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摘要： 以N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)和N-芴甲氧羰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)为原料,采用经典的Fmoc固相合成法,通过对氨基酸N端的保护及脱保护、氨基酸的甲基化、缩合等步骤合成线性五肽,以缩合试剂六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷(Py \BOP)关环,分别以59.5%和41.1%的环合收率得到了两个新的环五肽化合物G_1和G_2,结构通过~1HNMR、^(13)CNMR、ESI-MS进行确认。采用MTT法对目标化合物G_1和G_2进行了体外抗肿瘤活性的研究。结果表明:含有脯氨酸片段的Galaxamide类似物G_2具有良好的活性,尤其对人乳腺癌细胞株(MCF-7)具有较好的细胞毒性,其IC_(50)值为5.85 mg/L。
关键词: Fmoc固相合成 ；环五肽 ；Galaxamide ；六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷 ；抗肿瘤活性 ；医药原料
被引量
2
摘要： 以保护性氨基酸Boc-Lys-(Boc)-OH、Fmoc-His-(Trt)-OH和Gly-NH2-HCl为原料,N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂,按照由C端向N端依次接肽的合成策略,采用液相法完成了法氏囊素(L-Lys-His-Gly-NH2)的合成,总产率≥62.7%,其纯度≥90%。对DCC缩合反应中,羧基的活化、反应溶剂的选择、反应物投料比及顺序、反应温度及时间对反应结果的影响以及Boc、Fmoc、Trt三种保护基团的脱除条件也进行了研究和优化。
关键词: 活性三肽 ；法氏囊素 ；碳二亚胺法(DCC法) ；液相合成 ；L-Lys-His-Gly-NH2
被引量
9
关键词: Fmoc-Lys ；保护氨基酸 ；偶氮染料 ；铜络合物 ；柱层析纯化 ；化学化工 ；赖氨酸盐 ；元素分析 ；同位素标记 ；偶氮苯甲酸
摘要： 研究了精氨酸用9-芴甲氧羰基(Fmoc)和2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)双保护的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的制备过程。在引入Pbf时,加入了相转移催化剂四乙基溴化铵(TEBA),提高了反应效率,减少了Pbf-Cl的水解;成盐时改为将Cbz-Arg(Pbf)-OH溶液加入到环己胺溶液中,使成盐质量有所提高,将该步收率由文献的59%提高到72%。
关键词: 精氨酸 ；Pbf ；Fmoe ；Cbz ；合成
摘要： 目的:对脊髓肽 MP1的固相合成工艺进行优化,并研究其免疫活性。方法:采用 Fmoc 法对脊髓肽 MP1进行固相合成,利用反相高效液相、质谱和氨基酸分析的方法对其进行性质鉴定,并采用 MTT 法对其进行免疫活性检测。通过探索不同的缩合时间、氨基酸用量和切割条件对合成效率的影响,由此找出适宜的合成条件。结果:以 DMF 为反应溶剂、HBTU/HOBt 为缩合剂、缩合时间50 min 和氨基酸过量两倍进行多肽 MP1的合成,并采用配方为:TFA-水-EDT-TES(90:6:3:1)的切割剂进行常温切割3.5 h,此条件下粗品纯度可达到83.20%。质谱分析的分子离子峰[M+H]+是681.4与脊髓肽 MP1的理论分子量680.80基本一致,氨基酸分析结果表明:脊髓肽 MP1的氨基酸残基的实测摩尔比与理论摩尔比基本一致。纯化后的 MP1具有明显的促进 ConA 刺激脾淋巴细胞增殖的作用。结论:本实验建立的固相合成工艺条件可以成功地合成具有免疫活性的脊髓肽 MP1。
关键词: 脊髓肽MPl ；固相合成 ；脾淋巴细胞 ；免疫活性
【专利/发明】 • CN201811292613.1 •
+1位作者
•
申请日：2018-11-01,
公开日：2019-01-11
申请人： 山东汉泰生物科技有限公司
公开（公告）号： CN109180801A
摘要： 本发明采用固相化学的方法制备索玛鲁肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。该方法首次采用Fmoc‑Lys(N‑ε‑ADO‑ADO‑(γ‑Glu(N‑α‑X)‑OtBu)‑OH参与固相合成索玛鲁肽(其中谷氨酸α氨基保护基X为Alloc、Mmt、Mtt、Dde或ivDde),然后脱掉保护基，在固相上脂肪酸化；同时针对索玛鲁肽工艺产生的缺1个Ala杂质肽；接18位和19位时采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH,避免这一纯化过程中难以除去杂质的生成；为避免产生±Gly的工艺杂质，引入Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH和Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly–OH两个二肽作为单体参与合成；通过引入这四个个片段肽参与索玛鲁肽的固相合成，提高了粗肽纯度，降低了纯化难度，降低了生产成本。
【专利/发明】 • CN201910535999.2 • •
申请日：2019-06-20,
公开日：2020-12-22
申请人： 成都郑源生化科技有限公司
公开（公告）号： CN112110833A
摘要： 本发明涉及一种Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH的制备方法，属于多肽合成技术领域。所述Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH的制备方法包括如下步骤：将H‑Lys‑OR或其盐与4‑甲基三苯基氯甲烷、碱混合催化反应得Mtt‑Lys(Mtt)‑OR，所述R为C1—C4烷基；将Mtt‑Lys(Mtt)‑OR酸解皂化反应得到H‑Lys(Mtt)‑OH；将H‑Lys(Mtt)‑OH与Fmoc‑OSu用溶剂溶解，加碱催化反应后纯化得Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH。本发明的制备方法的生产效率高，产品的收率也高，操作简单、成本低，适应于现代工业生产。本发明也不需使用腐蚀性强的三甲基氯硅烷，环保处理费用低。
