- 首页
- 产品推荐个人精选服务科研辅助服务教育大数据服务行业精选服务学科系列服务产品服务
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
- 首页
- 产品服务
- 知识脉络
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
智能检索
二次检索
任意字段
在结果中检索
在结果中去除
暂无数据
共
4
条结果 ，以下是1
-
4条
1 / 1
已选:0 清除
批量下载
批量引用
相关度
摘要： 【目的】为了提高来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的高比活木聚糖酶XynⅡ的热稳定性,对其热稳定性影响因素进行改造。【方法】对木聚糖酶XynⅡ进行同源建模和序列比较,在XynⅡ的"Ser/Thr"平面引入精氨酸的四点诱变和五点诱变,对酶的热稳定性进行改造。【结果】获得的2个突变酶在热稳定性上较野生型酶均有不同程度提高,突变酶ST4、ST5的最适温度分别由原酶的50℃提高为52和55℃。55℃保温15 min,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的20%提高为65%和75%;保温1 h,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的15%提高为50%和65%。【结论】突变酶ST4、ST5在保持了XynⅡ优良性质的基础上,进一步提高了其热稳定性,具有更好的应用价值。
关键词: 宇佐美曲霉 ；木聚糖酶 ；热稳定性 ；定向诱变 ；“Ser/Thr”平面改造
被引量
8
摘要： 木聚糖广泛存在于植物细胞壁中,是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源。木聚糖的来源不同,分枝程度不同,其主链和支链带有的基团也不同。由于木聚糖结构的复杂性,它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成。木聚糖酶（β-1,4-xylanase,EC 3.2.1.18）能够以内切方式作用于木聚糖分子中的β-1,4糖苷键产生不同长度的木寡糖和少量的木糖,因此是木聚糖降解酶中最关键的酶。
本文以1株木聚糖酶产生菌黑曲霉（Aspergillus niger）F19为实验菌株,系统地研究了黑曲霉木聚糖酶基因xynA与xynB的克隆以及在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达、重组木聚糖酶XynB的纯化及其酶学性质研究,并进行了木聚糖酶XynB的热稳定性改造,得到了SS2、ST5、SST7共3个突变体,主要结论如下:
1.xynA与xynB的克隆以及在大肠杆菌中的表达
以黑曲霉（A.niger）F19的基因组DNA为模板,根据GenBank报道的黑曲霉xynA与xynB的全序列设计两对引物,PCR扩增得到木聚糖酶基因xynA和xvnB。将不带原基因信号肽编码序列的xynA和xynB以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌（Ecoli）表达载体pET-28a（+）上,并转化E.coli BL21,获得重组工程菌BLX1和BLX2。经过IPTG诱导,XynA和XynB都获得特异性表达,XynA以包涵体和胞内可溶性蛋白2种形式存在,而XynB表达的蛋白全部以胞内可溶性蛋白形式存在。
2.木聚糖酶XynB的纯化
木聚糖酶XynB重组表达蛋白以胞内可溶性蛋白的形式存在,且木聚糖酶基因xynB是和pET-28a（+）融合表达,木聚糖酶XynB的羧基端带有6×His蛋白表达标签,所以我们用Ni-NTA亲和层析柱对木聚糖酶XynB进行了纯化,并使其纯度达到了电泳纯水平,在SDS-PAGE上呈现出清晰的单一条带。
3.木聚糖酶XynB的酶学性质分析
利用纯酶分析XynB的酶学性质,木聚糖酶XynB的比活达到13500±128.4IU/mg,其Km和Vmax分别为12.5±0.08 mg/mL,289±10.8μmol/min/mg。它的最适反应pH为5.0,在pH 4.0～7.0之间保持最高活力的75%以上。该重组酶表现出很高的pH稳定性,在pH 3.0～8.0内常温环境下放置6 h,残余酶活保持在68%以上。XynB的最适反应温度为50℃,反应温度小于30℃或大于60℃的情况下重组木聚糖酶表现出较低的活性。该酶热稳定较差,在40℃以下较为稳定,60℃以上重组酶活性下降很快,60℃条件保温30 min后残余酶活为20%。在10 mmol/L浓度下不同金属离子对酶活力的影响研究表明,Zn2+、Co2+离子对重组酶有激活作用,分别使重组酶活性提高了8%和15%,Mn2+使重组酶的相对活性降低了21%,体现出对该酶活性一定的抑制作用,其他金属离子对重组酶活性的影响不大。
4.木聚糖酶XynB的热稳定性改造
