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摘要： 本研究采用精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（Arg-Cly-，RGD）序列肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-丝氨酸四肽（Arg-Gly－Asp－Ser，RGDS），观察其对血小板聚集功能、实验性血栓形成以及对纤维蛋白溶解系统的影响。结果表明RGDS显著抑制了血小板聚集功能，一分钟聚集抑制率、最大聚集抑制率均随药物体外作用浓度增加而增加（0．05－1．0mmol／L），同时聚集速率显著下降。体内给予RGDS（8μmol/kg体重）能显著抑制颈总动脉旁路血栓形成，抑制率达到51%（P＜0．001），但此浓度对纤溶活性指标无影响。
关键词: 氨基酸类 ；血小板聚集 ；血栓形成 ；纤维蛋白
被引量
1
摘要： 阿司匹林(aspirin, ASP)和丹酚酸A (salvianolic acid A, SAA)均为抗血小板、抑制血栓形成的化合物,为了探讨二者的作用特点,本研究考察了丹酚酸A和阿司匹林在大鼠体内外抗血小板聚集作用,同时在血栓性脑缺血模型大鼠中,考察丹酚酸A和阿司匹林的抗血小板聚集及抗脑缺血作用,比较丹酚酸A和阿司匹林抗血栓作用的特点。动物福利和实验过程均遵循中国医学科学院动物伦理委员会的规定。体内外抗血小板聚集实验结果显示,丹酚酸A能够剂量依赖性地抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)和凝血酶(thrombin, THR)诱导的血小板聚集,阿司匹林在体内实验中对AA诱导的血小板聚集具有较强的抑制作用;丹酚酸A和阿司匹林对正常凝血系统的作用类似。在脑缺血大鼠模型中的血小板最大聚集率(maximum platelet aggregation rate, MAR)显示,相比于模型组[MAR_(ADP)=(41.67±4.55)%, MAR_(AA)=(53.22±2.83)%, MARTHR=(73.33±5.04)%],丹酚酸A显著抑制ADP和AA [MAR_(ADP)=(26.13±4.60)%, MAR_(AA)=(35.53±13.73)%]诱导的血小板聚集(P<0.01),而阿司匹林对AA [MAR_(AA)=(8.13±2.99)%]诱导的血小板聚集作用较强;脑缺血模型组大鼠的脑梗死体积为[(43.50±12.69)%]和脑含水量为[(82.25±0.89)%],丹酚酸A (10 mg·kg^(-1))[(10.77±7.80)%和(79.72±0.83)%]均有改善作用(P<0.01),而阿司匹林(100 mg·kg-1)未见明显作用。以上结果表明,与阿司匹林相比,丹酚酸A不仅对血小板聚集具有全面温和的抑制作用,而且对血栓引起的脑缺血具有显著的保护作用。因此,丹酚酸A对血栓性疾病的预防和治疗将具有良好的应用前景。
关键词: 丹酚酸A ；阿司匹林 ；抗血小板 ；抗血栓
被引量
26
【会议论文】 •
+6位作者
会议名称： 第九届国际分子模拟与信息技术应用学术会议(ICMS&I2018)
会议时间： 2018-05-01
摘要： 目的:重组双功能水蛭素(RGD-hirudin)是在野生型水蛭素分子的合理部位融入了Arg-Gly-Asp(RGD)序列融合在野生型水蛭素的合理部位,具有抗凝血酶、抗血小板聚集的双重功能.但是RGD-Hirudin是一种蛋白质,只能通过静脉注射给药,临床应用范围有限.以RGD-hirudin序列为基础,保留其C末端和N末端的功能氨基酸残基,利用分子模拟和同源建模技术设计具有抗凝活性的短肽(Direct Thrombin Inhibitor Peptide,DTIP),以利于皮下用药.
方法:利用同源建模和分子模拟,以RGD-hirudin的序列为基础,保留其功能氨基酸残基,借助分子模拟软件设计多肽类似物;利用毕赤酵母表达DTIP;经纯化后获得目的蛋白;利用毕赤酵母表达DTIP;经纯化后获得目的蛋白;凝血酶滴定法测定DTIP的抗凝活性;HPLC-MS测定DTIP的纯度、分子量,利用生物膜干涉技术测定凝血酶与DTIP的亲和力.在体外实验中,通过血栓弹力试验测定DTIP对血栓形成的抑制作用.大鼠皮下注射DTIP,比较给药前后部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,aPTT),凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT),凝血酶时间(Thrombin Time,TT)和凝血时间(Clotting Time)的变化.分别构建尾静脉注射肾上腺素和胶原诱导的急性肺栓塞模型和FeCl3损伤诱导的肠系膜微动脉血栓模型,研究DTIP预防血栓形成的药效学作用.
结果:利用同源建模设计出一条具有抗凝活性的短肽DTIP;DTIP抗凝比活性为7000ATU/mg,与凝血酶的亲和力为0.9μMol/L.体内和体外试验结果均显示DTIP显著延长aPTT、PT和TT,体内试验中,用药后,CT也显著延长,但不会引起出血.在急性肺栓塞模型中,DTIP显著提高小鼠存活率;在肠系膜微动脉血栓模型中,DTIP抑制血栓的形成.