【专利/发明】 • CN201910679251.X • •
申请日：2019-07-26,
公开日：2020-06-02
申请人： 翔宇药业股份有限公司
公开（公告）号： CN111217892A
摘要： 本发明属于氨基酸技术领域，公开了一种卡贝缩宫素的合成方法，其包括如下步骤：以Fmoc‑Gly‑OH以及氨基树脂Rink Amide‑MBHA Resin为起始原料，首先使用20% DBLK溶液脱除Fmoc保护基，进行缩合，得到Fmoc‑Gly‑Rink Amide‑MBHA Resin，然后依次连接Fmoc保护氨基酸，连接完成后脱除Fmoc保护基，与4‑溴丁酸进行缩合；然后使用弱酸体系脱除半胱氨酸上的Mtt保护基，再进行环化，得到卡贝缩宫素肽树脂，然后对肽树脂进行切割，将得到的粗肽进行纯化，即得到卡贝缩宫素的纯肽。本发明方法简单可行，操作方便，适合规模化生产。
【专利/发明】 • CN201811653796.5 • •
申请日：2018-12-31,
公开日：2019-03-12
申请人： 江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司
公开（公告）号： CN109456403A
摘要： 本发明是一种利拉鲁肽的合成方法，属于多肽合成领域。该方法通过固相合成利拉鲁肽主序列的第1‑31位氨基酸，第10位Val与第11位Ser采用Fmoc‑Val10‑Ser11(Psi(Me，Me)pro)‑OH；第20位Lys侧链采用Fmoc‑Lys(X)‑OH，所述的X选自：Alloc，Dde，ivdde，Mtt，Pal‑γ‑Glu‑OtBu；经裂解沉淀得到利拉鲁肽粗肽；经纯化得到利拉鲁肽。本发明方法通过引入Fmoc‑Val10‑Ser11(Psi(Me，Me)pro)‑OH来解决利拉鲁肽困难序列合成问题，使得困难序列的合成变的简单易操作，同时极大的提高了收率和粗肽的纯度，大大降低了生产成本，利于进行工业化放大生产。
【专利/发明】 • CN202411909325.1 • •
申请日：2024-12-24,
公开日：2025-03-28
申请人： 四川鸿日医药科技有限公司
公开（公告）号： CN119707960A
摘要： 本申请公开了一种侧链Fmoc‑His(Mtt)的制备方法，涉及多肽合成技术领域。制备方包括将Fmoc‑His‑OH置于反应瓶中，加入适量的溶剂DCM，并加入(CH3)3SiCl，控温回流2小时，随后加入碱Et3N/DIPEA作为缚酸剂，反应至溶液清澈；控温至10‑20℃，分批加入Mtt‑Cl和Et3N/DIPEA，升温至23‑28℃反应过夜，得到含有侧链氨基的Fmoc‑His(Mtt)；通过萃取、浓缩、重结晶、搅洗、过滤和干燥等步骤，获得Fmoc‑His(Mtt)的最终产物；主要原料Fmoc‑His‑OH：(CH3)3SiCl：DIPEA：Mtt‑Cl摩尔比为1:1.5:2.35:1.15时效果最佳，最终获得的Fmoc‑His(Mtt)的收率可达到96％以上，纯度高于99％。
【专利/发明】 • CN201911376872.7 •
+1位作者
•
申请日：2019-12-27,
公开日：2021-06-29
申请人： 深圳翰宇药业股份有限公司
公开（公告）号： CN113045623A
摘要： 本发明公开了一种蛇毒肽SYN‑AKE的液相合成方法，包括以下步骤：化合物Trt‑β‑Ala‑Pro‑OH的合成；化合物Fmoc‑Dab(Trt)‑NHBzl的合成；化合物H‑Dab(Trt)‑NHBzl的合成；化合物Trt‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Trt)‑NHBzl的合成；蛇毒肽SYN‑AKE：H‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Trt)‑NHBzl的合成。在合成的过程中以Trt‑β‑Ala‑OH，Fmoc‑Dab(Trt)‑OH为原料避免使用LiOH处理氨基酸酯的反应，减少反应步骤，降低消旋杂质产生，提高了中间体纯度。通过重结晶获得高纯度Trt‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Trt)‑NHBzl后用醋酸溶液脱除Trt，最用乙醚沉淀后直接得到SYN‑AKE的醋酸盐，避免使用强腐蚀性的三氟乙酸作裂解试剂，环境友好，同时避免了制备纯化转盐过程，节约了成本。
【专利/发明】 • CN202411626542.X •
+4位作者
•
申请日：2024-11-14,
公开日：2025-02-25
申请人： 四川什邡市三高生化实业有限公司
公开（公告）号： CN119504502A
摘要： 本申请提供了一种Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH的制备方法，以式(I)所示的Fmoc‑Lys·HCl为起始原料，在有机碱存在条件下与式(II)所示的Mtt‑Cl反应合成式II(I)所示的Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH，简化了工艺、且操作简单、反应条件温和，降低了工业化生产难度，不涉及贵重原料，有利于控制生产成本，获得的Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH纯度高、收率高。实验结果表明，本申请提供的制备方法制备得到的Fmoc‑Lys(Mtt)‑OH收率达80％以上，纯度达99％以上。
【专利/发明】 • CN201811292613.1 •
+1位作者
•
申请日：2018-11-01,
公开日：2021-08-13
申请人： 汉肽生物医药集团有限公司
公开（公告）号： CN109180801B
