每组9只。在妊娠第10.5天,TCDD组孕鼠采用经口灌胃方式一次性给予64μg/kg的TCDD(溶于0.2 mL的玉米油中),对照组采用经口灌胃方式给予0.2 mL玉米油。每组分别于妊娠第13.5、14.5、15.5天各安乐处死3只孕鼠,分离胎鼠腭突组织。采用HE染色观察腭突组织形态,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot检测两组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白表达水平。结果HE染色结果显示,妊娠第15.5天对照组胎鼠双侧腭突组织已接触融合;而TCDD组胎鼠腭突组织未融合,且舌体下降出现明显延迟,提示腭裂初步形成。在不同妊娠时间,两组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白相对表达量均有变化(F值分别为28.683、7.927,均P<0.05);TCDD组胎鼠腭突组织中UTX的mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组(F值分别为1167.309、348.274,均P<0.05);且两组UTX的mRNA相对表达量差异随着妊娠时间的延长而变大(F=4.885,P=0.017),而两组UTX蛋白相对表达量的差异随妊娠时间的延长无明显变化(F=3.158,P=0.061)。结论胎鼠腭突组织中UTX的表达水平降低可能是TCDD诱导腭裂发生的主要原因之一,UTX可能在腭部发育过程中具有重要作用。
关键词: 腭裂 ；UTX ；组蛋白去甲基酶 ；上皮间充质转化
摘要： 目的对慢性低剂量暴露于2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(TCDD)的雌性SD大鼠血清蛋白改变进行研究,对TCDD毒性效应作进一步阐述。方法雌性SD大鼠随机分为3个染毒组和1个对照组[(n=8只/组,0 ng/(kg.d)、20 ng/(kg.d)、50 ng/(kg.d)、125 ng/(kg.d)],灌胃染毒29周,采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱技术对大鼠血清进行蛋白组学研究,寻找差异蛋白点,并对其肝脏进行组织病理学检测。结果上调的蛋白包括补体C4,载脂蛋白A-Ⅳ前体和低分子量的激肽原前体;触珠蛋白和补体C3仅在染毒组大鼠凝胶中被识别,而对照组未见;而α-抑制因子Ⅲ前体只在对照组的胶上被识别。肝脏组织病理学检测显示染毒组大鼠肝脏出现肝细胞的脂肪变性、空泡形成、肝细胞坏死等改变,并且随染毒剂量的增加严重程度增加。结论慢性低剂量染毒使得血清蛋白谱发生改变,所改变的蛋白质与TCDD的免疫毒性、肝毒性、氧化应激等效应有关。血清差异蛋白可为TCDD毒作用分子标志物的筛选提供依据。
关键词: 2,3,7,8-四氯二苯并二噁英 ；血清蛋白组学 ；基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱 ；双向电泳
被引量
2
摘要： 目的: 二噁英暴露可增加子代腭裂(Cleft palate,CP)发生风险，但具体机制尚不清晰。本研究基于孕鼠2,3,7,8-四氯代二苯并对二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)暴露诱导的胎鼠CP模型，通过转录组学-代谢组学联合分析筛选CP发生关键基因、代谢物及信号通路，结合分子实验阐明CP发生机制。 方法: 1.胎鼠CP模型 实验前一天20:00将6周龄C57BL/6N雌雄小鼠按照2∶1比例合笼。于次日上午8:00检查雌鼠生殖道，若存在阴道栓则标记为疑似孕鼠，此时定义时间为怀孕天数(Gestation day，GD)0.5并记录当前体重。基于高通量基因表达数据库进行单细胞转录组分析确定实验分组，将标记的雌鼠随机分配至不同组别，每组6只。GD 10.5时体重较GD 0.5增加大于2.0 g的雌鼠确认为孕鼠，以64μg/kg的标准使用TCDD对实验组孕鼠实施灌胃，对照组采用溶剂对照(玉米油)实施灌胃。于GD 13.5、GD 14.5、GD 15.5处死孕鼠收集胎鼠完整头部及腭组织。 2.病理学观察 采用苏木精-伊红染色观察TCDD暴露对胚胎腭突发育的影响。采用BrdU及Tunel荧光染色观察TCDD暴露对胚胎腭突细胞增殖及凋亡水平的影响，主要包括腭中嵴上皮(Medial edge epithelial,MEE)细胞和胎鼠腭突间充质(Mouse embryonic palate mesenchymal,MEPM)细胞。基于透射电子显微镜观察TCDD暴露对腭突细胞内自噬体形态及数量的影响。 3.生物信息学分析 对GD 14.5腭组织进行转录组测序，筛选差异表达基因(Differential expressed genes,DEGs)进行基因本体(Gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG)富集分析，确定 CP 相关信号通路及生物过程。对GD 14.5腭组织进行非靶向代谢组学检测，进行一级和二级分析筛选差异累积代谢物(Differential accumulation metabolites,DAM)。基于KEGG数据库确定CP相关代谢信号通路，并计算代谢通路之间的关联关系。