结论:DTIP具有抗凝活性,且可以通过皮下注射的方式预防血栓的形成,可作为一种潜在的皮下注射直接凝血酶抑制剂进行更加深入的研究.
关键词: 直接凝血酶抑制剂 ；药物设计 ；分子模拟 ；同源建模 ；抗凝活性
摘要： 水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离纯化的一种多肽,分子量约为7 kD.它是天然存在的最专一有效的凝血酶抑制剂,无明显毒副作用,用量低,因此可作为抗栓药物用于治疗血栓性疾病[1～2].RGD序列是纤维蛋白原等粘附因子上以Arg-Gly-Asp为核心的小肽序列[3],通过与活化血小板上纤维蛋白原受体GPⅡb/Ⅲa结合而导致血小板聚集.因此外源RGD序列可通过竞争性结合该受体而阻断血小板的聚集,抑制血栓的形成[4].RGD序列与水蛭素融合可获得同时具有抗凝血酶和抗血小板聚集双功能的新型抗栓剂.本文首次报道重组水蛭素HV3与RGD序列融合蛋白基因克隆并在枯草芽孢杆菌中表达的结果.
关键词: RGD序列 ；重组水蛭素 ；枯草芽孢杆菌 ；融合蛋白基因 ；基因克隆 ；抗血小板聚集 ；纤维蛋白原 ；血栓性疾病 ；凝血酶抑制剂 ；分离纯化
被引量
6
摘要： 目的探讨自行合成的半胱氨酰-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-色氨酰-青霉胺(Cys-Arg-Gly-Asp-Trp-Pen,W2003;即Arg-Gly-Mp肽类血小板抑制剂)抗人血小板聚集和动物体内预防血栓形成的活性,并与以前报道的N^a-乙酰-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-苯乙胺(AcArg-Gly-Asp- NHCH_2CH_2C_6H_5,W2001)和N^a-乙酰-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-对甲氧基苯乙胺(N^a-Ac-Arg-Gly-Asp-p-methoxyl phenylethylamine,W2002)比较。方法用比浊法和血小板计效的方法测定二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集;用放射性配体分析法测定W2003竞争性抑制[^(125)I]纤维蛋白原(FGN)与血小板糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa的结合;用20%FeCl_3刺激Wistar大鼠的颈总动脉产生动脉血栓动物模型,以被刺激动脉段形成的血栓湿重和干重评价该化合物预防血栓形成的作用。结果W2003有明显的抑制ADP诱导血小板聚集的活性.各浓度点(150,100,50,10,1μmol/L)间与生理盐水对照组比较差异均非常显著(P<0.01);抑制[^(125)I]FGN与血小板结合的IC50值为(31.5±7.0)μmol/L;W2003与以前报道的W2001和W2002比较.预防血栓形成作用的强弱顺序为:W2003>W2001>W2002,与生理盐水比较差异显著(P<0.01)。结论W2003通过抑制FGN与GPⅡb/Ⅲa的结合而发挥抗血小板聚集和预防血栓形成的生物活性。
关键词: 血小板聚集抑制剂 ；血小板聚集 ；纤维蛋白原 ；肽类 ；糖蛋白类
被引量
2
摘要： 目的为寻找活性高的肽类血小板聚集抑制剂，我们合成了RGD（Arg－Gly－Asp）肽类似物－RGDPe（Ac－Arg－Gly－Asp－NHCH2CH2C6H5），以验证其体外抗血小板聚集活性。方法以人血为标本，采用比浊法测定血小板聚集和同位素标记方法测定其竞争性抑制125I标记的纤维蛋白原（Fgn）与血小板糖蛋白（GP）Ⅱb／Ⅲa结合的能力，并与Sigma公司合成的RGDS（阳性对照）和生理盐水（阴性对照）比较。结果RGDPe抑制125I－Fgn与活化血小板GPⅡb／Ⅲa结合的IC50＝3．64±0．55×10－5M（RGDS：6．03±1．24×10－5M），抗ADP诱导的血小板聚集IC50＝76．42±55．42μM（RGDS：114．67±40．55μM）。结论RGDPe有较强的抑制血小板聚集活性，可能在体内有预防血栓形成功效。
关键词: 纤维蛋白原 ；RGD肽类似物 ；血小板聚集 ；抑制剂
被引量
3
摘要： 背景:心脑血管疾病是目前世界上影响人类健康的第一大杀手。心脑血管疾病发生与病理性的血栓形成有关。在病理条件下,血小板暴露于可溶性激动剂（如凝血酶、ADP和血栓烷A2）并粘附到血管内皮下基质蛋白。这些粘附蛋白和激动剂,刺激细胞内信号转导级联反应,从而导致血小板粘附受体整合素αIIbβ3从静止状态转变为活化状态,使整合素αIIbβ3与纤维蛋白原RGD（Arg-Gly-Asp）基序结合,从而进一步引起血小板聚集。已有研究报道,模拟RGD基序的多肽对活化的血小板具有高亲和力,为预防和治疗血栓性疾病提供新的思路和方法[1]。本课题组曾研发含有RGD的小肽RWR,其具有作用特异、靶向性强、毒副作用小等特点。但在后来的药代动力学研究中发现,RWR化学性质不稳定,半衰期较短。曾有报道含有KGD（Lys-Gly-Asp）的Barbourin蛋白对于整合素αⅡbβ3具有高度的选择性。本研究旨在利用KGD序列更强结合血小板表面αIIbβ3且能够有效抑制血小板聚集的特性,设计一种含有KGD的小肽,在此基础上根据国家创新药物指导原则初步进行临床前研究。目的:1.设计并合成一种含有KGD的小肽ωKWR。2.通过体外、体内实验探究其对血小板聚集和血栓形成的影响。3.根据治疗用生物制品非临床安全性评价指导原则对ωKWR进行药理、毒理学研究。方法:1.ωKWR的设计与固相合成固相合成法合成ωKWR,合成中用Fmoc/t-Bu保护侧链与N端;通过C18反向高效液相色谱进行分离纯化,电离喷雾离子化质谱鉴定纯度,真空冷冻干燥得到冻干粉。2.ωKWR的一般药效学研究家兔耳缘静脉取血后室温下离心制备富血小板血浆（PRP）,检测ωKWR对体外血小板聚集的影响;体外凝块回缩实验,分析ωKWR在体外抑制血栓生成作用;Collagen-Epinephrine诱导小鼠急性肺栓塞模型,研究ωKWR体内抑制血小板聚集作用;小鼠尾部出血时间测定,测定ωKWR对小鼠尾部生理性止血影响。3.ωKWR毒理学研究一次给予小鼠ωKWR（200 mg/kg）进行急性毒性实验,观察14天内小鼠死亡情况,测定ωKWR的LD50。SD大鼠连续尾静脉给药30天,每日观察记录其一般状况,每周测体重和进食量一次,于最后一次给药后24h处死动物;进行血常规、生化指标以及主要脏器病理组织学检测,分析ωKWR亚急性毒性大小。采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验与小鼠精子畸形实验,探究ωKWR对遗传物质与生殖系统毒性大小。