摘要： 本发明采用固相化学的方法制备索玛鲁肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。该方法首次采用Fmoc‑Lys(N‑ε‑ADO‑ADO‑(γ‑Glu(N‑α‑X)‑OtBu)‑OH参与固相合成索玛鲁肽(其中谷氨酸α氨基保护基X为Alloc、Mmt、Mtt、Dde或ivDde),然后脱掉保护基，在固相上脂肪酸化；同时针对索玛鲁肽工艺产生的缺1个Ala杂质肽；接18位和19位时采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH,避免这一纯化过程中难以除去杂质的生成；为避免产生±Gly的工艺杂质，引入Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH和Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly–OH两个二肽作为单体参与合成；通过引入这四个个片段肽参与索玛鲁肽的固相合成，提高了粗肽纯度，降低了纯化难度，降低了生产成本。
摘要： 增生性瘢痕(Hypertrophic Scar,HTS)是烧伤领域常见的病理性瘢痕,据报道称烧伤创面愈合后30%～91%的患者在创面愈合后继发增生性瘢痕。成纤维细胞作为增生性瘢痕的主要效应细胞,在增生性瘢痕的形成中起到重要作用,因此针对成纤维细胞的研究逐渐在瘢痕修复领域成为热点。目前研究普遍认为,创面的局部感染、炎症是导致成纤维细胞表型改变的重要因素。为此,国内研究者通过特定剂量的内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)对成纤维细胞进行培养,通过实验数据分析和基因芯片技术,得到与患者增生性瘢痕内成纤维细胞表型类似的细胞模型。本研究通过LPS刺激成纤维细胞的体外实验模型进行信号通路方面的研究。目的:通过应用LPS刺激成纤维细胞的体外实验细胞模型,观察不同刺激浓度和不同刺激时间对丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活情况,确定LPS对成纤维细胞MAPK信号通路的三个主要亚通路Erk、JNK、p38的激活或抑制,以及亚通路对刺激剂量和刺激浓度的反应,确定本研究适宜的细胞刺激模型;其次通过该模型及相应通路的抑制剂对亚通路进行抑制,观察皮肤成纤维细胞增殖的改变、分泌TGF-β 1和IFN-γ的改变、Ⅰ型Ⅲ型胶原蛋白的表达合成及分泌的改变。方法:(1)采用 Western Blotting 的实验方法检测 Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38在各组中的表达情况,分时间差异和浓度差异进行两次实验。第一组:内毒素浓度0.1ug/mL刺激Oh、24h、48h、72h;第二组:刺激48h但不同的LPS浓度 0ug/mL、0.005ug/mL、0.01ug/mL、0.05ug/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL 以及 1ug/mL。(2)采用 MAPK/JNK 抑制剂 SP600125 和 MAPK/Erk 抑制剂 PD98059(浓度10uM,抑制时间6小时)对第一部分激活的MAPK信号通路的亚通路进行抑制,随后制作体外模型,检测正常皮肤成纤维细胞各项指标的改变:(2-1)人正常皮肤成纤维细胞增殖的改变:应用倒置显微镜观察成纤维细胞的形态学,MTT法检测人正常皮肤成纤维细胞的增殖曲线,台盼蓝染色检测成纤维细胞的增殖数量,流式细胞仪检测成纤维细胞的增殖周期。(2-2)人正常皮肤成纤维细胞分泌TGF-β 1和IFN-y水平的改变:应用免疫组化检测细胞表型的改变,应用透射电镜观察细胞的超微结构,ELISA法检测细胞分泌TGF-β 1和IFN-γ的水平。(2-3)人正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达、合成及分泌的改变:使用3H-脯氨酸掺入率法检测细胞胶原DNA的合成,使用RT-QPCR法检测细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达,运用免疫荧光染色检测细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达,运用ELISA法检测细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原和羟脯氨酸的水平。结果:(1)相同浓度LPS不同刺激时间结果提示:同对照组相比,实验组的p-JNK和p-Erk增加程度随着刺激时间逐渐增加。不同浓度LPS刺激结果提示:随着LPS浓度提高,MAPK/JNK和MAPK/Erk激活逐渐明显并在LPS浓度为0.1ug/mL时达到最高激活。(2-1)人正常皮肤成纤维细胞增殖的改变:同对照组相比,单独抑制组细胞增殖曲线、增殖数量、细胞周期均较低,双抑制组最低。(2-2)人正常皮肤成纤维细胞分泌TGF-β 1和IFN-y水平的改变:同对照组相比,单独抑制组α-SMA和α1(Ⅰ)表达低,细胞损伤更为严重、TGF-β 1含量低,IFN-γ含量高,双重抑制组趋势更明显。(2-3)人正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达、合成及分泌的改变:同对照组相比,单独抑制组胶原DNA合成减少、Ⅰ型Ⅲ型胶原mRNA减少、上清液Ⅰ型Ⅲ型胶原减少,双重抑制组趋势更明显。结论:(1)内毒素在增生性瘢痕体外模型中,内毒素刺激了 MAPK/Erk和MAPK/JNK信号通路的激活,这可能是皮肤成纤维细胞的表型改变的重要机制之一。(2)基于内毒素刺激成纤维细胞的体外模型,干扰激活通路会对皮肤成纤维细胞的表型改变及胶原合成有抑制作用,这也为增生性瘢痕的治疗提供了新的思路和治疗策略。
关键词: 内毒素 ；成纤维细胞 ；丝裂原活化蛋白激酶 ；信号通路 ；抑制剂
被引量
1
