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摘要： 采用Fmoc固相多肽合成中的活化酯方法和2,6-二氯苯甲酰氯(DCB)混合酸酐法,对Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH与Wang树脂反应中的反应级数和表观活化能进行了研究,并采用常规方法和微波强化方法分别进行了胸腺五肽的合成.实验结果表明,活化酯方法的反应级数为1.855,表观活化能15.24kJ/mol,混合酸酐法的表观活化能为35.14kJ/mol.与传统方法相比,微波将缩合反应速率提高了30倍以上,氨基酸过量倍数也从传统的三倍降低到两倍.
关键词: 微波强化 ；固相多肽合成 ；胸腺五肽 ；反应级数 ；表观活化能
被引量
12
【专利/发明】 • CN202110329179.5 •
+3位作者
•
申请日：2021-03-27,
公开日：2021-07-02
申请人： 上海化工研究院有限公司
公开（公告）号： CN113061174A
摘要： 本发明涉及一种稳定同位素氘标记β‑乳球蛋白特征肽段及其制备方法，肽段的分子结构式为HO‑Lys‑Asn‑Glu‑Asn‑Leu‑Ala‑Asp‑Ile‑NH2，其中稳定同位素氘标记的氨基酸为Lys‑D8、Leu‑D6或Ile‑D8的一种或更多种；制备时，采用固相合成多肽方法，以wang树脂及Fmoc保护的稳定同位素氘标记或非标记赖氨酸Fmoc‑Lys(Boc)‑OH为起始原料，在缩合剂的作用下偶合反应得到wang‑Lys(Boc)‑NH2，之后依次与三肽OH‑Asn‑Glu(OtBU)‑Asn‑Fmoc、亮氨酸Fmoc‑Leu‑OH、二肽OH‑Ala‑Asp‑Fmoc、异亮氨酸Fmoc‑Ile‑OH在缩合剂的作用下进行偶合反应，再经后处理即可。与现有技术相比，本发明既能够有效地对β‑乳球蛋白特征肽段IDALNENK进行标记，满足检测过程中特征离子碎片的需求，又提高了贵重氘标记氨基酸试剂的原子利用率，降低了生产成本，且有效地提高反应收率及合成效率。
会议时间： 2014-10-25
摘要： 目的:研究使用Wang树脂与Fmoc保护策略固相合成抗凝血药比伐芦定(bivalirudin)的工艺。方法:比伐芦定的合成经过了逐步偶联、脱保护、TFA裂解、HPLC纯化等一系列步骤。为了优化反应条件,选择了不同的反应溶剂、不同氨基酸替代度的树脂和不同裂解方式进行试验。结果:成功得到了纯度为98%的比伐芦定。试验结果表明:1采用DMF单一溶剂作为反应溶剂时,困难氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联不完全,纯度均较低;2采用DMF/DMSO混合溶剂时,未出现氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联不完全的现象,反应终点易控制;○3高载量的氨基酸Wang树脂的应用,节约了成本,降低的废液废气的排放。本研究为比伐芦定的大量合成具有一定的指导作用。
关键词: 凝血酶 ；固相合成 ；比伐芦定 ；混合溶剂 ；高载量
会议时间： 2014-11-07
摘要： 目的:肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征。TMTP1（NVVRQ）是利用细胞表面展示系统,通过FliTrx库筛选高转移前列腺癌PC-3M-1E8来得到的,它被证明可以特异性靶向各种高转移性的肿瘤细胞。我们设计合成NOTA-TMTP1,利用[F]A1F的方法标记NOTA-TMTP1,其结构如图1所示,得到特异性靶向高转移肿瘤的PET探针。方法:利用多肽自动合成仪,按照标准的固相多肽合成方法,利用Fmoc-Gln（Trt）-2-wang resin依次与FMOC-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、NOTA-NHS进行偶联,最后经过TFA切割,经过乙醚沉淀,得到粗肽,经过HPLC分离纯化后,得到NOTA-TMPTP1。100μg的NOTA-TMTP1,加入6μg的AlCl3,10μL冰醋酸,100μL[F]F离子。混合物摇匀后在100℃反应15 min,经C18小柱纯化后,得到[F]A1F-NOTA-TMTP1,通过尾静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内,进行microPET/CT显像研究。结果:我们通过固相合成法成功合成NOTA-TMTP1,纯度大于97%（图2a所示）,利用[F]AlF的方法成功标记NOTA-TMTP1,得到目标产物[F]A1F-NOTA-TMTP1,整个反应时间30 min,放化产率为15～30%,放化纯度大于95%（图2b所示）,放射性比活度大于2 GBq/μmol,microPET/CT对[F]AlF-NOTA-TMTP1在4T1荷瘤小鼠的体内代谢研究结果表明（图3）,[F]A1F-NOTA-TMTP1在肿瘤部位摄取明显,且具有良好的稳定性,无体内脱氟现象,[F]AlF-NOTA-TMTP1主要通过肾脏代谢排除体内,并且其血液清除速率快,体内药动学性质优异,在30 min时肿瘤摄取为1.8%ID/g,T/NT比值达到5.2。结论;合成NOTA-TMTP1,并且利用[F]AlF方法成功标记NOTA-TMTP1,得到可以特异性靶向高转移肿瘤,并且具有良好药动学性质的PET探针。