结果:1.采用固相合成法制备ωKWR,经C18反向高效液相色谱法纯化后真空冷冻干燥得纯度大于95%的纯品。后经电离喷雾离子化质谱（ESI-MS）鉴定进行验证。2.体外血小板聚集实验探索ωKWR最有效浓度为20μmol/l,肺栓塞模型和凝块回缩实验证实ωKWR在体内外均有良好的抑制血栓形成效果。尾部出血时间和凝血时间表明ωKWR在有效浓度范围内不引起正常生理性止血时间的增加。3.急性毒性实验结果显示在ωKWR给药浓度达到有效浓度1000倍时仍然无明显中毒现象。亚急性毒性结果显示连续给予ωKWR后实验动物各脏器和生化指标与对照组相比均无明显异常。致畸性和生殖毒性实验表明骨髓微核率和精子畸变率与对照组相比P值均大于0.05。结论:1.固相合成法制得ωKWR冻干粉针经测定纯度符合要求,结构准确。2.体内外实验表明ωKWR具有明显抑制血小板聚集效果,从而有效抑制血栓形成且这种效果不影响正常的生理性止血功能。3.毒理学实验测得ωKWR不会引起机体毒性反应染色体畸变具有较高的安全性。
关键词: KGD ；血小板 ；ωKWR ；血栓 ；毒理学
【专利/发明】 • CN201210173582.4 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2013-12-18
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450336A
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Lys-Arg-Gly-Asp-Val，Lys-Arg-Gly-Asp-Phe和Lys-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Lys-Arg-Gly-Asp-Val，Lys-Arg-Gly-Asp-Phe和Lys-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
【专利/发明】 • CN201210173582.4 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2015-07-08
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450336B
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Lys-Arg-Gly-Asp-Val，Lys-Arg-Gly-Asp-Phe和Lys-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Lys-Arg-Gly-Asp-Val，Lys-Arg-Gly-Asp-Phe和Lys-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
【专利/发明】 • CN201210176629.2 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2013-12-18
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450339A
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Leu-Arg-Gly-Asp-Val，Leu-Arg-Gly-Asp-Phe和Leu-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Leu-Arg-Gly-Asp-Val，Leu-Arg-Gly-Asp-Phe和Leu-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
【专利/发明】 • CN201210173600.9 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2015-09-09
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450334B
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Arg-Gly-Asp-Val，Arg-Gly-Asp-Phe和Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD四肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Arg-Gly-Asp-Val，Arg-Gly-Asp-Phe和Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD四肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
【专利/发明】 • CN201210173631.4 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2015-08-05
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450337B
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Thr-Arg-Gly-Asp-Val，Thr-Arg-Gly-Asp-Phe和Thr-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与TRGD肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Thr-Arg-Gly-Asp-Val，Thr-Arg-Gly-Asp-Phe和Thr-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与TRGD肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
【专利/发明】 • CN201210173600.9 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2013-12-18
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450334A