进行DEGs-DAM配对，对关系对进行通路共注释获得CP发生关键信号通路及其之间的互作关系。 4.分子实验 利用蛋白免疫印迹法检测生物信息学分析得到的关键信号通路蛋白（AKT、mTOR、p-AKT 和 p-mTOR）及其调控的自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1和P62）表达水平。 5.统计学分析 本研究以P＜0.05且差异倍数大于2或小于0.5作为筛选DEGs的标准。以P＜0.05且变量投影重要度＞1作为筛选DAM的标准。采用Fisher精确检验和超几何分布进行GO条目及KEGG信号通路富集分析。使用Spearman相关性算法进行基因-代谢物配对。采用t检验比较两组间差异，使用单因素方差分析进行多组间比较。本研究使用R软件（版本4.2.2）进行统计分析，检验水准为双侧α=0.05。 结果: 1.TCDD抑制腭发育:GD 13.5至GD 15.5,对照组胎鼠两侧腭突经历生长、抬高、接触以及融合后中嵴上皮缝消失形成完整腭架;TCDD组胎鼠两侧腭突发育迟缓膨胀突出程度较小，腭突抬高延迟最终无法接触融合导致CP发生。 2.TCDD抑制MEPM细胞生长:GD 13.5至GD 15.5,不同时间点TCDD组MEPM细胞增殖能力均出现下降。在GD 14.5腭融合关键时间，TCDD暴露导致MEPM细胞凋亡水平增加，腭MEE细胞凋亡水平降低。 3.转录组学分析:GD 14.5腭组织转录组测序得到138个DEGs,其中58个表达上调，80个表达下调。GO 一级水平富集于免疫反应，纤毛运动，细胞外空间，动力蛋白轻链结合等条目;GO二级水平富集于生物粘附、细胞凋亡、生殖过程等条目。KEGG一级水平富集于卵巢甾体生成、细胞色素P450介导的外源代谢、PI3K-Akt信号通路以及视黄醇代谢等信号通路;KEGG二级水平富集于细胞增殖、凋亡及迁移等细胞功能。 4.非靶向代谢组学分析:GD 14.5腭组织非靶向代谢组学共鉴定出114个DAM,其中30个上调，84个下调。上调的DAM主要包括脯氨酸、牛磺酸以及氨基蒽醌等;下调的DAM主要包括柠康酸、反式肉桂酸以及吡咯-2-羧酸等。代谢通路富集结果表明DAM与酪氨酸代谢、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路以及mTOR信号通路具有关联。 5.转录组学-代谢组学联合分析:大部分DEGs-DAM关系对呈现负相关关联，其中仅有3个DEGs以及4个DMA可以寻找到正相关关系对。基于DEGs-DAM 关系对进行信号通路共注释，结果主要富集于MAPK、钙离子、Wnt、PI3K-Akt、mTOR和自噬等信号通路及生物功能。 6.TCDD激活Akt/mTOR信号通路:与对照组相比，TCDD组GD 14.5胎鼠腭组织中正常形式AKT和mTOR蛋白表达水平无明显差异，磷酸化形式的p-AKT和p-mTOR表达水平增加。 7.TCDD抑制细胞自噬水平:与对照组相比，TCDD组GD 14.5胎鼠MEPM细胞和腭MEE细胞线粒体内自噬体形态不规则、数量减少。TCDD组腭组织LC3-Ⅱ/Ⅰ,Atg5和Beclin1蛋白表达水平降低，P62表达水平升高。 结论: 1.转录组学与代谢组学联合分析结果提示孕鼠TCDD暴露诱发胚胎CP的生物学机制与MAPK、钙离子、Wnt、PI3K-Akt、mTOR以及自噬等信号通路或生物功能相关。 2.孕鼠TCDD暴露可激活胚胎MEPM细胞内AKT/mTOR信号通路并抑制其自噬水平，导致MEPM细胞生长能力降低，腭发育进程迟缓最终发生CP。
关键词: 腭裂 ；二噁英 ；孕期暴露 ；生物学机制
摘要： 第一部分TCDD诱导胎鼠腭裂过程中组蛋白H4乙酰化的表达目的:研究由环境污染物2,3,7,8-四氯二苯二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD）诱导胎鼠腭裂发生过程中,组蛋白H4乙酰化在腭突中的表达,探讨组蛋白H4乙酰化在胎鼠腭裂发生中的可能机制。方法:48只C57BL/6J近交系孕鼠完全随机分为实验组和对照组,小鼠孕10.5天（gestation day,GD10.5）时,一次性给予孕鼠分别灌服20ug/kg TCDD（实验组）和等剂量玉米油（对照组）,分别在GD13.5、GD14.5、GD15.5剖腹取胎鼠头部标本,作冠状位组织切片,采用免疫组织化学染色观察组蛋白H4乙酰化在腭突中的表达,Western Blot检测胎鼠腭组织组蛋白H4乙酰化的相对表达量。结果:TCDD组24只孕鼠获得活胎160只,活胎腭裂发生率为100%;对照组24只孕鼠获得活胎178只,活胎腭裂发生率为0。TCDD组24只孕鼠获得活胎160只,死胎和吸收胎12只,活胎腭裂发生率为100%,均为完全腭裂组蛋白H4乙酰化主要表达在腭突上皮细胞中,间质细胞少许表达;在腭发育各个主要时期GD13.5、GD14.5、GD15.5腭突上皮细胞的相对表达量分别是:对照组为0.60±0.25,0.92±0.09and 0.90±0.09;TCDD组为1.02±0.28,1.61±0.27 and 1.28±0.13,对照组与实验组差异有统计学意义（P<0.05）。结论:TCDD诱导的C57BL/6J胎鼠腭裂的发生可能与组蛋白H4乙酰化修饰有关。GD13.5GD15.5腭突组织中组蛋白H4乙酰化水平显著升高可能是TCDD致胎鼠腭发育障碍的表观遗传机制之一。