关键词: PET ；高转移肿瘤 ；TMTP1 ；18F标记
摘要： 多肽凭借着其序列多样性、结构复杂性等特性,在药物设计,保健品、化妆产品开发,及自组装生物材料等领域展现出良好的应用前景。多肽可以通过生物合成得到,也可以通过化学途径进行合成。与生物途径合成多肽相比,化学途径可选择和控制条件广泛,可以合成序列多样化的肽段尤其是特定序列的长链多肽,且化学合成更能够适应大规模合成并应用于工业生产。液相多肽合成（LPPS）和固相多肽合成（SPPS）是多肽常规化学合成的有效策略,但是在合成过程中都需消耗大量的化学原料和试剂,尤其很少关注绿色化的多肽化学合成。在SPPS中,以聚合物树脂载体如Wang树脂、Rink Amide AM树脂、Rink Amide MBHA树脂等作为氨基酸的羧基端载体用于多肽偶联,但多肽树脂基载体负载量（0.3-0.8 mmol/g）极低,制备复杂且难以回收,同时会产生难降解的聚合物废物,因此难以实现大规模的SPPS合成。LPPS可以有效防止这些问题,但需要为中间肽建立复杂的色谱分离程序,同样会导致大量化学试剂的浪费和污染,且LPPS在亲水性和长链肽合成方面也具有挑战性。基于目前SPPS和LPPS多肽合成技术各自的局限,迫切需要开发能够组合液相和固相优势的绿色化多肽合成新方法。
针对以上问题,本论文着重研究多肽绿色化的合成方法,具体体现为设计合成一系列具有沉淀诱导辅助作用的新型有机磷小分子作为可替代固相合成树脂的绿色多肽载体（GPS:Greener Peptide Supports）。在多肽链延伸的过程中,将GPS载体作为肽链的羧基端保护基团且能够辅助肽链的沉淀及纯化,充分地组合液相LPPS和SPPS的优势,开发了载体辅助的液相反应-固相沉淀（LRSP:Liquid Reaction and Solid Precipitation）多肽合成技术,进而实现一种绿色化、原子经济化、可规模放大化的多肽合成。本论文具体的研究工作包括:
（1）设计合成了一系列的芳基磷（膦）酸酯类载体,包括三个反应位点的GPS载体:三（4-甲酰基苯基）磷酸酯（TFP）衍生物、三（4-苯甲酰基苯基）磷酸酯（TBP）衍生物、三（4'-二苯基膦酰基氧基苯甲酰基苯基）磷酸酯（TDPBP）衍生物,以及单个反应位点的载体:4-二苯基膦酰氧基二苯甲酮（DDK）衍生物等。通过研究磷（膦）酸酯载体与Fmoc/Boc保护氨基酸的偶联性能、脱Fmoc/Boc保护及剪切裂解过程中偶联产物的酸碱稳定性能、GPS载体辅助多肽沉淀（SAP:Support Aid Precipitation）纯化性能,进而建立了功能和种类多样化的芳基磷（膦）酸酯类绿色多肽载体库（GPSL:Greener Peptide Supports Library）。
（2）通过设计的三个反应位点的磷酸酯载体如TFP载体、TBP载体、TDPBP载体进行不同策略、不同长度及序列的多肽合成,以验证各种类型的磷酸酯类载体在Fmoc多肽合成策略、Boc多肽合成策略中的适用性及基团辅助沉淀性能。通过利用相关的磷酸酯类载体,成功地合成了一系列生物活性多肽,具体包括TFP载体介导Boc策略合成的短杆菌肽S,TBP载体介导Fmoc策略合成的谷胱甘肽（GSH和α-GSH）、RGD、RAD、RVD肽、亮氨酸脑啡肽、RGD-亮氨酸脑啡肽、RRRGD-亮氨酸脑啡肽,TDPBP载体介导Fmoc策略合成的抗SARS八肽（AVLQSGFR）,以及TFP载体和TBP=N-OH酮肟载体介导Boc策略合成的易于凝胶化的模板多肽序列VFAFAF和FVFVFV。
（3）普卡那肽（Plecanatide）是人类鸟苷蛋白（Uroguanylin）的合成类似物,是由16个氨基酸残基组成并含有两个分子内二硫键的侧链-侧链双环多肽。目前,普卡那肽的制备主要依靠LPPS技术,因此很难实现批量规模化的生产。本文通过使用单个反应位点的4-二苯基膦酰氧基二苯甲酮（DDK）类小分子作为羧基端载体实现了普卡那肽的液相（均相）全合成。通过对普卡那肽（Plecanatide）的液相全合成研究,充分地验证了4-二苯基次膦酰氧基二苯甲酮（DDK）衍生物作为小分子载体在辅助长链多肽合成及纯化中的可行性。该方法的建立为普卡那肽及其它相关的长链多肽的液相及可规模化合成提供了新的合成策略。
（4）结合对磷（膦）酸酯类载体结构与性能的研究,利用磷（膦）酸酯载体库中对酸稳定对碱不稳定的4-二苯基次膦酰氧基二苯甲酮肟（DDKO=N-OH）小分子载体,开发了一种以Boc策略进行多肽合成,且可以发生肽链的DDKO载体上首尾环合/自剪切进行首尾环肽的合成的新方法。该方法充分利用4-二苯基次膦酰氧基二苯酮肟（DDKO）载体附载肽链在脱Fmoc碱性条件（DEA/ACN）下的不稳定,在肽链延长过程中多肽的末位N端以Fmoc氨基酸结束,在脱除Fmoc基团的同时在DDK=N-OH载体上发生多肽链的首尾环合/自剪切,且裂解游离出的酮肟载体可直接进行回收使用。同时,通过建立的DDKO载体上首尾环合/自剪切方法成功地合成了具有抗疟生物活性的天然产物环七肽Mortiamide A:Cyclo（DVal-Leu-DVal-DVal-DVal-Phe-DPhe）和Mortiamide B:Cyclo（DVal-Phe-DVal-DVal-DVal-Phe-DPhe）,以及Mortiamide A环七肽系列的类似物:Cyclo（DVal-Ile-DVal-DVal-DVal-Phe-DPhe）,Cyclo（DVal-Val-DVal-DVal-DVal-Phe-DPhe）和Cyclo（DVal-Pro-DVal-DVal-DVal-Phe-DPhe）。该法的建立为液相体系多肽的环化合成策略提供了新思路,并可能扩展至更广泛、更大环的环肽合成。