摘要： 前列腺癌(PCa)严重威胁人类健康,化疗在癌症治疗中非常重要,是目前临床PCa治疗不可或缺的手段。卡铂(CBP)为第二代二价铂Pt(Ⅱ)类抗癌药,对多种癌症均有很好的治疗效果,并被NCCN批准用于治疗前列腺癌。由于肿瘤代谢异常,肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)浓度是正常细胞的7～10倍,肿瘤细胞内GSH浓度(2～20mmol/L)是肿瘤细胞外(2～20μmol/L)的1000倍左右。GSH的巯基基团与Pt(Ⅱ)亲和力很高,会竞争性结合Pt(Ⅱ),减少Pt(Ⅱ)与DNA结合,从而降低了 Pt(Ⅱ)的抗肿瘤活性。针对GSH介导的铂类药物耐药性,其解决措施主要包括以下三种:1)将Pt(Ⅱ)设计为还原敏感的四价铂Pt(Ⅳ),竞争性消耗GSH;2)应用GSH抑制剂,抑制GSH的合成;3)应用谷胱甘肽S转移酶(GST)抑制剂,抑制GSH与Pt(Ⅱ)的结合。Pt(Ⅳ)由于易于功能化修饰、具有高效的还原敏感性而备受关注。然而,Pt(Ⅳ)面临着体内分布缺乏选择性,毒副作用严重等问题。如何使Pt(Ⅳ)有效蓄积于肿瘤部位,竞争性消耗肿瘤细胞内的GSH,释放出活性Pt(Ⅱ),发挥Pt(Ⅱ)高效抗肿瘤作用仍然是铂类药物面临的重大挑战。纳米药物在药物递送领域展现了广阔的应用前景,为癌症治疗带来了希望。其中,小分子纳米药物(SMND)作为一种高性能的纳米药物引起了人们广泛关注。SMND是指低分子量的药物或药物衍生物在水溶液中自发组装形成稳定的超分子纳米聚集体。SMND在诸多方面展现了独特的优势:(1)可自发组装形成热力学稳定态的纳米粒子;(2)纳米粒由药物或其衍生物组成,无需或几乎没有辅料参与,载药量高,同时避免了大分子材料引入造成的代谢问题和毒副作用;(3)化学结构和制剂组分确定;(4)保留传统纳米药物的优势,如提高药物在肿瘤部位的蓄积,增强抗肿瘤效果,降低毒副作用。基于SMND理念,本课题设计了基于四价卡铂(CBP(ⅣV))的小分子纳米药物。首先将卡铂(CBP)氧化得到四价的羟基化卡铂(CBP-OH(ⅣV)),并将其作为极性部分,与生物相容性良好的非极性部分月桂酸,通过酯键共价连接得到类磷脂的两亲性缀合物CBP-LA;CBP-LA可在水溶液中自发组装形成稳定、的四价卡铂小分子纳米药物CBP-LANPs;CBP-LANPs可有效的蓄积于肿瘤部位,被肿瘤细胞摄取后,竞争性地消耗GSH,保护CBP免于GSH的鳌和作用,增强CBP与DNA的结合作用,最终提高抗肿瘤效果。本课题主要研究内容及结果如下:1 两亲性缀合物卡铂—月桂酸的合成及含量测定方法的建立首先合成两亲性的CBP-LA缀合物,核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR)和高分辨质谱验证其结构。使用高效液相色谱法建立CBP-LA含量测定方法,并对其进行方法学考察。结果表明CBP-LA缀合物成功合成,CBP-LA在50～1250 μg/mL浓度范围内线性良好(R=0.9996)。CBP-LA在低、中、高浓度的日内、日间精密度RSD均小于2%,方法回收率在98%～102%之间且RSD小于2%,符合方法学含量测定要求。2 小分子纳米药物CBP-LA NPs的制备及体外评价通过纳米沉淀法制备小分子纳米药物CBP-LA NPs,考察了其形态、粒径、电位、血浆稳定性,临界胶束浓度等理化性质。结果表明,两亲性缀合物CBP-LA可自组装形成稳定的纳米药物(CBP-LA NPs),其粒径为(72.0±2.41)nm,电位为-(27.1±1.42)mV。血浆稳定性实验表明,CBP-LANPs与血浆孵育后,可在24 h内保持粒径稳定;较低的CAC对于维持制剂的稳定至关重要,CBP-LA NPs的CAC值为1.4 μg/mL,表明其具有良好的稳定性。通过HPLC对CBP-LA的GSH敏感性降解进行了评价。缀合物CBP-LA的GSH降解实验表明,无论pH是7.4还是6.5,CBP-LA缀合物在GSH环境下的降解速率均高于无GSH环境下的降解速率,且在微酸性环境(pH 6.5)下的降解速率高于pH 7.4时的降解速率。这是由于CBP-LA可在GSH条件下被还原,在酸性条件下发生酯键断裂,从而释放出活性Pt(Ⅱ)。这对于实现药物在肿瘤部位释放具有重要意义。通过测定肿瘤细胞内GSH的浓度和Pt(Ⅱ)与DNA结合率考察了CBP-LANPs克服GSH介导的铂类药物耐药性的能力,与CBP溶液组相比,CBP-LA NPs组消耗GSH的能力和与DNA鳌和产生Pt-DNA的能力均显著性提高。这是由于在肿瘤细胞高浓度的GSH条件下,CBP-LA NPs可被GSH还原,从而保护Pt(Ⅱ)不被GSH鳌和,提高Pt与DNA鳌和的能力。通过MTT实验评价了CBP-LA NPs的细胞毒性。体外细胞毒性评价实验中,CBP-LA NPs与游离CBP溶液的IC50值相当,表明CBP-LA NPs可有效抑制PC3细胞和RM-1细胞增殖,与CBP溶液组具有相当的杀伤能力。以C6作为荧光探针,通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪考察了CBP-LA NPs的细胞内摄取,结果表明CBP-LA NPs具有良好的入胞效果。3 小分子纳米药物CBP-LA NPs的体内评价建立荷H22肿瘤细胞的小鼠模型,通过近红外小动物活体成像系统,考察了 CBP-LA NPs在小鼠体内组织的分布情况。结果表明,与游离的制剂相比,CBP-LA NPs能够增加药物在肿瘤部位的蓄积,减少其它正常组织的分布。以荷RM-1肿瘤细胞的C57BL/6小鼠作为前列腺癌模型对各药物体内抗肿瘤能力进行评价。结果表明,CBP-LANPs小鼠瘤体积及瘤重均低于CBP溶液组(P<0.05),表现出最佳的抗肿瘤效果。这主要归因于CBP-LA NPs的特异性肿瘤蓄积作用及对GSH相关耐药性的克服作用。CBP-LANPs能够有效的蓄积于肿瘤部位,到达肿瘤细胞后可竞争性消耗GSH并释放出活性Pt(Ⅱ),提高Pt(Ⅱ)与DNA的结合效率,最终增强Pt(Ⅱ)的抗肿瘤活性。通过H&E初步评价了 CBP-LANPs的体内安全性,与5%的葡萄糖组进行对比,CBP-LANPs治疗后各器官形态均未见可视化组织损伤,安全性良好。综上所述,本文构建了基于四价卡铂的小分子纳米药物CBP-LA NPs。所构建的SMND可有效蓄积于肿瘤部位,被肿瘤细胞摄取后,可竞争性消耗肿瘤细胞内的GSH,保护Pt(Ⅱ)免于GSH的鳌和作用,克服GSH介导的铂类药物耐药性,增加Pt-DNA结合效率,提高铂类药物的治疗效果。
关键词: 小分子纳米药物SMND ；卡铂 ；GSH介导的铂类药物耐药性 ；前列腺癌