第二部分TCDD诱导胎鼠腭裂过程中TβRs基因变化的实验研究目的:探讨TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ及TβR-Ⅲ基因变化与TCDD所致胎鼠腭发育障碍的相关性。方法:取24只C57BL/6J孕鼠随机分为TCDD组和对照组,每组再根据怀孕天数分成三个亚组,每组4只孕鼠。同样一次性在GD10.5分别灌胃20μg/kg TCDD（TCDD组）和等量玉米油（对照组）。在GD13.5、GD14.5和GD15.5分别剖腹孕鼠取各组胎鼠腭组织,提取总RNA,逆转录成c DNA,利用Q-PCR技术检测各组胎鼠腭组织中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ及TβR-Ⅲm RNA表达变化情况。结果:TCDD组12只孕鼠活胎数为82只,活胎发生腭裂为100%;对照组12只孕鼠获得98只活胎,无腭裂畸形发生。对照组TβR-Ⅰm RNA相对表达量在GD13.5、GD14.5和GD15.5分别为2.06±0.21、1.38±0.12和0.78±0.17,TCDD组分别为0.98±0.26、0.75±0.14和1.22±0.05;对照组TβR-Ⅱm RNA相对表达量在GD13.5GD15.5分别为1.84±0.08、1.14±0.09、0.81±0.13,TCDD组分别为0.91±0.22、0.96±0.06、1.30±0.13;TβR-Ⅲm RNA在对照组的相对表达量各自为1.86±0.10、1.11±0.11、0.67±0.15,在TCDD组分别为0.85±0.05、0.93±0.09、1.17±0.16。TCDD组的TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ及TβR-Ⅲm RNA在GD13.5和GD14.5相对表达量均低于对照组,差异有统计学意义（p<0.05）;而在GD15.5,TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ及TβR-Ⅲm RNA高于对照组,差异有统计学意义（p<0.05）。结论:TCDD诱导的胎鼠在腭发育关键时期GD13.5与GD14.4,TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ及TβR-Ⅲm RNA呈低表达状态,而在GD15.5呈高表达。TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ及TβR-Ⅲm RNA的低表达很可能参与了环境因素诱发胎鼠腭裂融合障碍过程。
关键词: 组蛋白H4 ；乙酰化 ；TCDD ；腭裂 ；转化生长因子β受体 ；TCDD ；Q-PCR ；腭裂
摘要： 第一部分TCDD体外干预间充质细胞和上皮细胞的表型差异对比目的:通过100nmol/L、10nmol/L高低两种不同剂量的2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin,TCDD)体外分别干预组成腭突的间充质细胞(mouse embryonic palatal mesenchymal,MEPM)和上皮细胞(media edge epithelia,MEE),对比其增殖、凋亡、迁移的细胞生物学行为以及对上皮细胞间充质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT)过程的影响,探讨两种细胞在不同剂量的TCDD干预下细胞表型的差异及其在腭裂畸形发生中的作用。方法:将取自孕14.5天(Gestation Day 14.5,GD14.5)C57BL/6J胎鼠腭突原代培养的MEPM和MEE分别设对照组和实验组,实验各组分别用10nmol/L、100nmol/L两种不同浓度的TCDD培养基干预,与正常培养基孵育的对照组比较。CCK-8检测细胞24至96小时增殖变化;使用Transwell小室检测细胞24小时的迁移能力;流式细胞术检测细胞72小时凋亡差异;上皮细胞标志物Zo-1和间充质细胞标志物Vimentin免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜检测TCDD干预24小时和72小时后两种标志物荧光强度变化趋势。结果:1)成功原代培养腭突MEPM和MEE,上皮细胞Zo-1蛋白表达阳性;而间充质细胞Vimentin蛋白表达阳性;2)腭突MEE的增殖随着TCDD剂量增加呈下降趋势(P<0.01);而TCDD低剂量促进MEPM增殖,高剂量抑制增殖(P<0.01);3)腭突MEE的迁移能力不受TCDD的影响(P>0.05);而TCDD低剂量促进MEPM迁移,高剂量抑制迁移(P<0.01);4)TCDD对腭突MEE的凋亡能力无影响(P>0.05),而随着TCDD剂量增加逐渐促进MEPM凋亡(P<0.01);5)腭突MEE的EMT随着TCDD剂量逐渐抑制(P<0.01)。结论:腭突MEE的EMT是时间依赖性的自发程序。高剂量TCDD抑制MEPM的增殖、迁移,促进凋亡;低剂量TCDD抑制MEE的EMT,上述TCDD干预导致的MEPM和MEE功能障碍可能是TCDD致腭裂畸形的原因。