关键词: 有机磷小分子 ；绿色多肽载体(GPS) ；载体辅助沉淀 ；绿色多肽合成 ；普卡那肽 ；环七肽Mortiamide A
摘要： 目的:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界范围内死亡率较高的恶性肿瘤之一,且其发病率高约占全部原发性肝癌病例的70%～85%。HCC主要的治疗方案包括手术治疗、放射治疗和药物治疗,其中手术治疗是首选方案。但是由于HCC病程早期无明显症状,50%以上患者诊断时已超出手术最佳时期。因此靶向药物治疗、介入治疗、放射治疗在更好的控制和治疗HCC中也十分重要。HCC的发生经历了细胞内信号通路的改变、肿瘤增殖代谢系统的改变以及局部肿瘤微环境的形成等极其复杂的多个过程。基于HCC发生和发展中基因表达谱的变化以及细胞内信号通路的改变等进行研究,可以筛选出潜在的治疗新靶点。而利用筛选得到的HCC治疗靶点的蛋白晶体结构,就可以进行靶向药物的设计。利用药物受体学说,可以基于靶点蛋白或其配体的3D结构设计出相应的靶向药物。以配体的肽模拟物为先导物,利用计算机模拟设计技术对其进行合理的结构改造,可以获得与特定蛋白亲和的多肽偶联药物。对此多肽偶联药物进行合成路线设计后,通过化学合成即可获得目标肽类化合物。本研究旨在筛选HCC潜在的治疗靶点,并进一步设计能与此靶点结合的靶向肽偶联药物,主要分为以下两部分研究内容:（1）基于生物信息大数据分析筛选HCC治疗新靶点:对HCC差异表达基因进行数据分析并结合临床病理参数相关性研究,筛选得到候选靶点CTAG2和PRSS3;（2）靶向PRSS3的多肽偶联药物设计及活性研究:基于PRSS3的3D空间结构进行计算机辅助药物设计得到靶向肽WZ-1。设计多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥的合成路线,通过化学合成获得靶向PRSS3的多肽偶联药物。研究方法:1、肝癌转录组数据的获取及差异基因筛选:本研究所用的RNA-Seq数据和相应临床数据从TCGA数据库中下载,包括374例HCC样本和50例癌旁配对样本。从Bioconductor下载的EdgerR用于筛选差异表达基因。分析TCGA数据库中肝癌组织和癌旁组织中差异表达的RNA,然后利用R语言对差异表达基因进行可视化展示,绘制火山图和热图。2、蛋白-蛋白相互作用网络构建:通过STRING数据库分析差异基因,构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,获得相应的TSV文件;利用cytoscaper软件进行网络分析,将TSV文件导入,设置起源节点和目标节点后,再通过四种拓扑分析法:MCC、DMNC、MNC、degree分别构建子网络,得到候选靶点基因CTAG2、NTS、GNG4、GAST、PRSS1和PRSS3。3、候选靶点基因表达与临床病理参数相关性分析:利用TCGA数据库分析候选靶点基因表达与不良预后及其它临床病例参数的相关性,并利用免疫组织化学染色检测CTAG2在肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织的表达情况。4、基因集富集分析:利用GSEA网站MsigDB数据库中获得的c2.cp.kegg.v6.1.symbols.gmt数据集,对根据CTAG2/PRSS3的表达分组的TCGA LIHC中患者肿瘤组织中RNA-seq数据进行缺省加权富集统计分析。富集结果主要参数具有显著性意义的标准设为NES>1.5,P<0.05。5、计算机辅助药物分子设计:基于候选靶点PRSS3的3D空间结构,利用MOE软件自动识别配体与PRSS3的结合位点,并确定其中的关键锚点。再通过多肽构象优化、分子对接和结合能量分析等进行合理药物设计。6、Fmoc固相合成法:以不溶性固体树脂作为载体,利用SPPS法从C端合成至N端得到靶向PRSS3的多肽。使用Fmoc保护Thr、Gly、Pro、Cys、Arg、Leu、Asp、Ile的氨基部分,利用Fmoc在弱碱性条件下易脱除的特性进行肽类的延长。再以Fmoc-e-Acp-OH为原料,通过线性合成方式在多肽序列上继续进行缩合反应,然后再与苯丁酸氮芥反应生成终产物。最后使用树脂裂解液处理后得到靶向PRSS3的多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥。7、RP-HPLC含量测定方法:多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥采用RP-HPLC法进行含量测定,对样品溶液进行线性关系考察、精密度考察和稳定性研究。8、细胞毒性检测:采用MTT实验检测多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肿瘤细胞的杀伤作用。