摘要： 目的:糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰过程。异常糖基化在人类恶性肿瘤的发生与发展中起至关重要的作用。糖基化是将糖类与其他糖、蛋白质或脂质催化形成糖苷键的过程。通常,将糖基化根据多糖与蛋白之间形成糖苷键的起始过程发生的基团不同分类为:N-糖基化或O-糖基化两大类。N-连接糖基化中,糖链通过与新生肽链中特定天冬酰胺的自由-NH2基链接,其过程发生在内质网与高尔基体,通过寡糖基转移酶复合体催化完成;O-链接糖基化又主要分为Mucin-type O-糖基化和O-glcnac糖基化,O-糖基化中糖链连接于肽链中的丝氨酸/苏氨酸的-OH基,其过程发生于高尔基体,分别通过N-乙酰氨基半乳糖转移酶或N-乙酰氨基葡萄糖转移酶催化起始。而根据末端修饰的基团不同,最广泛发生的恶性肿瘤相关糖基化又主要分为:唾液酸化、O-聚糖截短和岩藻糖基化等。粘蛋白型O-糖基化为蛋白O-糖基化的最常见、最重要类型,其起始步骤由多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶（N-acetylgalactosaminyltransferases,GALNTs,GalNAc-Ts）催化,将GalNAc连接至糖蛋白的丝/苏氨酸残基上。这一修饰过程发生于高尔基复合体,受GALNT家族成员表达与分布的调控。已有研究证实,异常的Mucin-type O-糖基化在细胞增殖、凋亡、分化、粘附、迁移、侵袭、血管形成及入侵免疫系统等过程中发挥关键调节作用,乃至影响多种恶性肿瘤的复发与预后。近期报告中GALNTs被证实在恶性肿瘤中异常表达,且与不良预后显著相关。GALNTs表达失调在不同的恶性肿瘤中可能发挥相同或截然相反的作用。GALNT6表达与肺腺癌TNM分期呈显著正相关,并可作为预测其较差OS的独立预后因素,而在胰腺癌中,GALNT6高表达却是提示预后良好的独立预后因素。利用在线肿瘤基因表达谱芯片数据库ONCOMINE分析所有GALNTs在多种恶性肿瘤中表达情况,GALNT6在结肠癌组织显著高表达,其表达增高幅度及其在各个数据集中的一致性,是所有GALNTs在所有恶性肿瘤中最显著的。然而GALNT6在结肠癌中与预后的相关性及对细胞恶性生物学行为的影响目前均尚无报告。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）存在于血液肿瘤与实体恶性肿瘤,是具有自我更新与多向分化潜能的肿瘤细胞亚群。这些小群体的细胞赋予肿瘤耐药与转移的能力,是肿瘤发生发展的关键。防止复发和转移的关键是确定调节维持CSCs及其自我更新的分子靶点。醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenases,ALDHs）在多种实体恶性肿瘤及血液恶性CSCs中高表达,是广泛的干细胞标志物。已有报告指出,GALNTs介导的粘蛋白型O-糖基化通过促进或抑制干细胞通路中关键因子的活化,调节膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌干细胞的自我更新能力,这提示GALNTs与肿瘤CSCs的干细胞性有关。GALNT6及其他GALNTs成员与结肠CSCs之间的关系,以及与CSCs分子标记物,如CD44,ALDH等之间的关系,目前尚未见报告。GALNTs通过改变蛋白糖基化水平,影响其活化或下游信号通路变化。SWISS-PROT数据库的分析预测所有蛋白质中超过50%的蛋白存在糖基化。然而仅少量GALNTs底物蛋白在影响癌症恶性表型中被验证。目前已有研究在不同癌症类型中报告了GALNTs表达差异具有蛋白表达谱变化。关于GALNT6已有研究报告指出GALNT6通过粘蛋白型O-糖基化活化并稳定粘蛋白1（Mucin 1,MUC1）的表达,从而促进乳腺癌发生。以小干扰RNA敲减GALNT6能够显著促进乳腺癌细胞粘附,抑制细胞增殖。GALNT6同样可以促进纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）的粘蛋白型O-糖基化,使乳腺MCF10A细胞系在GALNT6过表达时表现出侵袭增强的特征,在3D培养系统中促进对完好腺泡结构的破坏。然而在MUC1与FN表达均不占优势的三阴性乳腺癌细胞中GALNT6是否同样能够发挥类似功能,且是否有其他一种或多种底物蛋白参与其中尚为未知。作为与恶性肿瘤密切相关的糖基化类型,异常的岩藻糖基化在包括肺腺癌在内的多种恶性肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成及耐药过程中均发挥重要作用。岩藻糖基转移酶4（fucosyltransferase IV,FUT4）为合成肿瘤相关糖类抗原的关键酶,催化L-岩藻糖由GDP-岩藻糖向底物的转移过程,从而参与Lewis A,B,X与Y的合成。FUT4在包括白血病、胃癌和乳腺癌等恶性肿瘤中高表达,与肿瘤进展密切相关,但FUT4与癌症预后关系的报告迄今甚少。早期有研究报告FUT4和/或FUT7在基因水平表达上调与肺癌缩短的生存期呈正相关。但由于分期系统及治疗策略在二十多年间已发生了剧变,有必要对FUT4在肺腺癌中的预后作用进行重新评价。基于在线肿瘤基因表达谱数据库ONCOMINE中GALNT6在多种恶性肿瘤中的表达情况,有绝对多数量研究显示GALNT6在结肠癌与乳腺癌中高表达的结果,本论文第一、二部分分别研究GALNT6在结肠癌、乳腺癌组织中表达情况及其预后价值,并以结肠癌细胞系RKO、HCT-116以及乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7与MDA-MB-468为研究对象,研究GALNT6影响结肠癌、乳腺癌恶性表型的作用,利用在线数据集推测GALNT6在结肠癌中调节的重要信号通路,通过糖基化组学方法评价GALNT6在乳腺癌中调节上清中新底物的粘蛋白型O-糖基化,分别在分子水平对GALNT6促进结肠癌、乳腺癌恶性表型的机制进行了探讨与验证。第三部分研究通过在线数据评价FUT4在肺腺癌中的预后作用,利用生物信息学方法推测FUT4调控肺腺癌机制的重要信号通路,同时采用病理标本对肺腺癌预后及机制进行了免疫组化验证。研究方法:1、利用在线数据集ONCOMINE评价GALNT6在结肠癌与正常组织中mRNA表达水平,利用TCGA数据库评价FUT4在肺腺癌与正常组织中mRNA表达水平。2、利用在线数据集SurvExpress数据进行荟萃分析,评价GALNT6在结肠癌、乳腺癌中GALNT6与OS及DFS关系,利用TCGA及Kaplan-Meier Plotter数据库预测及在线验证FUT4与肺腺癌OS关系。3、采用本医院肺腺癌队列,利用免疫组化方法验证FUT4在肺腺癌中的表达及预后作用。