第二部分间充质细胞外泌体干预间充质细胞和上皮细胞的表型差异对比目的:采用未处理及TCDD干预后间充质细胞所提取外泌体,分别处理腭突MEPM和MEE,观察两组外泌体分别对MEPM的增殖、迁移、凋亡的生物学行为以及MEE的EMT的影响。方法:将取自孕14.5天C57BL/6J胎鼠腭突的MEPM第三至七代作为提取外泌体的母本细胞,对照组用正常培养基,而实验组培养基为含10nmol/L的TCDD。每48小时收集细胞上清液并传代细胞,将收集的细胞上清液按照QIAGEN试剂盒提取外泌体的方法收集囊泡,通过透射电镜、蛋白质免疫印迹、粒径分析鉴定收集的囊泡为外泌体。通过PKH26荧光标记外泌体,按照100μg/ml的浓度与MEPM、MEE共孵育24小时,通过激光共聚焦显微镜观察MEPM和MEE吞噬摄取外泌体情况。MEPM和MEE各分为两个组,分别用正常间充质细胞产生的外泌体和TCDD干预后间充质细胞产生的外泌体按照100μg/ml的浓度进行处理。通过CCK8、Edu测增殖,划痕、Transwell实验测迁移,细胞流式术和蛋白免疫印迹测凋亡和免疫荧光激光共聚焦测EMT程度。将两组外泌体做测序筛查差异miRNA。结果:1)间充质细胞上清液收集的囊泡经鉴定为外泌体,并通过激光共聚焦显微镜证实间充质细胞分泌的外泌体可被MEPM和MEE吞噬摄取;2)较对照组相比,TCDD干预MEPM产生的外泌体抑制MEPM增殖、迁移,促进凋亡(P<0.01);3)TCDD干预MEPM产生的外泌体较对照组抑制MEE的EMT过程(P<0.01);4)TCDD干预MEPM后导致其分泌的外泌体携带的miRNA差异表达。结论:MEPM产生的外泌体可以同时被MEPM和MEE吞噬摄取。TCDD干预MEPM后产生的外泌体与TCDD直接干预MEPM和MEE产生的表型变化趋势一致。外泌体在TCDD诱导腭裂畸形发生中可能发挥着重要作用。
关键词: 2,3,7,8-四氯二苯并二噁英 ；腭突间充质细胞 ；上皮细胞 ；上皮间充质化 ；外泌体 ；2,3,7,8-四氯二苯并二噁英 ；腭突间充质细胞 ；上皮细胞 ；上皮间充质化
摘要： 目的:探讨miRNA-214-3p在2,3,7,8-四氯二苯并-对噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导的腭裂发生中的作用。方法:64μg/kg TCDD对C57孕鼠灌胃,获得腭裂模型。利用miRNA测序和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测间充质细胞中miR-214-3p表达。通过CCK8、EDU、Transwell以及划痕实验评估TCDD通过miRNA-214-3p对间质细胞增殖和迁移的影响。结果:怀孕10.5天的C57小鼠暴露于TCDD(64μg/kg)后,实验组共有32只胎鼠出现腭裂(32/32),腭裂发生率达到100%。而对照组则没有出现任何腭裂(0/28)。在TCDD干预组中,miR-214-3p、miR-296-5p和miR-33-5p等miRNA的表达呈现明显上调,而miR-92a-3p、miR-126a-3p和miR-411-5p等miRNA的表达则明显下调。qRT-PCR验证了miR-214-3p的表达差异显著。同时,miR-214-3p抑制剂能部分恢复被TCDD干预的间质细胞(mesenchymal cells,MEPM)的增殖和迁移能力。结论:TCDD通过miRNA-214-3p抑制了腭间充质细胞的增殖和迁移.miRNA-214-3p在TCDD诱导的小鼠腭裂中可能起着关键作用。 目的:探讨用2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(TCDD)干预的间充质细胞(MEPM)来源的外泌体中miR-214-3P对MEPM增殖和迁移的影响。方法:通过QIAGE外泌体提取试剂盒获得未被和被TCDD干预的MEPM外泌体,利用透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)和免疫印迹(WB)技术对外泌体进行了鉴定。通过CCK8、EDU、Transwell和划痕实验评估外泌体对间充质细胞增殖和迁移的影响。利用外泌体miRNA测序和实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测外泌体中miR-214-3p表达。结果:MEPM外泌体呈典型的杯状形态,平均直径为150纳米,且表达了膜标志蛋白TSG101和Alix。TCDD干预的外泌体被间充质细胞摄取,并抑制了它们的生长和迁移。在TCDD干预的外泌体组中,miR-214-3p表达明显上调。qRT-PCR验证了miRNA-214-3p的差异表达。使用miRNA-214-3p抑制剂部分恢复了外泌体对间充质细胞的干预效果。结论:用TCDD和MEPM共培养后提取的外泌体中miR-214-3P抑制了MEPM的增殖和迁移。
关键词: miRNA-214-3p ；间充质细胞 ；腭裂 ；TCDD ；miRNA-214-3p ；外泌体 ；间充质细胞 ；腭裂 ；TCDD