9、数据统计分析:生存分析采用Kaplan-Meier曲线（log-rank检验）,非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验进行差异比较。Cox回归分析采用单变量和多变量分析。采用Wilcoxon秩和检验对免疫组化数据进行分析。CTAG2和PRSS3表达水平与HCC临床病理参数的相关性研究,采用Pearson Chi-square（χ2）test或Fisher精确检验进行分析。统计检验均采用SPSS软件16.0版（SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA）完成。所有分析均以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。结果:1、基于生物信息大数据分析筛选肝细胞肝癌治疗新靶点（1）差异基因的数据分析及候选靶点基因的确定:筛选TCGA数据库中肝癌患者肿瘤组织与癌旁组织的差异表达基因（DEGs）,得到显著上调DEGs共4750个。然后进行分子功能分析,结果表明这些DEGs与转录调控和转录辅抑制因子活性密切相关。构建的PPI网络并分析,结果提示CTAG2、NTS、GNG4、GAST、PRSS1和PRSS3可以作为候选靶点基因进行下一步研究。（2）CTAG2和PRSS3在肝癌组织中的表达与临床病理参数相关性分析:TCGA数据库中6个候选靶点基因在肝癌组织中的表达值均显著高于癌旁组织。基于单变量Cox回归分析结果,TNM分期（P<0.001）,AFP高表达（P=0.010）和CTAG2高表达（P=0.035）与患者的预后显著相关,提示CTAG2高表达组患者总体生存期显著缩短。此外CTAG2表达与年龄（P=0.003）、T分期（P=0.028）、TNM分期（P=0.028）和AFP（P=0.045）表达显著相关。PRSS3表达与诊断年龄（P=0.012）显著相关,但与性别、T分期、TNM分期和AFP表达等参数无相关性。结合候选靶点基因的肿瘤表达谱情况,我们将CTAG2和PRSS3视为重要的潜在肝癌的治疗靶点。（3）CTAG2和PRSS3相关KEGG信号通路分析:采用GSEA富集分析相关KEGG信号通路,CTAG2高表达样本富集到同源重组、细胞周期、DNA复制、碱基切除修复、磷酸戊糖途径、错配修复、核苷酸切除修复等KEGG信号通路;而PRSS3高表达组被显著富集到DNA复制、细胞周期、Ig A生成的肠免疫网络、错配修复、细胞因子受体相互作用等信号通路。结果提示CTAG2和PRSS3的相关KEGG信号通路可能与肿瘤细胞异常增殖有关。2、靶向PRSS3的多肽偶联药物设计及活性研究（1）PRSS3与其蛋白抑制剂相互作用关键锚点的确定:使用MOE对PRSS3及抑制剂的蛋白复合物结构进行结构细化,并确定抑制剂与PRSS3的相互作用位点。分析结果显示蛋白抑制剂的Pro13、Cys14,Arg15,Asp17残基为相互作用的关键锚点,即抑制剂通过这些氨基酸以氢键及氢键-离子键的作用嵌入到PRSS3的结合口袋中。（2）PRSS3靶向肽的设计与分子对接:以PRSS3抑制剂与受体的关键结合位点所在的多肽片段为多肽序列的模板（TGPCRADI）,并依此设计了18条含有8个氨基酸的多肽序列。使用MOE将设计的多肽与PRSS3受体进行对接,结果显示所设计的多肽其中6条模拟计算的结合情况显著优于模板肽序列（S score<-40）。其中多肽WZ-1可以较好的嵌入PRSS3的结合口袋且S分值最低,所以选定此多肽序列进行合成。（3）多肽WZ-1偶联药物的合成路线设计:选用Fmoc合成策略,以树脂与Ile的羧基以共价键进行连接。然后与Asp的羧基进行缩合反应,依照去保护基、缩合、洗涤、再去保护的循环过程进行肽链的延长。缩合反应采用的是活性酯法并以HOAt和DIC为偶联剂组合。最后以线性合成方式将linker和苯丁酸氮芥与多肽WZ-1连接得到多肽偶联药物。（4）多肽WZ-1偶联药物的合成:我们选用Wang树脂作为固相反应中的载体,同时确定了氨基酸与树脂投料比为4:1。以Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp（otBu）-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH和Fmoc-Thr（tBu）-OH等含保护基的氨基酸为原料合成多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥。使用MS进行结构确证,并经分析液相检测纯度为96.77%。（5）多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥含量方法学验证:多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥供试品溶液在室温48小时内稳定;以样品浓度对峰面积进行线性回归,试验结果表明样品峰面积与浓度（0.50～1.5mg/ml）范围间线性关系良好,线性回归方程为:y=8680x+109.29,相关系数r为0.9996;此含量分析方法重复性和中间精密度良好。（6）多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥的细胞毒性效果:MTT实验结果显示多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肝癌细胞株具有细胞毒性作用。