4、FUT4与临床病理学参数的相关性分析。5、FUT4与临床病理学参数对肺腺癌预后的单因素与多因素分析,并构建列线图及校正曲线。6、利用TCGA数据集结肠癌与肺腺癌数据进行基因集富集分析（Gene set enrichent analysis,GSEA）,寻找GALNT6与FUT4差异表达相关的KEGG通路。7、利用TCGA数据进行FUT4与免疫抑制分子的相关性分析。8、采用本医院肺腺癌队列验证,利用免疫组化方法验证FUT4与免疫抑制分子PD-1相关性。9、构建靶向GALNT6基因的化学合成siRNA和过表达真核质粒载体,转染结肠癌、乳腺癌细胞系。10、构建靶向沉默和过表达GALNT6基因的慢病毒表达载体,建立稳定转染的结肠癌、乳腺癌细胞系。11、MTT法测定细胞活力。12、集落形成实验观察处理前后细胞克隆的形成。13、Transwell法检测细胞迁移与侵袭能力。14、利用Lipofectamine 2000试剂瞬时转染GALNT6的siRNA。15、流式细胞术检测细胞CD44+ALDH+细胞表达。16、Real-time PCR技术检测ALDH1A1,ALDH1B1,ALDH2,ALDH5A1,ADLH6A1,ALDH7A1等mRNA表达水平。17、Western blot检测GALNT6,AKT,p-AKT,E-cadherin,Vimentin,ZEB1,slug和β-actin等蛋白的表达。18、VVA免疫沉降技术检测底物蛋白糖基化水平。19、所有数据采用3次独立实验结果,以均值±标准差（x±s）进行表示。采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。组间比较采用t检验,P<0.05有统计学意义。结果:1、在线数据集ONCOMINE结果提示,大量研究表明GALNT6在结肠癌组织中的mRNA水平显著高于正常组织。2、利用在线数据集SurvExpress中结肠癌相关研究进行荟萃分析,结果提示GALNT6高表达与结肠癌较差的OS与DFS呈显著正相关。3、MTT与集落形成实验结果提示沉默GALNT6可抑制结肠癌细胞增殖,过表达GALNT6可促进结肠癌细胞增殖。4、细胞迁移实验发现,与对照组相比,沉默GALNT6后结肠癌细胞迁移能力下降,而过表达GALNT6后结肠癌细胞迁移能力增强。提示GALNT6具有促进结肠癌细胞转移的作用。5、利用TCGA结肠癌数据集进行GSEA以明确GALNT6高表达导致结肠癌不良预后的分子机制。GSEA结果提示GALNT6高表达与KEGG_缬氨酸_亮氨酸_异亮氨酸降解通路,KEGG_丙酸代谢通路,KEGGO_多糖合成通路及KEGG_丁酸甲酯代谢通路等四个通路呈正相关。6、GSEA结果提示,GALNT6高表达通过促进CSCs标记物ALDH1B1,ALDH2,ALDH5A1,ALDH6A1,ALDH7A1等ALDHs表达进而促进结肠癌细胞恶性表型,提示GALNT6表达可能与结肠癌干细胞性有重要相关性。Real-time PCR实验检测过表达GALNT6前后结肠癌细胞ALDHs家族成员mRNA水平变化,均显著上调,与GSEA所得结果一致。流式细胞术检测结果提示,过表达GALNT6前后结肠癌HCT-116细胞CD44+/ALDH1A1+干细胞亚群所占比例显著上调。以上研究显示,GALNT6具有促进结肠癌干细胞性的能力。7、在线数据集ONCOMINE结果提示,大量研究表明GALNT6在乳腺癌组织中的mRNA水平显著高于正常组织。8、利用在线数据集SurvExpress中乳腺癌相关研究进行荟萃分析,结果提示GALNT6高表达与乳腺癌较差的OS呈显著正相关。9、MTT与集落形实验发现,与对照组相比,沉默GALNT6后乳腺癌细胞增殖能力下降,提示GALNT6具有促进乳腺癌细胞增殖的作用。10、Transwell实验发现,与对照组相比,沉默GALNT6后乳腺癌细胞迁移、侵袭能力下降,提示GALNT6具有促进乳腺癌细胞转移的作用。11、细胞迁移实验发现,与对照组相比,沉默高表达细胞GALNT6后其上清促进低表达细胞迁移能力的能力下降,提示GALNT6高表达细胞上清能够促进GALNT6低表达细胞的迁移能力。12、Western blot检测上皮与间质表型标志物表达情况,沉默GALNT6的MDA-MB-231细胞较NC组E-cad表达显著上调,Vimentin表达下调。转录因子ZEB1,Slug表达显著下调,提示GALNT6高表达通过促进EMT促进MDA-MB-231细胞转移。13、Western blot检测信号通路活化情况,与对照组相比,沉默GALNT6后PI3K/AKT信号通路活性明显受抑,提示GALNT6通过促进AKT活化促进乳腺癌细胞增殖与转移。14、沉默GALNT6导致乳腺癌Mucin-type O-糖基化水平显著下调。15、MDA-MB-231细胞株上清分泌蛋白的定性糖基化组学分析结果提示,AHSG、角蛋白、α2Μ与CBFA2T2等糖蛋白可能为GALNT6促进乳腺癌恶性表型的重要底物蛋白。16、在线数据集TCGA数据结果提示,FUT4在肺腺癌组织中的mRNA水平显著高于正常组织。17、利用在线数据集TCGA数据进行分析,结果提示FUT4高表达与肺腺癌较差的OS呈显著正相关,并在另一在线数据集Kaplan-Meier Plotter中得到了在线外部验证。18、本医院肺腺癌队列免疫组化结果提示,FUT4在肺腺癌中的表达与肺腺癌较差的OS呈显著正相关。19、FUT4与临床病理学参数的相关性分析结果显示,在本院肺腺癌队列中,FUT4与pN分期和pTNM分期呈显著正相关。20、FUT4与临床病理学参数对肺腺癌预后的单因素与多因素分析,
关键词: 结肠癌 ；乳腺癌 ；肺腺癌 ；GALNT6 ；FUT4 ；肿瘤干细胞 ；增殖 ；转移
被引量
1