摘要： 目的本研究通过建立2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-terachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD）诱导的胎鼠腭裂模型,探索长链非编码RNA MEG3在TCDD诱发胎鼠腭裂过程中的作用机制,从而为腭裂的预防提供科学的理论基础。方法将SPF级健康成年C57BL/6N小鼠于前一日晚上8点左右,以雌雄比例3:1的方式进行合笼,在第2日早晨8点,记录雌鼠的体重,并检查小鼠阴道是否出现乳白色固体胶粘物,若存在则标记为怀孕0天（gestation day 0,GD0）。在GD10早晨8点再次进行称重,若体重较GD0增加量超过2克及以上则为符合条件的实验小鼠,再通过随机数字表法将实验小鼠随机分为TCDD组（n=31）和对照组（n=31）,并分别经口腔灌入64μg/kg的TCDD和适量的玉米油。在GD13、GD14、GD15,通过颈椎脱臼术处死小鼠,部分取胎鼠头部用于包埋、切片,用于HE染色、原位杂交和Brd U荧光染色,另一部分取腭突组织,匀浆后用于分子生物学检测。通过实时荧光定量PCR（q PCR）和原位杂交技术（FISH）,分别观察TCDD对胚胎腭突间充质（mouse embryonic palate mesenchymal,MEPM）细胞中MEG3表达的影响。利用细胞增殖实验（Brd U）检测GD13、GD14、GD15三个时间点MEPM细胞的增殖能力。在GD14采用亚硫酸盐测序法测定两组MEG3基因启动子甲基化水平;同时利用蛋白免疫印迹法探索TCDD对Smad途径有关蛋白（p-Smad2、Smad2、Smad4、Smad7）表达影响;利用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验探索TCDD对MEG3与TβRI蛋白结合影响。采用IBM SPSS Statistics 25.0软件,两组间比较采用独立样本t检验进行统计学分析,以双侧P<0.05为具有统计学意义。结果1.TCDD对腭突融合的影响:H&E结果表明,GD13时两组腭突的发育并无明显变化;GD14时TCDD组两侧腭突出现了相对较大的缝隙;GD15时TCDD组两侧腭突不能正常接触和融合表现出明显的腭裂,而对照组两侧腭突正常接触并融合无腭裂的发生。2.TCDD对MEG3在MEPM中表达情况的影响:q PCR结果显示,在GD13、GD14、GD15三个时间点,TCDD组中MEG3的相对表达量明显高于对照组（P<0.05）。同时,FISH实验表明MEG3在GD14主要表达定位于细胞核中。3.TCDD对腭突关键期MEPM细胞增殖的影响:Brd U实验表明,在GD13和GD14时,TCDD组阳性细胞率明显低于对照组（P<0.05）,而在GD15天,TCDD组阳性细胞率却显著高于对照组（P<0.05）。4.TCDD对MEG3基因启动子甲基化的影响:从总体水平上看,TCDD组总体甲基化水平略低于对照组总体水平,不存在统计学上差异（P>0.05）。但从不同位点上看,TCDD组11号启动子片段上5th位点甲基化水平明显低于对照组相应位点的甲基化水平（P<0.05）。5.TCDD对Smad通路蛋白水平表达情况的影响:GD14时,与对照组相比,TCDD组MEPM细胞中Smad2、p-Smad2表达降低（P<0.05）,Smad7表达升高（P<0.05）,而Smad4的表达无统计学差异（P>0.05）。6.TCDD对MEG3与TβRI结合的影响:RIP实验表明MEG3可与TβRI蛋白发生结合。同时,与对照组相比,TCDD组TβRI蛋白富集了更多的MEG3（P>0.05）。结论1.在腭突发育过程中,TCDD可能通过DNA甲基化修饰导致部分MEG3启动子位点发生去甲基化,从而促进MEG3的表达。2.TCDD可能通过影响MEG3的转录水平以MEG3与TβRI的靶向结合的方式抑制TGF-β/Smad信号途径,从而抑制胎鼠腭突间充质细胞的增殖,由此导致腭裂的发生。
关键词: TCDD ；长链非编码RNA ；DNA甲基化 ；TGF-β/Smad信号途径
摘要： 第一部分TCDD诱导C57BL/6J胎鼠腭裂的最适剂量再探讨目的:观察不同剂量环境污染物2,3,7,8-四氯二苯二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD）诱导的C57BL/6J胎鼠腭部发育情况及死胎发生,探讨腭裂发生率和死胎发生率与TCDD剂量的相关性。方法:于合笼交配后第10.5天（GD10.5）,将判断受孕并称重的C57BL/6J孕鼠分为不同剂量给药组给予0、8、18、28μg/kg的TCDD。观察孕鼠活动情况至GD17.5,处死孕鼠,剖腹取胎,观察死胎发生情况。于解剖显微镜下观察存活胚胎腭部发育情况。结果:对照组与实验组在孕鼠体重增加、每窝胚胎数上无差异（P<0.05）,各剂量组产生的腭裂表型无差异。对照组无腭裂及死胎发生。各剂量组腭裂发生率均显著高于对照组（P<0.01）;但TCDD18μg/kg和28μg/kg组间腭裂发生率无统计学差异（P>0.05）;仅TCDD28μg/kg组与更低剂量组及对照组的死胎发生率存在差异（P<0.05）。结论:TCDD20μg/kg30μg/kg剂量区间是诱导腭裂高发生率的平台区间,即为诱导C57BL/6J胎鼠腭裂高发生率的最适剂量。第二部分腭发育过程中基因组DNA甲基化的初步研究目的:研究TCDD作用于C57BL/6J孕鼠后,胎鼠腭组织基因组DNA甲基化水平变化及正向调控甲基化水平的DNA甲基转移酶（DNA methyltranferases,Dnmts）和负向调控甲基化水平的十-十一转位蛋白（Ten-Eleven Translocations,TETs）m RNA的表达情况,明确基因组DNA甲基化在腭发育过程中的作用。