结论:1、数据挖掘结合临床病理参数相关性研究等组合分析后,筛选得到2个候选靶点基因CTAG2和PRSS3。2、CTAG2在肝癌组织中高表达且与肝癌不良预后密切相关,但目前无可获得的CTAG2蛋白3D结构。PRSS3在肝癌组织中高表达,GSEA分析的相关KEGG信号通路与肿瘤增殖有关。3、多肽WZ-1通过虚拟计算显示以Pro、Cys、Arg等关键锚点与PRSS3的3D空间结构进行结合。4、多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥是以多肽WZ-1为靶向部位的PDC类化合物。5、合成的多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肝癌细胞系具有细胞毒性作用,可以作为新型抗肿瘤靶向药物候选物。
关键词: 肝细胞肝癌 ；拓扑分析 ；CTAG2 ；PRSS3 ；多肽偶联药物 ；药物设计
摘要： 白细胞介素15蛋白（IL-15）是一种14-15 k Da的多效性细胞因子,在先天免疫和适应性免疫中起着关键作用。它能够刺激T细胞的增殖,诱导细胞毒性淋巴细胞和记忆表型CD8+T细胞的产生,并刺激自然杀伤（NK）细胞的增殖和维持。重组IL-15以及IL-15超激动剂已被用于临床试验。IL-15在生物医学方面有广阔的前景,相关研究均为IL-15表达蛋白,而对于IL-15化学合成仍未有相关报导。
本文依据多肽片段自然化学连接（NCL）的前提,将人体IL-15分成三个片段:Asn1-Ser34,Cys35-Gly84,Cys85-Ser114,两个自然化学连接位点:Ser34-Cys35,Gly84-Cys85。利用Fmoc固相肽合成（Fmoc-SPPS）的方法探索研究了相应片段的合成路径的工艺方法。以DMF作为溶剂,Wang树脂和Rink Amide MBHA树脂为固相载体,氨基酸的量为树脂的5 eq.,每个氨基酸激活3 min,偶联1 h。先后使用了HCTU、DIEA（HCTU为树脂4 eq.,DIEA为树脂8 eq.）与Oxyma、DIC（Oxyma为树脂5 eq.,DIC为树脂10 eq.）两种氨基酸激活体系的方法。以三氟乙酸（TFA）:水（H2O）:三异丙基硅烷（TIS）为95:2.5:2.5（v/v）配制裂解液。偶联困难的氨基酸,偶联两次（30 min*2）,通过使用伪脯氨酸解决Fmoc-SPPS中聚集的问题。在合成过程中针对Cys35-Gly84疏水性强的问题先后对合成路径进行了三次实验设计及相关优化:
（1）Cys35被Boc-Thz-OH替换,Cys42、Cys88上的巯基通过ACM保护。Cys35-Gly84显示出很强的疏水性,无法通过制备液相分离。
（2）Boc-Thz-OH替换Cys35,Cys42、Cys88上的巯基用ACM-NMe2保护。合成Cys85-Ser114产率15.8%。虽然Cys35-Gly84由于水溶性差合成Cys35-Gly84-MMP失败,但是能够合成Cys35-Gly84-NHNH2。不过在进行制备液相分离纯化时,在色谱柱中析出,难以纯化。
（3）Cys35与Cys85都用Boc-Thz-OH替换,Cys35-Gly84与Cys85-Ser114的合成都使用Rink Amide MBHA树脂,先偶联6个精氨酸,再偶联Fmoc-Me Nbz,之后再进行相关片段的Fmoc-SPPS。用具有可移除性助溶标签的半胱氨酸代替Cys42、Cys88,多肽片段偶联完后,在可移除性助溶标签上通过Fmoc-SPPS偶联三个精氨酸。最后,合成Cys42附有可移除性助溶标签的Cys35-Gly84-NHNH2,Cys88附有可移除性助溶标签的Cys85-Ser114。
比较合成片段的RP-HPLC吸收峰时间,第三条合成路径合成的多肽片段显示出更好的亲水性。通过制备液相纯化合成的多肽片段,得到Asn1-Ser34-MMP 21.6%的产率;Cys42附着可移除性助溶标签的Cys35-Gly84-NHNH2产率为11.4%;Cys88附着可移除性助溶标签的Cys85-Ser114产率为14.6%。
本文依据多肽片段NCL方法的前提,通过Fmoc-SPPS的方法开发且优化人体IL-15蛋白多肽片段的化学合成工艺。论述了在合成过程中遇到的一些问题以及解决方法,为合成完整的人体IL-15蛋白提供了基础。
关键词: Fmoc-SPPS ；白细胞介素15 ；多肽 ；RP-HPLC ；ESI-MS
摘要： 研究了Fmoc-Asn(Trt)-OH与Wang树脂的酯化反应工艺。探讨了反应策略、溶剂体系、投料比、反应时间以及反应温度等条件对手工合成Fmoc-Asn(Trt)-Wang树脂反应的影响。并用微波辅助方法与常规方法进行了对比。实验结果表明了采用HBTU/HOBt/DIEA方法的连接效率最高。对反应的优化结果为:NMP/DCM体积比为1:7,体系、摩尔比为3:1,每次反应时间4 h,温度40℃。微波对本酯化反应影响不大。
关键词: 固相多肽合成(SPPS) ；Wang树脂 ；Fmoc—Asn(Trt)-OH ；微波
被引量
3