由于XynB的比活较高,但是其热稳定性较差,这在一定程度上限制了木聚糖酶XynB在工业水平上的推广应用。为了提高XynB的热稳定性,我们采用了两种定点诱变的策略:一种是将木聚糖酶表面的Ser/Thr替换为Arg,提高XynB表面蛋白的正电荷数及其电解常数以提高蛋白的热稳定性;另外一种是在木聚糖酶的非催化区域引入二硫键,使其结构更加紧密从而提高其热稳定性。将正确的突变体SS2、ST5、SST7基因xynB'构建到表达载体pET-28a（+）上,并转化BL21表达突变蛋白,但是表达的蛋白大部分形成了包涵体,而且菌体破碎液离心后的上清液没有检测出木聚糖酶活性。目前,实验室正在构建XynB野生型和突变型的高效分泌型酵母表达系统以确定定点突变对该重组酶的热稳定性影响,为该酶的大规模工业应用提供基础资料。
关键词: 黑曲霉 ；木聚糖酶 ；xynA基因 ；XynB基因 ；原核表达 ；酶学性质 ；定点诱变
被引量
11
摘要： 本文从内蒙碱湖和温泉样品中克隆了5个全长木聚糖酶基因，对来源于嗜碱Bacillussp.SN5的两个木聚糖酶基因Xyn10A和Xyn11A进行了异源表达、纯化及性质分析。对Xyn11A的催化结构域Xyn11A-LC进行了结构解析和分子改造。系统研究了11家族木聚糖酶的嗜碱机制。论文取得的主要结果有: 1.从内蒙古碱湖和温泉中分离筛选了54株产木聚糖酶的菌株，通过测定粗酶液的性质，选定4株菌Anoxybacillussp.R3、BacillusagaradhaerensDLTS1、Bacillussp.SN5和Bacillussp.CN4作为目标菌株，从中克隆了5个全长木聚糖酶基因。 2.对两个来源于Bacillussp.SN5的木聚糖酶基因Xyn10A和Xyn11A进行了表征。 Xyn10A编码348个氨基酸的多肽，分子量约40kDa。序列分析表明Xyn10A属于糖苷水解酶10家族，其氨基酸序列与来源于Paenibacilluslactis154的内切木聚糖酶相似性最高，达68％。Xyn10A在E.coliBL21(DE3)中表达，纯化后测定重组酶的性质。结果表明:Xyn10A在最适条件下(40℃，pH7.0)对beechwoodxylan的比活力为104.7U/mg;Xyn10A在25℃时具有80％的酶活，5℃时仍具有29％活性，属于低温酶;Xyn10A在含0.5MNaCl（海水的盐度）的底物中活性最高(134.5％);Xyn10A在2MNaCl中24h温育后仍具有87.4％的残余酶活。结构分析表明:Xyn10A的表面含有大量的带电荷氨基酸，尤其是负电荷氨基酸，这符合嗜盐蛋白的结构特征。冷活性和耐盐的特性使得Xyn10A在食品工业，尤其是海产品的加工中具有应用潜力。 Xyn11A基因编码366个氨基酸的多肽，包括四个部分:N-端27个氨基酸的信号肽、糖苷水解酶11家族的催化结构域、富含Gly/Pro的链接区及家族36的碳水化合物结合区(Carbohydrate-BindingModule，CBM)。完整的木聚糖酶Xyn11A和催化结构域Xyn11A-LC分别异源表达、纯化及性质比较。二者的最适温度均为55℃;Xyn11A最适pH为7.5;而Xyn11A-LC的最适pH为5.5和7.5-8.0，具有较宽的pH活性范围（在pH5.5-8.5保持80％以上的活性）。Xyn11A和Xyn11A-LC均有强的耐碱性，在pH8.5-11.0的缓冲液中37℃温浴1h后残留酶活达80％以上。与Xyn11A相比，Xyn11A-LC具有更高的热稳定性、更宽的pH活性范围以及更高的催化活性（对beechwoodxylan的比活力为4511.9U/mg）。CBM的存在影响了酶的酶学性质，提高了酶对不溶木聚糖的结合，有助于催化结构域对不溶木聚糖的降解。与其他碱性木聚糖酶相比，Xyn11A-LC具有更高的碱稳定性和更高的催化活性，但是Xyn11A-LC的最适pH和最适温度低于其他碱性木聚糖酶。 3.采用坐滴扩散法，成功获得Xyn11A-LC的高质量晶体。X-ray衍射分辨率达1.49(A)，空间群为P43，晶胞参数为a=59.4(A)，b=59.4(A)，c=153.7(A)。采用分子置换的方法，以来自嗜碱菌Bacillussp.41M-1的木聚糖酶XynJ的晶体结构(PDBcode:2DCK)为模板，解析获得Xyn11A-LC的三维结构。结构精修后的Rwork为0.196，Rfree为0.221。原子坐标和结构参数提交至蛋白质结构数据库，PDB号为4IXL。 4.通过N端引入芳香族氨基酸（T9Y和D14F），获得突变体AI2，与野生型相比，突变体的最适温度提高了5℃。在Ser/Thr表面引入5个Arg，代替对碱敏感的Ser、Thr、Asn及Gln，获得突变体ST5。与野生型相比，ST5的最适pH及温度没有明显的改变。通过定点突变Q51R、T55R和K111R，引入了Arg及离子键(D14-R51、R55-D89、R111-E125)，获得突变体SB3。突变体在碱性(pH8.0-10.0)条件下活性比野生型有一定程度的提高，在pH8.5时活性比野生型提高了18.3％。AI2和SB3的热稳定性也获得了提高，而ST5的热稳定性下降。