方法:C57BL/6J孕鼠共40只,随机分为TCDD组和对照组,每组20只。TCDD组于受孕后第10.5天（gestation day,GD10.5）以TCDD28μg/kg一次性灌胃;对照组以等量玉米油一次性灌胃;分别于GD13.5、GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5处死孕鼠,收集各时间点的胎鼠腭组织,分别提取基因组DNA、总RNA。应用MethylampT.M.基因组DNA甲基化定量试剂盒检测基因组DNA甲基化水平,实时荧光定量PCR检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b以及TET1、TET2、TET3 m RNA的表达量。结果:TCDD组标准化甲基化率在GD13.5显著高于对照组组（P<0.01）;而在GD14.5、16.5均低于对照组（P<0.05,P<0.05）。在GD13.5、16.5,TCDD组Dnmt1 m RNA表达量高于对照组（P<0.05,P<0.01）。在GD13.5、16.5,TCDD组Dnmt3a m RNA表达量高于对照组（P<0.05,P<0.05）。在GD14.5,TCDD组Dnmt3b m RNA表达量显著高于对照组（P<0.01）。在GD13.5,TCDD组TET3 m RNA表达量显著低于对照组（P<0.01）。结论:胎鼠腭组织内可能存在复杂的DNA甲基化调控机制。由Dnmt1、Dnmt3a表达升高以及TET3表达降低引起的腭组织GD13.5基因组DNA甲基化水平的显著升高可能是TCDD致胎鼠腭发育障碍的表观遗传机制之一。第三部分TGF-β3、Dnmt1、Dnmt3a基因启动子区Cp G岛甲基化状态的实验研究目的:探讨TGF-β3、Dnmts基因启动子Cp G岛甲基化状态与TCDD所致胎鼠腭发育障碍的相关性。方法:将已知孕期的C57BL/6J孕鼠共18只,随机分为TCDD组和对照组。TCDD组于GD10.5给予28μg/kg的TCDD,对照组给予等体重体积的玉米油。分别于GD13.5、14.5、15.5处死孕鼠,收集各组胎鼠腭突组织。通过试剂盒提取组织DNA、亚硫酸氢盐转化、甲基化特异性PCR,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析各组各时间点腭组织表达的TGF-β3、Dnmts启动子Cp G岛甲基化状态。结果:各组各时间点TGF-β3启动子区Cp G岛均处于低甲基化水平,相同时间点两组间无统计学差异（P>0.05）。Dnmt1启动子区Cp G岛均处于高甲基化水平,相同时间点两组间亦无统计学差异（P>0.05）。TCDD组Dnmt3a启动子区Cp G岛1的甲基化水平在GD13.5和GD15.5高于对照组（P<0.01,P<0.01）,在GD14.5低于对照组（P<0.01）。对照组Dnmt3a启动子区Cp G岛2的甲基化水平在各时间点均高于TCDD组（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。结论:TCDD诱导的胎鼠腭发育期间Dnmt3a启动子区接近第一外显子处Cp G岛低甲基化水平可能是Dnmt3a基因在GD13.5高表达的原因,并因此形成异常的基因组高甲基化状态,进而诱发胎鼠腭裂。
关键词: 腭裂 ；动物模型 ；2,3,7,8-四氯二苯二噁英 ；C57BL/6J小鼠 ；基因组DNA甲基化 ；DNA甲基转移酶 ；十--十-一转位蛋白 ；2,3,7,8-四氯二苯二噁英 ；腭发育 ；转化生长因子β-3 ；DNA甲基转移酶 ；CpG岛 ；甲基化
被引量
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摘要： 第一部分以形态与组织学为基础筛选诱导胎鼠腭裂的TCDD最适剂量 目的：观察在饲服不同四氯二苯二噁英（TCDD）剂量的作用下，胎鼠腭裂形成过程中的形态及组织学变化，以筛选TCDD诱导胎鼠腭裂模型的最适剂量。 方法：C57BL/6J孕鼠随机分为对照组和实验Ⅰ～Ⅳ组，每组6只；妊娠第10天，对照组以玉米油0.1ml灌胃，实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别以TCDD32、28、24、20μg/kg灌胃。妊娠第17.5天处死孕鼠，称量孕鼠及胚胎体重，记录活胎鼠数、腭裂数、吸收胎及死胎鼠数。另取15只C57BL/6J孕鼠随机分组同前，处理方法同前；各组分别于妊娠第13.5、14.5和15.5天剪取胎鼠头部，解剖显微镜下观察；并行苏木精-伊红染色，观察。 结果：实验各组与对照组孕鼠增加的体重及活胎鼠体重的差异均无统计学意义(P>0.05)。实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组较对照组双侧腭突发育瘦小，上抬延迟；实验Ⅳ组双侧腭突发育及上抬与对照组相比无明显差异。实验Ⅰ～Ⅳ组胎鼠腭裂发生率分别为97.37%、93.02%、65.12%、56.82%，对照组未见胎鼠腭裂形成。 结论：TCDD28μg/kg是建立C57BL/6J胎鼠腭裂模型的最适剂量。 第二部分叶酸、白藜芦醇和α-萘黄酮对TCDD致胎鼠腭裂的拮抗作用研究 目的：进一步探讨叶酸、白藜芦醇和α-萘黄酮预防TCDD致胎鼠腭裂发生的作用并比较三种药物的效果。 