摘要： 皮肤中的黑色素对人体有着重要意义,可以抵御外界刺激,保护机体正常生命活动。但是,黑色素的异常积累会产生皮肤问题,严重可导致皮肤癌变。当前大多数美白产品都以添加美白活性成分方式,从抑制黑色素生成、促进黑色素代谢等方面发挥作用。虽然市场上已有大量相关产品,但大多数存在损伤细胞或效果不佳等问题。因此,有必要探索更加有效和安全的美白活性成分。TSPO蛋白是存在线粒体上的18k D的转位蛋白,具有许多生理功能,包括细胞生长和增殖、甾体生成、细胞免疫和线粒体呼吸凋亡等。之前研究中已经发现,TSPO的异喹啉类配体PK11195对黑色素的合成有抑制作用,说明TSPO可以作为治疗色素类皮肤病的候选靶点,与之结合的小分子配体可能具有调控色素代谢的功能。FGIN-1-27作为TSPO的配体,具有促凋亡、抗焦虑和类固醇活性,是否可以调控黑色素合成代谢尚不明确。本文旨在研究FGIN-1-27对体内外酪氨酸酶活性的影响,对不同黑色素细胞及UVB诱导色素沉着的豚鼠皮肤的影响,验证其是否具有调控黑色素合成的功能,并对其作用机制进行研究。FGIN-1-27的合成:以3-(4-氟苯甲酰基)丙酸为起始原料,合成FGIN-1-27,其结构经NMR表征。FGIN-1-27与TSPO蛋白对接:使用Discovery Studio软件中的CDOCKER模块进行对接处理,选择8个TSPO蛋白不同的配体,通过一系列对配体和蛋白的处理,配体-受体结合,检测能量值。结果表明,FGIN-1-27与TSPO蛋白结合稳定性最高。FGIN-1-27对酪氨酸酶活性的直接作用:建立酪氨酸酶抑制剂的检测模型,选择最优条件:L-酪氨酸的浓度为2.5mmol/L,蘑菇酪氨酸酶的浓度为2000U/m L,反应时间为20min。通过此模型对蘑菇酪氨酸酶的活性进行测定,检测FGIN-1-27是否具有抑制活性作用,并与其他美白产品抑制效果对比。结果说明,FGIN-1-27对蘑菇酪氨酸酶活性没有直接抑制作用,FGIN-1-27不是酪氨酸酶的直接抑制剂。FGIN-1-27对黑色素合成的作用及作用机制:通过MTT细胞活力检测FGIN-1-27对细胞活力没有影响,不具备细胞毒性。通过Na OH裂解法及Masson-Fontana氨银染色法检测FGIN-1-27对黑色素生成的影响,结果说明,FGIN-1-27可以抑制黑素细胞刺激激素(a-MSH),内皮素-1(ET-1)及OAG(DAG类似物)诱导的黑色素合成。通过免疫印迹(Western blot)及免疫荧光定量实验测定FGIN-1-27对细胞黑色素合成及相关调控蛋白的影响。结果说明,FGIN-1-27主要通过抑制PKA、PKC和MAPK通路发挥作用。FGIN-1-27对豚鼠色素沉着模型的作用:建立UVB诱导的豚鼠色素沉着模型,采取对照给药的方式。通过直接观察,色度计测豚鼠皮肤色度值变化,Masson-Fontana氨银染色法和免疫组织化学染色验证FGIN-1-27对豚鼠局部皮肤黑色素生成和黑色素细胞数量的影响。结果说明,FGIN-1-27减少UVB诱导的豚鼠皮肤色素沉着,但没有减少黑素细胞的数量。
关键词: FGIN-1-27 ；黑色素生成 ；MITF降解 ；信号通路
摘要： 目的:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界范围内死亡率较高的恶性肿瘤之一,且其发病率高约占全部原发性肝癌病例的70%～85%。HCC主要的治疗方案包括手术治疗、放射治疗和药物治疗,其中手术治疗是首选方案。但是由于HCC病程早期无明显症状,50%以上患者诊断时已超出手术最佳时期。因此靶向药物治疗、介入治疗、放射治疗在更好的控制和治疗HCC中也十分重要。HCC的发生经历了细胞内信号通路的改变、肿瘤增殖代谢系统的改变以及局部肿瘤微环境的形成等极其复杂的多个过程。基于HCC发生和发展中基因表达谱的变化以及细胞内信号通路的改变等进行研究,可以筛选出潜在的治疗新靶点。而利用筛选得到的HCC治疗靶点的蛋白晶体结构,就可以进行靶向药物的设计。利用药物受体学说,可以基于靶点蛋白或其配体的3D结构设计出相应的靶向药物。以配体的肽模拟物为先导物,利用计算机模拟设计技术对其进行合理的结构改造,可以获得与特定蛋白亲和的多肽偶联药物。对此多肽偶联药物进行合成路线设计后,通过化学合成即可获得目标肽类化合物。本研究旨在筛选HCC潜在的治疗靶点,并进一步设计能与此靶点结合的靶向肽偶联药物,主要分为以下两部分研究内容:（1）基于生物信息大数据分析筛选HCC治疗新靶点:对HCC差异表达基因进行数据分析并结合临床病理参数相关性研究,筛选得到候选靶点CTAG2和PRSS3;（2）靶向PRSS3的多肽偶联药物设计及活性研究:基于PRSS3的3D空间结构进行计算机辅助药物设计得到靶向肽WZ-1。设计多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥的合成路线,通过化学合成获得靶向PRSS3的多肽偶联药物。研究方法:1、肝癌转录组数据的获取及差异基因筛选:本研究所用的RNA-Seq数据和相应临床数据从TCGA数据库中下载,包括374例HCC样本和50例癌旁配对样本。从Bioconductor下载的EdgerR用于筛选差异表达基因。分析TCGA数据库中肝癌组织和癌旁组织中差异表达的RNA,然后利用R语言对差异表达基因进行可视化展示,绘制火山图和热图。2、蛋白-蛋白相互作用网络构建:通过STRING数据库分析差异基因,构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,获得相应的TSV文件;利用cytoscaper软件进行网络分析,将TSV文件导入,设置起源节点和目标节点后,再通过四种拓扑分析法:MCC、DMNC、MNC、degree分别构建子网络,得到候选靶点基因CTAG2、NTS、GNG4、GAST、PRSS1和PRSS3。3、候选靶点基因表达与临床病理参数相关性分析:利用TCGA数据库分析候选靶点基因表达与不良预后及其它临床病例参数的相关性,并利用免疫组织化学染色检测CTAG2在肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织的表达情况。4、基因集富集分析:利用GSEA网站MsigDB数据库中获得的c2.cp.kegg.v6.1.symbols.gmt数据集,对根据CTAG2/PRSS3的表达分组的TCGA LIHC中患者肿瘤组织中RNA-seq数据进行缺省加权富集统计分析。富集结果主要参数具有显著性意义的标准设为NES>1.5,P<0.05。5、计算机辅助药物分子设计:基于候选靶点PRSS3的3D空间结构,利用MOE软件自动识别配体与PRSS3的结合位点,并确定其中的关键锚点。再通过多肽构象优化、分子对接和结合能量分析等进行合理药物设计。6、Fmoc固相合成法:以不溶性固体树脂作为载体,利用SPPS法从C端合成至N端得到靶向PRSS3的多肽。使用Fmoc保护Thr、Gly、Pro、Cys、Arg、Leu、Asp、Ile的氨基部分,利用Fmoc在弱碱性条件下易脱除的特性进行肽类的延长。