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Arg-Gly-Asp-Val，Arg-Gly-Asp-Phe和Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD四肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Arg-Gly-Asp-Val，Arg-Gly-Asp-Phe和Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD四肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
【专利/发明】 • CN201210173631.4 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2013-12-18
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450337A
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Thr-Arg-Gly-Asp-Val，Thr-Arg-Gly-Asp-Phe和Thr-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与TRGD肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Thr-Arg-Gly-Asp-Val，Thr-Arg-Gly-Asp-Phe和Thr-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与TRGD肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
【专利/发明】 • CN201210176629.2 •
+1位作者
•
申请日：2012-05-29,
公开日：2015-07-08
申请人： 首都医科大学
公开（公告）号： CN103450339B
摘要： 本发明公开了通式1的(R代表Leu-Arg-Gly-Asp-Val，Leu-Arg-Gly-Asp-Phe和Leu-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物，以及它们的杂环核(R代表OH)，公开了它们的制备方法，还公开了它们的体外抗血小板聚集作用，进一步公开了它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓作用。结果表明，本发明的通式1的(R代表Leu-Arg-Gly-Asp-Val，Leu-Arg-Gly-Asp-Phe和Leu-Arg-Gly-Asp-Ser)咔啉并六氢吡嗪-1，4-二酮与RGD肽的三种新型缀合物以及它们的杂环核(R代表OH)具有良好的抗血栓活性，在抗血栓剂的制备中有明确的应用前景。
会议名称： 首都医科大学第三届研究生学术论坛
会议时间： 2015-12-12
摘要： 血栓疾病一直是全球发病率和死亡率的主要原因。在前期抗血栓药物的研究中,发现了三个由Cu2+和重复的精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)-天冬氨酸(Asp)(RGD)序列组成的配合物： Cu(Ⅱ)-Arg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly-Asp-Ser (Cu[Ⅱ]-4a), Cu(Ⅱ)-Arg-Gly-Asp-Val-Arg-Gly-Asp-Val (Cu[Ⅱ]-4b),和Cu(Ⅱ)-Arg-Gly-Asp-Phe-Arg-GlyAsp-Phe (Cu[Ⅱ]-4c),研究发现,Cu(Ⅱ)-4a体外活性最好,Cu(Ⅱ)-4c体内抗血栓活性最好。从透射电子显微镜(TEM)中可以直观的看到,Cu(Ⅱ)-4a和Cu(Ⅱ)-4c分别可以形成纳米聚合物和纳米颗粒。然而,纳米配合物的形成与抑制血栓形成的机制仍有待探索。为此,本研究设计了一种新型的Cu(Ⅱ)和RGD序列八 肽Arg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-AspSer(RGDFRGDS)形成的配合物,结构上包含Cu(Ⅱ)-4c中的Arg-Gly-Asp-Phe序列和Cu(Ⅱ)-4a中的Arg-Gly-Asp-Ser序列,设计上综合了它们的生物活性和纳米结构的优势。 与Cu(Ⅱ)-4a,Cu(Ⅱ)-4b,Cu(Ⅱ)-4c相比,Cu(Ⅱ)-RGDFRGDS (Cu2+-FS)有 更优秀的抗血小板聚集和抗血栓的活性,并且形成了表面有多孔洞的纳米颗粒。此外,本文证明了Cu2+-FS在水溶液中以二聚体形式存在,并用计算机模拟了Cu2+-FS纳米颗粒的形成过程;结果表明Cu2+-FS具有降低血浆中GPⅡb/Ⅲa,P-selectin和IL-8的含量,从而具有抗血栓的作用。最后,粘附到细胞表面,然后进入细胞质中,经过一个两步的过程Cu2+-FS纳米颗粒阻止血小板的激活。结果表明,Cu2+-FS的抗血小板聚集的活性比RGDFRGDS高10-52倍,并且抗血栓作用的有效剂量比RGDFRGDS低5000倍。
会议名称： 首都医科大学第三届研究生学术论坛
会议时间： 2015-12-12
摘要： 血小板表面糖蛋白p-选择素和GPⅡb/Ⅲa受体与分别血小板-纤维蛋白-白细胞血栓和血小板-纤维蛋白-血小板血栓的形成有关联.在目前的研究中,以N-(3S-四氢异喹啉-3-羰基)-Thr-Ala-Arg-Gly-Asp-(Phe)-Phe(IQCA-TAFF) 作为模型化合物,在分子建模、合成和作为一个新的抗血栓形成药物的评价系统进行了研究.IQCA-TAFF是通过3S-四氢异喹啉-3-羧酸(IQCA)和Thr-Ala-Arg-GlyAsp-(Phe)-Phe(TAFF)进行偶合得到的.分子模型结果表明IQCA-TAFF能够分别利用其IQCA部分占据P-选择素的活性部位的口袋,通过TAFF部分阻断的GPⅡb/Ⅲa受体的纤维蛋白原结合位点.这些都与P-选择素和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的表达的双重抑制相一致,也与IQCA-TAFF的体外抗血小板聚集活性相一致.此外,P-选择素和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的双重抑制导致IQCA TAFF具有显著体内效力,分别比IQCA和TAFF高500倍.透射电子显微镜(TEM)图像表明,在水溶液中IQCA-TAFF浓度依赖性的形成纳米球的形态.本文建立了一个涵盖分子模型、体外生物活性测定、体内生物活性测定、作用机理研究,以及纳米图像研究共同构成一个用以来表征能够同时抑制P-选择素和GPⅡb/Ⅲa受体介导的血栓形成的抗血栓药物的模型系统.