野生型在65℃pH8.0Tris-HCl缓冲液中的半衰期为22min，AI2和SB3在此条件下的半衰期分别为106min和68min，而ST5的半衰期不到5min。 5.通过碱性、中性和酸性11家族木聚糖酶的结构比较，系统研究了11家族木聚糖酶pH相关的分子特征。 (1)、通过氨基酸组成统计分析，碱性木聚糖酶可能通过增加带电荷的氨基酸含量，降低负电荷/正电荷比值，增加疏水氨基酸亮氨酸和异亮氨酸含量，降低极性氨基酸丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸含量，实现在较高pH条件下的催化特性;酸性木聚糖酶通过降低碱性氨基酸（Arg和Lys）的含量，增加负电荷/正电荷比值，增加非极性氨基酸（Ala、Phe、Trp和Val）和极性氨基酸（Cys、Gln和Ser）含量，实现在较低pH条件下的催化特性。 (2)、碱性木聚糖酶在β6与β7之间增加一段α-螺旋替代非碱性酶中的无规则卷曲或转角，增加了局部位置的氢键数目，增加了酶的稳定性，从而有利于酶在碱性条件下发挥活性。 (3)、碱性木聚糖酶的表面氨基酸中，易降解的丝氨酸含量较少，碱性氨基酸含量高;而在酸性木聚糖酶中，表面氨基酸几乎不含碱性氨基酸，疏水性氨基酸含量较低，极性不带电荷的氨基酸和酸性氨基酸含量高。 (4)、氢键含量不影响11家族木聚糖酶的最适pH;而离子键的数量有利于11家族木聚糖酶的嗜碱性。 (5)、通过结构比较、序列比对和突变实验验证，发现了5个可能对11家族木聚糖酶在较高pH条件下发挥活性起重要作用的位点:E16、W18、N44、L46和R48（按照木聚糖酶Xyn11A-LC的氨基酸位置）。
关键词: 木聚糖酶 ；基因资源 ；分子改造 ；嗜碱机制 ；催化结构域 ；坐滴扩散法
摘要： 木聚糖酶（EC 3.2.1.8）以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键,产生不同链长的寡糖和木糖,是木聚糖降解酶系中最关键的酶。它广泛存在于各种微生物中,在饲料、造纸、食品、医药以及能源工业中有着广阔的应用前景。
根据宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001木聚糖酶（XynⅡ）N末端15个氨基酸残基序列以及真核生物mRNA在3′端存在poly（A）等序列信息,利用RACE技术扩增和克隆了相关的基因片段,获得了XynⅡ的全长cDNA序列和DNA序列,并分析了该序列的有关信息。克隆的cDNA序列、DNA序列的Genbank登录号分别为DQ114485和DQ191144。成熟肽基因推导的氨基酸序列同其他微生物来源的若干G/11族木聚糖酶相比,具有较高的同源性,属内比对,与来源于Aspergillus niger（GenBank登录号:ANU39784）的木聚糖酶同源性最高,达89%。
将XynⅡ成熟肽的cDNA序列克隆至pET-28a（+）表达载体中,在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中进行了IPTG诱导表达,木聚糖酶的比酶活最高达49.61U/mg。进而将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115和KM71,经筛选获得阳性重组菌PXGL98（Mut+）和PXKL29（Muts）。该木聚糖酶基因在2种毕赤酵母中均实现了分泌表达,工程菌发酵条件优化后,PXGL98与PXKL29发酵液中的比酶活分别可达3139.68 U/mg和3846.83 U/mg。
对木聚糖酶XynⅡ进行同源建模和序列比较,定向诱变证明在催化反应中起重要作用的氨基酸残基为Glu-79和Glu-170。研究发现第11族木聚糖酶的催化结构域在B折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点Asp-37,该位点与木聚糖酶的pH特性有关,据此设计了XynⅡ的D37N定向诱变。酶学性质分析显示,XynⅡD37N的最适pH值由4.2升高到5.3,pH稳定范围也向碱性方向偏移,由pH 3.0-7.5变为pH 3.0-9.0。这表明木聚糖酶XynⅡ的第37位Asp与最适pH值相关,为进一步的结构与功能研究提供了理论基础。
在XynⅡ的“Ser/Thr”平面引入精氨酸的四点诱变（ST4）和五点诱变（ST5）,对酶的热稳定性进行改造。获得的两个突变酶在热稳定性上比野生型酶都有不同程度的提高。突变酶ST4和突变酶ST5使酶的最适温度分别由原酶的50℃提高为52℃和55℃。55℃保温15 min,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的20%提高为65%和75%;保温1h,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的15%提高为50%和65%。该突变酶在保持了XynⅡ优良性质的基础上,进一步提高了其热稳定性,具有更好的应用价值。
关键词: 宇佐美曲霉 ；木聚糖酶 ；基因克隆 ；毕赤酵母 ；定向诱变 ；催化残基 ；最适pH ；“Ser／Thr”平面改造
被引量
22