方法：将孕鼠随机分为11组，每组8只。TCDD组于GD10以TCDD28μg/kg灌胃。叶酸处理孕鼠分3组：分别于GD10以叶酸15、10、5mg/kg+TCDD28μg/kg灌胃。α-萘黄酮处理孕鼠分2组：分别于GD10以α-萘黄酮5mg/kg、50μg/kg+TCDD28μg/kg灌胃；对照组以玉米油0.1ml灌胃。白藜芦醇处理孕鼠分3组：GD8～13组，以50mg/kg白藜芦醇于GD8～13灌胃6次；白藜芦醇GD8～13+TCDD组，以白藜芦醇50mg/kg于GD8～13灌胃6次，TCDD28μg/kg于GD10灌胃1次；白藜芦醇GD10+TCDD组，以白藜芦醇50mg/kg及TCDD28μg/kg于GD10灌胃；设对照组以等量羧甲基纤维素钠溶液于GD8～13灌胃及玉米油0.1ml于GD10灌胃。GD17.5处死孕鼠，称量孕鼠及胚胎体重，记录活胎鼠数、腭裂数、吸收胎及死胎鼠数；并剪取胎鼠头部，解剖显微镜下观察。 结果：TCDD28μg/kg所致胎鼠腭裂发生率为92.86%，对照组未见胎鼠腭裂形成。TCCD+叶酸15、10、5mg/kg3组致胎鼠腭裂发生率分别为84.00%、73.08%、86.00%。TCCD+α-萘黄酮5mg/kg、50μg/kg2组致胎鼠腭裂发生率分别为65.52%、74.00%。白藜芦醇GD8～13、GD8～13+TCDD组、GD10+TCDD3组致胎鼠腭裂发生率分别为0.00%、57.78%、74.51%。白藜芦醇GD8～13+TCDD组孕鼠每窝活胎数、死胎和吸收胎数，与对照组及TCDD组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；其余各实验组孕鼠体重增加量、活胎鼠体重及每窝平均胎数、每窝活胎数与对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论：试验剂量的叶酸、白藜芦醇和α-萘黄酮均有一定的拮抗TCDD诱导胎鼠腭裂发生的作用，以叶酸10mg/kg、白藜芦醇50mg/kg（GD10一次饲服）、α-萘黄酮5mg/kg剂量的拮抗作用较强，三者作用效果无明显差异。 第三部分胎鼠腭突扫描电镜观察及Rho GDI蛋白的检测 目的：观察TCDD、叶酸、白藜芦醇和α-萘黄酮作用于孕鼠后对胎鼠腭突表面超微结构及腭突组织中Rho GDI蛋白表达的影响。 方法：孕鼠随机分组，每组3只。GD10，TCDD组以TCDD28μg/kg灌胃，对照组以玉米油0.1ml灌胃；叶酸组以叶酸10mg/kg+TCDD28μg/kg灌胃；白藜芦醇组以白藜芦醇50mg/kg+TCDD28μg/kg灌胃；α-萘黄酮组以α-萘黄酮5mg/kg+TCDD28μg/kg灌胃。分别于GD13.5、14.5和15.5剪取胎鼠头部，扫描电镜观察腭突表面超微结构；免疫组化检测GD17.5胎鼠腭突组织中Rho GDI蛋白的表达。 结果：TCDD组腭中嵴上皮细胞表面逐渐破裂、皱缩，伪足结构逐渐减少、消失，最终形成腭裂；对照组、叶酸组、白藜芦醇组和α-萘黄酮组腭中嵴上皮细胞表面光滑整齐、饱满膨胀，表面丝状伪足逐渐增多、延长，一直持续到腭突融合结束。免疫组化结果显示，Rho GDI蛋白在对照组胎鼠腭突表达阳性，而在TCDD组、叶酸组、白藜芦醇组和α-萘黄酮组均表达阴性。 结论：叶酸、白藜芦醇和α-萘黄酮均能恢复小鼠腭中嵴上皮细胞表面的超微结构，从而拮抗TCDD的致腭裂效应。三种药物虽能拮抗TCDD诱导腭裂的发生，但未能显示逆转TCDD抑制Rho GDI蛋白表达的作用。Rho GDI蛋白在三种药物逆转腭突融合的过程中并未显示明显作用。
关键词: 腭裂 ；TCDD ；C57BL/6J ；小鼠 ；发育 ；叶酸 ；白藜芦醇 ；α-萘黄酮 ；TCDD ；腭裂 ；叶酸 ；白藜芦醇 ；α-萘黄酮 ；扫描电镜 ；Rho GDI
摘要： 目的:探讨转化生长因子β3（Transforming growth factor-β3，TGF-β3）在四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzodioxin, TCDD)致胎鼠先天性腭裂中的作用。
方法: C57BL/6J小鼠按雌雄各一的比例合笼过夜交配，第二日晨检查雌鼠外阴，见阴栓者记为妊娠第0天（gestational day,GD）。GD10，实验组以TCDD64μg/kg灌胃，对照组以等量玉米油灌胃。于GD18.5解剖显微镜下观察胎鼠腭裂的发生率，并于GD13.5、GD14.5和GD15.5剪取胎鼠腭突组织提取DNA、RNA及蛋白，采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western blot检测TGF-β3基因的表达情况、RT-PCR检测Smad2～4及Smad7表达情况、甲基化特异性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）检测TGF-β3基因启动子甲基化水平。
结果: TCDD可成功诱导建立C57BL/6J小鼠先天性腭裂模型，实验组腭裂发生率为100%，对照组无腭裂发生，实验组和对照组腭裂发生率具有统计学差异（P<0.05）。在GD13.5、GD14.5和GD15.5，RT-PCR及Western-blot均显示实验组TGF-β3基因表达显著高于对照组（P<0.05）。RT-PCR显示实验组和对照组Smad2～4及Smad7表达无显著差异。MSP提示实验组和对照组TGF-β3基因启动子均处于非甲基化状态。