摘要： 研究背景： 由遗传基因突变参与的凝血机制异常,有研究认为遗传基因突变多于30%的个体参与了深静脉血栓的发生发展过程。对这类基因多态现象的研究已经成为热点,特别是与人类血管性常见疾病——深静脉血栓之间的关联性已做了相当深入的研究：发现越来越多的基因多态现象参与了凝血机制的调节,并与静脉血栓的形成构成相关性。近年来已有报道PECAM-1基因与动物小鼠DVT的关系研究,并得出其与血栓严重程度相关的研究结果。血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)已确定11个单核苷酸多态性(SNP),目前PECAM-1基因只有3个SNP被发现与疾病有关,即Leul25Val, Asn563Ser,ly670Arg。为了进一步探索PECAM-1基因与临床深静脉血栓患者的相关性,我们从基因水平研究了其多态现象对静脉血栓易感性的影响(第一部分)；同时借助动物实验,进一步探索了PECAM-1在协助气体信号分子H2S抗血栓形成中的作用机制(第二部分)。本课题以临床病例为基础,利用动物实验的特别优势,采用可靠的试验方法对血栓的发生发展涉及到的PECAM-1分子机制进行了深入探讨,以期得到一些对深静脉血栓诊治具有更多帮助的研究成果,而这方面的研究目前国内外尚未见报道。 通过文献检索,PECAM-1基因Leul25Val多态性多有报道与动脉粥样硬化性疾病如冠心病、心肌梗死相关性的研究文章,但研究结果并不一致,为了从循证医学(EBM)的角度明确PECAM-1基因Leul25Val多态性与某些血管性疾病是否具有关联关系,我们对此进行了荟萃分析(第三部分),作为文献综述的补充,以期进一步了解该基因与临床已知易感疾病的范围。 第一部分PECAM-1基因Leu125Val多态性对深静脉血栓易感性影响的研究 深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)又称静脉血栓栓塞症(VTE)。深静脉血栓和肺栓塞被认为是同一疾病的两个不同阶段。深静脉血栓是一种临床常见疾病,年发病率在千分之一以上。下肢深静脉血栓如不能得到及时有效的治疗,常会演变为深静脉血栓后综合征(PTS),严重影响患者生活质量。DVT被认为是遗传、环境及行为活动共同作用的结果。有研究表明,血小板在内皮细胞的黏附是启动和促进静脉血栓形成的关键环节。当血管内膜损伤时,血小板通过快速聚集和黏附在损伤部位使受伤内膜得以修复。目前关于细胞粘附分子与深静脉血栓形成的关系机制尚未完全了解,细胞粘附分子特别是血小板内皮细胞粘附分子-1的作用正成为研究热点。 PECAM-1是分子量达130-kDa的细胞表面糖蛋白,又名CD31,属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族成员。PECAM-1主要功能是介导内皮细胞间及细胞与细胞外基质间的黏附；介导内皮细胞与白细胞间的黏附；介导细胞内外的信号转导、血管炎症反应以及白细胞跨内皮迁移,并与其它黏附因子之间发生受体配体反应,继而对血小板的聚集、活化与释放功能,对原发或继发血栓的形成和发展产生影响。有实验表明,PECAM-1基因敲除小鼠DVT模型显示出更大的血栓和更长的血栓消退时间,具有更高水平的血浆sPECAM-1者则出现血栓溶解的明显延迟。 目的与方法 本研究通过病例-对照设计,采用聚合酶链反应—限制性片断多态性技术同时检测了PECAM-1Leul25Val、Asn563Ser、Gly670Arg三个多态位点的组间分布,用酶联免疫吸附方法测定相应个体血浆sPECAM-1水平。结合彩超检查评分首次探讨了sPECAM-1三种基因特别是基因型Leul25Val多态性位点及其血浆sPECAM-1水平与深静脉血栓发生发展的关系,目的探索预测和防治DVT的新方法,为DVT高危个体的早期筛查提供新的遗传标记。 结果 通过研究分析DVT组和对照组PECAM-1Leul25Val, Asn563Ser,及Gly670Arg基因频率和等位基因频率,DVT组多态性位点Leul25Val基因型Leu/Leu、Leu/Val、Val/Val频率分别为12.2%、47.8%、40.0%,等位基因频率Leu、Val分别为36.1%、63.9%；对照组相应基因型频率为24.0%,53.9%,22.1%,相应等位基因频率为51.0%、49.0%；方差分析表明Leul25Val基因型频率与等位基因频率的多态性比较有显著不同(P<0.01)；DVT组Leul25Val基因型及等位基因明显高于对照组(X2=10.25, P<0.01; X2=9.85, P<0.01)。同时,进一步研究发现与基因型Leu/Leu比较,基因型Val/Val与DVT的风险增加相关最为明显(OR=3.57;95%CI,2.47-5.16, P=0.008)。而多态性位点Asn563Ser和Gly670Arg基因型频率及等位基因频率显示在DVT组与对照组之间则无统计学意义(P>0.05)。提示PECAM-1多态位点Leul25Val基因型特别是Val/Val与DVT患病风险具有明显关联性。 通过ELISA法检测DVT组和对照组患者血浆sPECAM-1水平,发现DVT组血浆sPECAM-1水平(83.4±23.5ng/m1)明显高于对照组(60.4±19.4ng/m1)(P<0.01)。