摘要： 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性分子，几乎所有细胞都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个方面。目前多肽的制备主要采用固相合成方法。虽然固相多肽合成技术已经有40多年的发展历史，但是其中一些关键技术问题仍然没有得到很好解决，诸如反应介质的选择，困难氨基酸序列的缩合，氨基酸与树脂的有效连接，大规模合成技术及其反应器放大，合成策略的优化组合等。本论文通过对这些关键技术问题进行具体攻关和深入研究，旨在开发高效、经济的固相多肽大规模合成工艺及设备。本论文研究结果如下：
1.以羟基wang树脂为固相载体，研究了反应介质对氨基酸与羟基树脂连接反应的影响，探索了一条经济、高效的氨基酸与羟基树脂的连接工艺。采用HPLC检测了反应中间产物，分析了介质溶剂偶极矩对氨基酸与树脂间连接效率的影响，并深入研究了介质溶剂物性与连接率之间的关系，揭示了介质溶剂的X(X=偶极矩/密度)与连接率之间的定量关系符合方程Y=-6.1*X+121.96。据此选择了新的弱极性溶剂或混合溶剂，优化了反应物比例，结果氨基酸的用量从树脂的4倍降低为3倍，反应时间从20h缩短为少于5h，连接效率从30％～80％提高到80％～100％，提供了一条高效、经济的氨基酸与羟基树脂连接的工艺。
2.困难多肽合成新技术的研究。(1)采用微波辐射辅助合成技术，提高了C-端含Arg-Pro困难序列多肽(AP-9和亮丙瑞林)的合成速率与产率，并首次报道了一条方便的C-端烷基化多肽的合成工艺。以V(THF)：V(NMP)=1:1为新的介质体系，在微波辐射30℃下反应仅6min，Arg-Pro困难序列的产率就达到80.2％。与传统方法相比，反应时间缩短20倍，产率提高10％。在此基础上，合成了两条C-端含Arg-Pro困难序列的多肽--AP-9和亮丙瑞林。AP-9得率73％，经制备型RP-HPLC纯化后，纯度大于98％。以亮丙瑞林为模型肽，首次报道了一条方便的C-端N-烷基化多肽的合成工艺。该新工艺实现了多肽乙胺化与切割步骤的连续耦合进行，简化了操作步骤，缩短了制备时间，充分保持了固相肽合成高效的优势。(2)采用Fmoc/Boc组合策略，研究了N端含有困难氨基酸残基的多肽的合成技术。以Val-Tyr为模型肽，用Boc-Val-OH取代了Fmoc-Val-OH，与Tyr-wangresin缩合，反应时间从90min缩短为40min，产率从67.2％提高到74.4％。采用此新方法，合成了N端含有困难Val的多肽Enterostatin。以Boc-Val-OH替代Fmoc-Val-OH，缩合反应时间从1h降低为0.5h，Enterostatin纯度从73.5％提高到77.4％，产率从70.5％提高到75.4％;并减少了一步脱保护反应和一步洗涤操作，简化了合成工艺。
3.研究了微波用于固相多肽合成中缩合、切割反应的技术及其动力学。以Fmoc-Val-OH与NH2-Tyr-(tBu)-Wang树脂的缩合反应为对象，首次研究了微波辅助下的固相缩合反应动力学。分析结果表明，微波辐射下的表观反应级数为2.3，表观活化能为104.7kJ/mol：而传统方法下表观反应级数为2.9，活化能为142.4kJ/mol。微波辐射的效果使缩合产率从68％提高到95％，而反应时间却缩短为传统方法的1/14。本论文将微波应用于TP5的合成。与常规方法相比，20℃下微波辐射4min，提高反应速率15倍，降低氨基酸的用量50％，TP5产率最高达88.7％，优于常规固相合成TP5的结果，并降低合成成本约40％。在微波辐射下切割胸腺五肽树脂，以V(TFA)：V(TIS)：V(H2O)=95:2.5:2.5为切割试剂，50℃下反应5min。与常规切割方法相比，反应速率和TP5产率分别提高了24倍和21.8％，降低了制备成本。
4.自制新型大规模固相多肽合成反应器，研究了百克级规模多肽固相合成的放大技术，克服了市售多肽合成仪存在的问题，如价格昂贵，合成规模小，传质效果差等。本论文自行设计了10g～100g级新型大规模固相多肽合成反应器，集成反应、搅拌、控温、鼓泡、氮气保护和过滤六重功能，提高传质、传热效率，减少了副反应的发生。以DIC/HOBt为缩合试剂，以V(DMF)：V(THF)=9:11作为新的反应溶剂体系，V(TFA)：V(TIS)：V(H2O)=95:2.5:2.5为切割试剂，建立了TP5的高效小试合成工艺;在DCM中，40℃下反应仅2h，即可将Fmoc-Thr(tBu)-Ol与CTC树脂的连接率从文献报道的0.287mmol/g(反应21h)提高到0.503mmol/g，降低了奥曲肽小试的合成成本。在此基础上，在新型反应器中进行了TP5和奥曲肽放大合成。100克级TP5的合成成本为97.8元/克(市场价500元/克)，降低成本33％;10克级奥曲肽的合成产率达到50％左右，较文献报道提高了20％，并降低合成成本76％，为359元/克(市场价4000元/克)。这显示自制新型大规模固相多肽合成反应器具有良好的应用前景。
关键词: 多肽固相合成 ；微波辐射 ；反应器 ；大规模合成工艺 ；困难序列 ；优化组合
被引量
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摘要： 本文主要由两部分构成：Kunitz抑制剂家族成员抑肽酶抑制纤溶酶原的活化和固相合成RGDS与小鸡uPA氮端二十肽片段.