结论:本研究证实，TCDD可致C57BL/6J胎鼠发生先天性腭裂，并显著上调TGF-β3基因在整个腭突融合过程中的表达。TGF-β3的过高表达可能是TCDD诱发先天性腭裂的主干信号通路之一，但可能并非通过经典的TGF-β/Smad信号通路和TGF-β3基因甲基化修饰而发生作用。
关键词: 腭裂 ；四氯二苯二噁英 ；转化生长因子β3
摘要： 第一部分 以iTRAQ技术分析TCDD与维甲酸致胎鼠腭裂发生的共同差异表达蛋白质 目的：运用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation;iTRAQ）技术结合质谱分析筛选2;3;7;8-四氯二苯二噁英（2;3;7;8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin;TCDD）与维甲酸致胎鼠腭裂发生的共同差异表达蛋白质。 方法：将36只孕鼠按照随机数表法随机分为3组;每组12只。分别以28μg/kg TCDD、80mg/kg 维甲酸在C57BL/6J孕鼠第10.5个妊娠日（gestational day10.5;GD10.5）灌胃;建立胎鼠腭裂模型;对照组给予等量玉米油灌胃。于GD17.5观察胎鼠腭部的解剖学及组织学改变;取 TCDD 组、维甲酸组与对照组 GD17.5 胎鼠的腭组织;从中提取总蛋白质;采用 iTRAQ 技术联合二维液相色谱-串联质谱(two-dimensional liquid chromatography/tandem mass spectrometry;2D-LC-MS/MS)分析实验组与对照组差异表达蛋白质;采用生物信息学方法分析差异表达的蛋白质功能。 结果：（1）成功建立胎鼠腭裂模型。维甲酸组与TCDD组腭裂发生率分别为98.59%、97.14%（维甲酸组vs对照组：χ2=141.05;P＜0.05;TCDD组vs对照组：χ2=136.21;P＜0.05）;腭裂表型在形态学上相似。（2） 共鉴定出2 996个差异蛋白。维甲酸组、TCDD组与对照组比较;分别筛选出差异蛋白90个、75个;实验组共有差异表达蛋白18个。（3） 对 18 个差异蛋白进行 GO 分析发现;其主要参与类固醇激素应答反应、信号转导、调节细胞周期以及细胞增殖、凋亡等生物学过程;蛋白功能交互网图显示18个差异蛋白之间存在交互作用。 结论：运用iTRAQ技术能够快速、有效地筛选TCDD与维甲酸致C57BL/6J胎鼠腭裂发生的共同差异表达蛋白;发现的差异蛋白可能与TCDD、维甲酸致胎鼠腭裂的发生密切相关。 目的：探讨 C57BL/6J 孕鼠在 2;3;7;8-四氯二苯二噁英(2;3;7;8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin;TCDD)与维甲酸致胎鼠腭裂的最适诱导剂量下;腭突组织中Annexin A1和14-3-3 sigma 蛋白及mRNA的表达情况;并探讨其在腭裂发生中可能的作用机制。 方法：取30只C57BL/6J孕鼠;随机分为对照组（10只）、TCDD组（10只）和维甲酸组（10只）;TCDD组和维甲酸组于第10.5个妊娠日（gestational day10.5;GD10.5）分别以TCDD 28μg／kg、80mg／kg灌胃1次;对照组给予等量玉米油灌胃;于 GD17.5处死孕鼠;分别提取各组胎鼠腭突组织的总蛋白及总 RNA;利用 Western blot 和Q-PCR技术检测各组胎鼠Annexin A1、14-3-3 sigma蛋白及mRNA的表达水平。 结果：? Western blot结果显示;Annexin A1蛋白表达水平在维甲酸组、TCDD 组分别高于对照组（0.98±0.31vs0.52±0.11;P＜0.05;0.99±0.34vs0.52±0.11;P＜0.05）;14-3-3 sigma蛋白表达水平在两实验组均高于对照组（0.93±0.13vs0.55±0.15;P＜0.05;0.86±0.17vs0.55±0.15;P＜0.05）。? Q-PCR结果显示：TCDD组在GD17.5;Annexin A1和14-3-3 sigma mRNA水平明显高于对照组（Annexin A1 mRNA: 0.98± 0.29vs0.74±0.27;P＜0.05;14-3-3 sigma mRNA：1.33±0.40vs0.99±0.21;P＜0.05）;维甲酸组在GD17.5;Annexin A1和14-3-3 sigma mRNA水平与对照组比较无统计学差异（ Annexin A1 mRNA:0.88±0.29vs0.74 ±0.27;P＞0.05;14-3-3 sigma mRNA:1.05±0.18vs0.99±0.21;P＞0.05）。 结论：Annexin A1、14-3-3 sigma表达异常提示;该两个蛋白参与了TCDD及维甲酸致C57BL/6J胎鼠腭裂的发生;可能是TCDD及维甲酸致胎鼠腭裂发生的共同机制之一。
关键词: 腭裂 ；差异蛋白 ；四氯二苯并-p-二恶英 ；维甲酸 ；iTRAQ技术
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