进一步分析两组Leul25Val基因型Leu/Leu、Leu/Val和Val/Val的血浆sPECAM-1水平,单因素方差分析显示,DVT组Leul25Val基因型纯合子Val/Val的血浆sPECAM-1水平及其杂合子Leu/Val血浆sPECAM-1水平显著高于基因型纯合子Leu/Leu血浆sPECAM-1水平(p<0.01)。而两组Val/Val基因型血浆sPECAM-1水平也分别高于同组Leu/Val基因型血浆sPECAM-1水平(p<0.05)。 彩超压缩试验评估患者在诊治初期及治疗后28天血栓负荷,显示Leul25Val基因型纯合子Val/Val的血栓基线得分明显高于Leu/Leu与Leu/Val基因型。DVT患者治疗28天后,Leu/Val与Val/Val基因型⊿血栓分数(血栓分数基线-第28天的血栓分数)明显低于Leu/Leu基因型,这能进一步说明等位基因Val可能引起了DVT患者血栓的延迟溶解。 结论 PECAM-1Leul25Val基因型Leu/Leu、Leu/Val和Val/Val与DVT患病风险具有关联性(p<0.05)。与等位基因125Leu比较,等位基因125Val与DVT的风险增加相关性更明显(p<0.01)。DVT患者组比健康人群具有更高的血浆sPECAM-1水平,而且Leu/Val及Val/Val基因型还表现出了血栓负荷的增加及血栓溶解的延迟。因此推断,PECAM-1基因多态性位点Leul25Val可能是DVT发生发展的关键影响因素之一。 第二部分PECAM-1基因参与H2S抗血栓作用的实验机制研究 深静脉血栓形成(DVT)是由于细胞黏附分子介导的炎症细胞聚集并黏附于血管内皮,继而激活血小板聚集引起的。血小板在内皮细胞的黏附依赖于血小板与单核细胞、中性粒细胞之间的相互作用,作为促进静脉血栓形成的关键环节,这些相互作用常依赖于众多细胞粘附分子的调控。 血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)是一种细胞表面糖蛋白(又名CD31),又是一种具有众多生物学调控作用的信号分子。PECAM-1具有强烈的抑制血小板聚集并能引起抗血栓形成的作用；在内皮细胞中,PECAM-1还具有抗炎症反应的作用,而炎症反应则能促进血液的高凝及血管通透性的增强,导致血栓形成。实验证实,PECAM-1基因敲除小鼠显示出了更大的动静脉血栓和更长的血栓消退时间,表明了PECAM-1在抑制血栓形成中的重要地位。硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)也是一种具有广泛生理药理调控作用的气体信号分子。硫化氢同样具有抑制炎症反应、抑制血小板和血栓形成的作用。 研究目的 本研究通过体外血小板聚集功能试验和DVT小鼠模型旨在探索PECAM-1是否参与了硫化氢抗血小板聚集和血栓形成的作用。应用一氧化氮(nitric oxide,NO)合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)探明这些作用是否依赖于一氧化氮信号通路；同时,为了研究硫化氢对PECAM-1的调控作用,通过小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)的帮助,进一步探寻PECAM-1在硫化氢抗血小板聚集及血栓形成中所扮演的角色。这些实验研究可为提高血栓性疾病的临床诊治水平提供理论支持。 实验方法 1.血小板聚集实验 对应用多板(Multiplate)阻抗集合度测定法(impedance aggregometry)实施血小板聚集实验。采集的人新鲜全血经洗涤、计数后,与硫化氢供体硫氢化钠(sodium hydrogensulfide, NaHS)在37℃孵育5分钟并不停搅拌。加入不同的诱导剂进行血小板聚集实验,如花生四烯酸(arachidonic acid, AA,0.5mmol/L),凝血酶受体活化肽(thrombin receptor-activating peptide, TRAP,32μmol/L),腺苷二磷酸(ADP,6.5μmol/L),或胶原(collagen,3.2μg/mL)。加NaHS的同时加入L-NAME (10μmol/L),观察NaHS的作用是否是一氧化氮依赖性的。 2.流式细胞仪检测纤维蛋白原(fibrinogen)结合力 NaHS处理的全血与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的纤维蛋白原抗体孵育20分钟,流式参数由FACSCalibur装置获取,数据采集自5000个细胞,由CellQuest专业软件(Version3.3; BD Biosciences)进行分析。 3.动物血栓模型的建立 60只C57BL/6小鼠随机分为3组,分别给予生理盐水(对照组),NaHS (10mmol/kg body weight), NaHS+L-NAME (100mg/kg body weight).用蚊式血管钳分三段各钳夹股静脉1次,每次持续3秒。造模后48小时后切开皮肤,观察股静脉血栓是否形成,严重程度以及是否消退。