抑肽酶属Kunitz抑制剂家族成员，它能够抑制激肽释放酶、纤溶酶及胰蛋白酶的蛋白水解活性.本文的研究表明：抑肽酶能够抑制尿激酶型-纤溶酶原激活剂(u-PA)和组织型-纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤溶酶原的激活，但不影响u-PA和t-PA对小分子底物的酰胺水解活性.用u-PA研究了上述作用的机制，发现抑肽酶与u-PA的丝氨酸蛋白酶功能区特异性结合，而与纤溶酶原没有相互作用.抑肽酶与u-PA的结合并不阻断u-PA的活性位点，因为u-PA对小分子底物的水解活性仍然保持.上述发现提示抑肽酶可能存在另一种抑制作用模式，该模式不同于以前报道的关于Kunitz抑制剂或纤溶酶原激活酶抑制剂的作用.由于人体内的Kunitz抑制剂与抑肽酶在结构上非常相似，根据本文的研究结果，推测体内纤溶酶原的激活作用并非仅受丝氨酸蛋白酶抑制剂的控制.
RGDS为可溶性小分子多肽，在大多数与整合素相结合的配体中都含有这一序列，它能竞争细胞外基质中的基质蛋白，与不同细胞表面的整合素受体结合，阻止细胞粘附和增殖。小鸡uPA的N端二十肽的结构为NH2-Ser-Val-Tyr-Ile-Arg-Gln-Tyr-Tyr-Lys-Leu-Ser-His-Lys-His-Arg-Pro-Gln-His-Arg-Glu-OH这个二十肽片段在小鸡的uPA自激活过程中起了十分重要的作用.本文用wang树脂与Fmoc保护策略来合成这两个模型多肽，经过逐步藕联、TFA裂解、脱保护、HPLC纯化等一系列步骤，成功得到了纯度＞98％的RGDS与二十肽，合成的多肽经质谱、高效液相色谱鉴定为目标肽。
关键词: 固相合成 ；缩合试剂 ；抑肽酶 ；丝氨酸蛋白酶 ；Kunitz抑制剂 ；纤溶酶原激活剂
摘要： 奥曲肽是人工合成的生长抑素八肽类似物，其作用效果比天然生长抑素强，半衰期也较长，具有抑制生长激素、胰岛素、胰高血糖素、胃酸分泌的功能，在临床上有着广泛的应用;胸腺五肽是胸腺生成素Ⅱ第32～36位的氨基酸残基片段，具有胸腺生成素Ⅱ的所有功能，广泛应用于治疗肿瘤、肝病、皮肤病等。
本文利用Fmoc-Boc组合策略以及微波辅助合成技术改进了奥曲肽和胸腺五肽的生产工艺，通过实验和理论分析得到了以下主要结果：
1)以Boc-D-Phe-OH替代Fmoc-D-Phe-OH合成奥曲肽，简化了合成工艺，粗肽中奥曲肽的含量由85％提高到了91％，产率由51％提高到了59％。
2)以Boc-Arg(Pbf)-OH替代Fmoc-Arg(Pbf)-OH合成胸腺五肽，减少了一步脱保护反应和一步洗涤操作，简化了合成工艺，胸腺五肽粗品含量由86％上升为92％，产率由91％上升到95％。
3)分别在微波作用以及传统加热两种方式下，研究了Fmoc-Val-OH与NH2-Tyr-(tBu)-Wang树脂的固相缩合反应及其动力学。获得了Fmoc-Val-OH与NH2-Tyr-(tBu)-Wang树脂在两种方式下的宏观动力学参数：300 W微波作用下表观缩合反应级数为2.3，活化能为104.7 kJ/mol;传统方法中表观反应级数为2.9，活化能为142.4 kJ/mol。
4)采用微波辅助Fmoc-Thr(tBu)-ol与CTC树脂的连接，反应条件为：Fmoc-Thr(tBu)-ol：DIEA：CTC Resin=4:8:1(n：n：n);以DCM/DMF=5/3(V/V)为反应溶剂，300 W微波辐射下，35℃反应5 min，最终连接效率可以达到58％。与文献报道的31.8％的产率相比，反应时间缩短为5 min，连接效率提高至58％。
5)采用微波辅助切割胸腺五肽树脂，最佳反应条件为：以TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5(V/V/V)为切割试剂，50℃下反应5 min。而胸腺五肽的产率提高到93.2％。
关键词: 胸腺五肽 ；奥曲肽 ；微波技术 ；固相合成工艺 ；缩合反应
摘要： 胸腺素类制剂在抗感染、抗肿瘤和自身免疫性疾病中起着重要作用。胸腺因子大多数都作用于T淋巴细胞，促进其分化成熟，但也有各自的特性。胸腺体液因子(ThymicHumoralFactor-γ2，THF-γ2)和血清胸腺因子(Thymulin，FTS)是两种重要的胸腺素。THF-γ2调节CD4+/CD8+T细胞比率，增强脾细胞对有丝分裂原的反应，T细胞对凝集素的增殖反应，T细胞对抗体产生的辅助作用，移植抗宿主反应和细胞毒反应等多种特性。THF-γ2也刺激IL-2和TNFα的产生，以及提高胸腺细胞的抗肿瘤活性。FTS已经被证明影响CD4+/CD8+T细胞比率，增加自然杀伤细胞(NK)的活力，增加抗体的产生，增加白介素-2受体和干扰素-γ受体的表达。本文旨在建立THF-γ2和FTS的合成、纯化和分析方法，研究其生物活性，为应用开发奠定基础。 