取出股静脉内的血栓并称重。切去股静脉及其属支,用生理盐水冲洗后置液氮冷冻。 4. Western blot分析 解冻的血管内皮或人全血用冷PBS缓冲液洗涤,裂解蛋白并定量,经10%SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜上。封闭后加入1：1000稀释的一抗(兔抗小鼠eNOS,iNOS和PEC AM-1抗体,小鼠抗人PEC AM-1和Phospho (Ser473) AKT抗体),β-actin作为内参照,室温孵育1h,经TBST洗涤后再加入相应的1：1000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗小鼠IgG),室温孵育1h,洗涤后进行化学发光显色、曝光。胶片扫描后,经Image J图像分析软件进行灰度分析 5.小干扰RNA(siRNA) 针对PEC AM-1基因设计一个特异性的siRNA,应用脂质体转染HUVECs细胞。转染后48小时,Western blot分析PEC AM-1蛋白含量,观察基因抑制效果。 6.血小板粘附活性试验 人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞用来研究经硫化氢处理的血小板的粘附能力。细胞接种于涂有明胶的盖玻片上,并生长铺满。经洗涤过的ADP活化的人血小板悬液滴于盖玻片并孵育。用PBS溶液洗去未结合的血小板,3.7%多聚甲醛固定后结晶紫染色,在光学显微镜下观察、拍照。视野下计数粘附有血小板的HUVECs细胞,并计算其与总HUVECs细胞数的比例。 结果 1.硫化氢抑制血小板功能 NaHS能以浓度依赖方式,分别抑制由花生四烯酸,凝血酶受体活化肽,腺苷二磷酸和胶原诱导的血小板聚集。L-NAME能显著减弱NaHS对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用。NaHS能以浓度依赖方式降低ADP刺激的纤维蛋白原结合力。 2.硫化氢显示抗血栓活性 与对照组DVT小鼠相比相比,NaHS组的静脉血栓发展更慢,在钳夹后48小时血栓体积显著小于对照组。
关键词: 深静脉血栓(DVT) ；血小板黏附因子-1(PECAM-1) ；单核苷酸多态性(SNP) ；基因多态性(polymorphism) ；深静脉血栓形成 ；血小板内皮细胞黏附分子-1 ；硫化氢 ；一氧化氮 ；血小板内皮细胞黏附分子-1 ；基因多态性 ；动脉硬化 ；荟萃分析
被引量
2
摘要： 目的：
1、设计一种新型的小肽RWR。
2、观测RWR对血小板聚集及血栓形成的影响。
3、探索RWR通过αIIbβ3抑制血栓形成的机理。
4、验证RWR的抗栓效果，为含RGD抗栓药物的研发提供理论依据。
方法：
1、RWR小肽的设计与合成
利用Fmoc固相法合成化学方法合成RWR，在RGD基础上，增加一个疏水性氨基酸和一个碱性氨基酸，序列特征为Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，蛋白质一级结构为RGDWR，课题组将这种新的化合物命名为RWR，该小肽具有RGD结构，理论上具备通过血小板表面整合素αIIbβ3受体从而与血小板特异结合的能力。
2、RWR对血小板聚集的影响的体外量效关系
利用血小板聚集仪检测不同浓度RWR对血小板最大聚集率的影响。将家兔全血分离为PRP和PPP，用PPP校零后，在PRP管中加入相同剂量的血小板聚集诱导剂ADPNa2，再加入不同浓度的RWR，检测5min内的血小板最大聚集率。用同样的方法检测RWR对人血小板聚集率的影响。
3、RWR与替罗非班（tirofiban）、阿司匹林（aspirin）等传统药物相比较，作用于家兔血小板聚集率
分别用不同浓度的替罗非班和阿司匹林作用于体外分离出的血小板，计算出两者的半数有效抑制浓度（IC50），与我们合成的RWR药物的IC50相比较，观察RWR的作用强弱。
4、RWR对血小板聚集率影响的体内时效关系
给药前心脏取血测量血小板聚最大集率，将RWR耳缘静脉注射后，0h,0.25h,0.75h,1h,2h分别心脏取血，分别测量血小板最大聚集率。观察RWR在体内的代谢时长以及其作用时效。
5、RWR对血栓形成的影响
利用家兔动静脉血栓旁路循环模型和大鼠三氯化铁血栓模型研究RWR对血栓形成的影响。两种模型分别通过血栓重量和血栓内部结构变化分析RWR的作用效果。
6、RWR对血液中cGMP含量的影响
通过酶联免疫试剂盒来测定血液中cGMP的含量，了解血栓的变化，反映RWR的作用效果。
结果：
1、质谱分析证实RWR序列正确，高效液相色谱提示RWR的纯度97.06%。
2、血小板聚集实验显示随着RWR的浓度增大，血小板最大聚集率逐渐降低。RWR较阿司匹林、替罗非班抗血小板聚集活性强。且与家兔血小板相比较，RWR对人血小板聚集率作用效果更显著。
3、兔子动静脉旁路循环实验表明，随着RWR浓度的增大，血栓重量逐渐减小且其作用较替罗非班强。大鼠三氯化铁血栓模型显示随着RWR的浓度增大，血管内的腔隙变小。
4、随着给药浓度RWR的上升，血浆中cGMP的含量逐渐增大。
结论：
1、合成全新小肽RWR，结构与设计相符。
2、血小板聚集实验证实RWR在体内外均具有明显抑制血小板聚集的特性，且与传统抗栓药物阿司匹林和替罗非班相比，RWR抗血小板聚集效果更强。
3、两种血栓模型实验证实RWR可以抑制血栓形成,且其对血栓重量的影响较替罗非班强，血浆中cGMP含量增大，验证了RWR抗血栓的效果。
关键词: RGD ；小肽 ；合成 ；血栓 ；cGMP
被引量
1
摘要： 随着人们生活水平的不断提高及社会老龄化问题的日益严重,心脑血管血栓性疾病发病率和致死率非常高,是中老年人的常见病和多发病,严重威胁人类的健康。临床上常见的急性心肌梗塞、脑血栓和弥漫性血管内凝血(DIC)多数为动脉血栓,是致死或致残的主要原因之一；血液凝固异常是这一类疾病的发生、蔓延及干预中最为关键的环节。
血栓性疾病在急性发病前需及早干预治疗,发病后经溶栓治疗,需要长期用药,预防血栓再次形成而复发。肝素和维生素K是临床上常用的抗凝治疗药物,已有近百年的历史。然而,在临床使用过程中,不断地发现肝素、维生素K等用于抗凝治疗时会引发不良反应,限制了它们的使用范围。而凝血酶作为血液凝固的关键因子,成为临床上预防血栓形成的重要靶点。
水蛭素是特异性的凝血酶抑制剂,并且是一种直接凝血酶抑制剂(direct thrombin inhibitors, DTIs),临床上用于防治血栓疾病,有着重要的应用价值。我们实验室研制、开发了重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin),中国发明专利“一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用”已授权,专利号：ZL01105798.X。RGD-Hirudin是在野生型水蛭素分子的合理部位融合了Arg-Gly-Asp (RGD)三肽,使这种水蛭素衍生物既保留了抗凝血酶活性,又增加了抑制血小板聚集的活性,具有降低血黏度,抗栓、防栓等作用。经过药效学研究证明用于血管吻合术后抗凝治疗,疗效优于野生型水蛭素和肝素。但是RGD-Hirudin是一种蛋白质/多肽类药物,只能通过静脉注射的给药方式用药,临床应用范围有限。
目前,已有四种注射用DTIs及一种口服DTI成功用于临床。然而,这些药物的临床适应症状单一,每种DTI都针对特定的病症,且治疗费用昂贵。所以,开发新型DTIs(包括注射和口服给药方式)无论在治疗和预防血栓栓塞疾病方面还是在经济效益方面都具有极为广阔的前景。
本项研究的主要目的是从重组双功能水蛭素的结构和功能研究入手,发现其与凝血酶相互作用的重要位点,阐明两者相互作用机制,对双功能水蛭素作进一步的改造,设计和研制具有抗凝活性的小分子多肽,用于开发口服或皮下注射的抗凝防栓药物。
本论文研究内容主要包括四个部分：
1.利用毕赤酵母表达系统,通过高密度发酵的方法,采用适当纯化方案,以13C甘油、13C甲醇分别为生长阶段和诱导阶段提供碳源；以15N硫酸铵为氮源,对RGD-hirudin作15N/13C均一标记,经发酵和纯化,获得15N/13C全标记RGD-hirudin,对其纯度、分子量及生物学活性进行了鉴定,为深入开展构效关系研究打下了良好的基础。
2.利用多维核磁共振技术,对15N/13C均-标记的RGD-hirudin作了1D’H谱,3D CBCA(CO)NH谱,3D CBCANH谱,3D HNCO谱,2D1H-15N HSQC谱的测定,并对骨架共振信号进行了归属指认。利用化学位移扰动实验研究了15N/13C均匀标记的RGD-hirudin与凝血酶的相互作用位点,明确了RGD-hirudin的关键氨基酸残基位点。
3.利用同源建模的方法模拟了RGD-hirudin的全长结构,通过分子对接的方法得到RGD-hirudin与凝血酶复合物的模型结构,结合NMR化学位移扰动实验的结果,对RGD-hirudin与凝血酶的相互作用进行了深入的分析。为了验证复合体模型的准确性,进一步对两者相互作用过程中,与凝血酶形成氢键的RGD-hirudin氨基酸残基进行了虚拟丙氨酸扫描,分析突变体稳定性及合理性。利用重组DNA技术,将计算机模拟得到的关键氨基酸残基作丙氨酸单点突变,获得了6个RGD-hirudin的突变体。测定了这些突变体的抗凝活性和抗血小板聚集的活性；利用表面等离子共振实验(SPR)分别测定了RGD-hirudin和这些突变体与凝血酶相互作用的亲和力。确认RGD-hirudin与凝血酶相互作用关系,即RGD-hirudin的C-末端与凝血酶exosites I结合,N-末端与凝血酶活性位点结合,抑制凝血酶活性。
4基于RGD-hirudin的结构功能研究结果,以RGD-hirudin的序列为基础,保留其与凝血酶结合的功能氨基酸残基,借助分子模拟软件(Discovery Studio3.0)设计了两条具有抗凝活性的小分子短肽。以毕赤酵母为宿主菌表达上述短肽肽,纯化后测定抗凝血酶活性,HPLC测定纯度,MS测定分子量,结果显示两条短肽具有抗凝活性,分子量分别为3925.5247Da(35肽)和4024.5459Da(36肽)。
关键词: 毕赤酵母 ；水蛭素 ；重组双功能水蛭素 ；凝血酶 ；核磁共振 ；计算机 ；模拟 ；表面等离子共振
被引量
1
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