本实验首先建立了氨基酸保护的方法，对所需氨基酸的氨基和活性侧链进行了成功的衍生。合成了Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH。并经薄层层析，紫外扫描，熔点测定和HPLC分析得以确证。同时制备了载量适中的氨基酸与树脂的偶联产物Fmoc-Leu-Wang和Fmoc-Asn(Trt)-Wang树脂。 采用Fmoc固相合成法(SPPS)合成了THF-γ2，用中压液相反相柱一步纯化，经HPLC分析纯度，通过质谱、氨基酸组成和序列分析鉴定合成产物。根据THF-γ2促进T细胞产生IL-2的特性检测合成产物的体外活性。结果表明：化学合成胸腺体液因子的产率为95.8％；纯化后其纯度达到95.92％；质谱测定其分子量为918，与理论分子量相符；氨基酸序列测定为NH2/Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu，与设计序列一致；当THF-γ2浓度为300ng/ml时，小鼠脾细胞产生IL-2的浓度最高，为空白对照的1.9倍。 采用Fmoc固相合成法合成了FTS，用中压液相阴离子柱一步纯化，经HPLC分析纯度，通过质谱、氨基酸组成和序列分析鉴定合成产物。由FTS恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对免疫抑制剂AZ敏感的特性测定合成FTS的活性。结果表明：化学合成血清胸腺因子的产率为94.7％；纯化后其纯度为93.7％；质谱测定其分子量为876.6，与理论分子量相符；氨基酸序列测定为NH2/Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn，与设计序列一致；合成FTS的浓度低至10-14mol/l时尚有部分活力，在10-13mol/l时能够完全恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对AZ的敏感性。 THF-γ2和FTS的生物活性有紧密的联系，两者的协同作用可能更好的调节免疫反应。嵌合肽能确保它们在同一时间出现在机体的同一部位。因此我们合成了两者的嵌合肽，经纯化和分析鉴定之后，用绵羊红细胞实验，辐射保护实验和IL-2产生实验检测其活性。 发现由Ala-Tyr-Ala连接的嵌合肽FTS-THF-γ2(a)显示了FTS和THF-γ2的生物活性，成为一种新的潜在的免疫调节剂。 初步探索了FTS和THF-γ2作为放、化疗辅助用药的可能性。实验显示FTS提高了受辐射小鼠的免疫指标：白细胞总数和吞噬细胞能力都得到提高，胸腺指数也有所升高。FTS也提高了小鼠的存活率和存活时间。而在降低化疗副作用中，FTS和THF-γ2都显示了阳性结果，提高了荷瘤小鼠注射环磷酰胺后的存活率和存活时间。 本论文也包括了一种蛇毒抗凝肽(Hannahpep)的合成和体外活性测定，实验表明Hannahpep确有溶纤维蛋白和纤维蛋白原的活性。
关键词: 胸腺体液因子 ；血清胸腺因子 ；胸腺素 ；肽合成 ；T细胞 ；固相合成法
摘要： 神经降压素是由13个氨基酸残基组成的生物活性多肽,具有多重生理功能,且高活性、作用快速,可作为潜在的安定药、镇痛药和降压药等,具有广阔的应用前景。
本研究主要进行了固相合成反应器的设计及合成工艺的优化。首先对手工固相合成仪（反应器）进行了设计、选择及优化,确定以振荡混合型反应器为本研究的最佳固相合成反应器。然后选择以Fmoc保护的氨基酸为原料,Wang树脂为载体,按照神经降压素的氨基酸序列Pyr-Leu-Tyr-Glu-Gln-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH,从C端向N端进行合成,成功合成了神经降压素。考察了缩合试剂、脱保护试剂、切割试剂等条件对合成效果的影响,确定了优化的合成工艺:以DCM为反应溶剂,TBTU/HOBt/DIEA为缩合剂,采用TFA/H2O/thioanisole/Phenol/EDT（82:5:5:6:2）的切割试剂的配方的切割条件,保护氨基酸2倍过量进行缩合反应,反应时间为3～12h。反应结果使神经降压素的收率达61.8%。此合成工艺操作简单、周期短、合成效率高、成本低、适合于规模化生产。
建立了合成神经降压素粗产品的HPLC分析方法,研究了乙腈浓度梯度、乙腈起始浓度对分析效果的影响,并进行了神经降压素粗产品的LC/MS分析,检测分子量为1672.96,结果验证了合成的多肽为神经降压素。
关键词: 神经降压素 ；固相多肽合成(SPPS) ；Fmoc合成策略 ；反相高效液相色谱 ；质谱
被引量
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