再以Fmoc-e-Acp-OH为原料,通过线性合成方式在多肽序列上继续进行缩合反应,然后再与苯丁酸氮芥反应生成终产物。最后使用树脂裂解液处理后得到靶向PRSS3的多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥。7、RP-HPLC含量测定方法:多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥采用RP-HPLC法进行含量测定,对样品溶液进行线性关系考察、精密度考察和稳定性研究。8、细胞毒性检测:采用MTT实验检测多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肿瘤细胞的杀伤作用。9、数据统计分析:生存分析采用Kaplan-Meier曲线（log-rank检验）,非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验进行差异比较。Cox回归分析采用单变量和多变量分析。采用Wilcoxon秩和检验对免疫组化数据进行分析。CTAG2和PRSS3表达水平与HCC临床病理参数的相关性研究,采用Pearson Chi-square（χ2）test或Fisher精确检验进行分析。统计检验均采用SPSS软件16.0版（SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA）完成。所有分析均以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。结果:1、基于生物信息大数据分析筛选肝细胞肝癌治疗新靶点（1）差异基因的数据分析及候选靶点基因的确定:筛选TCGA数据库中肝癌患者肿瘤组织与癌旁组织的差异表达基因（DEGs）,得到显著上调DEGs共4750个。然后进行分子功能分析,结果表明这些DEGs与转录调控和转录辅抑制因子活性密切相关。构建的PPI网络并分析,结果提示CTAG2、NTS、GNG4、GAST、PRSS1和PRSS3可以作为候选靶点基因进行下一步研究。（2）CTAG2和PRSS3在肝癌组织中的表达与临床病理参数相关性分析:TCGA数据库中6个候选靶点基因在肝癌组织中的表达值均显著高于癌旁组织。基于单变量Cox回归分析结果,TNM分期（P<0.001）,AFP高表达（P=0.010）和CTAG2高表达（P=0.035）与患者的预后显著相关,提示CTAG2高表达组患者总体生存期显著缩短。此外CTAG2表达与年龄（P=0.003）、T分期（P=0.028）、TNM分期（P=0.028）和AFP（P=0.045）表达显著相关。PRSS3表达与诊断年龄（P=0.012）显著相关,但与性别、T分期、TNM分期和AFP表达等参数无相关性。结合候选靶点基因的肿瘤表达谱情况,我们将CTAG2和PRSS3视为重要的潜在肝癌的治疗靶点。（3）CTAG2和PRSS3相关KEGG信号通路分析:采用GSEA富集分析相关KEGG信号通路,CTAG2高表达样本富集到同源重组、细胞周期、DNA复制、碱基切除修复、磷酸戊糖途径、错配修复、核苷酸切除修复等KEGG信号通路;而PRSS3高表达组被显著富集到DNA复制、细胞周期、Ig A生成的肠免疫网络、错配修复、细胞因子受体相互作用等信号通路。结果提示CTAG2和PRSS3的相关KEGG信号通路可能与肿瘤细胞异常增殖有关。2、靶向PRSS3的多肽偶联药物设计及活性研究（1）PRSS3与其蛋白抑制剂相互作用关键锚点的确定:使用MOE对PRSS3及抑制剂的蛋白复合物结构进行结构细化,并确定抑制剂与PRSS3的相互作用位点。分析结果显示蛋白抑制剂的Pro13、Cys14,Arg15,Asp17残基为相互作用的关键锚点,即抑制剂通过这些氨基酸以氢键及氢键-离子键的作用嵌入到PRSS3的结合口袋中。（2）PRSS3靶向肽的设计与分子对接:以PRSS3抑制剂与受体的关键结合位点所在的多肽片段为多肽序列的模板（TGPCRADI）,并依此设计了18条含有8个氨基酸的多肽序列。使用MOE将设计的多肽与PRSS3受体进行对接,结果显示所设计的多肽其中6条模拟计算的结合情况显著优于模板肽序列（S score<-40）。其中多肽WZ-1可以较好的嵌入PRSS3的结合口袋且S分值最低,所以选定此多肽序列进行合成。（3）多肽WZ-1偶联药物的合成路线设计:选用Fmoc合成策略,以树脂与Ile的羧基以共价键进行连接。然后与Asp的羧基进行缩合反应,依照去保护基、缩合、洗涤、再去保护的循环过程进行肽链的延长。缩合反应采用的是活性酯法并以HOAt和DIC为偶联剂组合。最后以线性合成方式将linker和苯丁酸氮芥与多肽WZ-1连接得到多肽偶联药物。（4）多肽WZ-1偶联药物的合成:我们选用Wang树脂作为固相反应中的载体,同时确定了氨基酸与树脂投料比为4:1。以Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp（otBu）-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH和Fmoc-Thr（tBu）-OH等含保护基的氨基酸为原料合成多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥。使用MS进行结构确证,并经分析液相检测纯度为96.77%。（5）多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥含量方法学验证:多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥供试品溶液在室温48小时内稳定;以样品浓度对峰面积进行线性回归,试验结果表明样品峰面积与浓度（0.50～1.5mg/ml）范围间线性关系良好,线性回归方程为:y=8680x+109.29,相关系数r为0.9996;此含量分析方法重复性和中间精密度良好。（6）多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥的细胞毒性效果:MTT实验结果显示多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肝癌细胞株具有细胞毒性作用。结论:1、数据挖掘结合临床病理参数相关性研究等组合分析后,筛选得到2个候选靶点基因CTAG2和PRSS3。2、CTAG2在肝癌组织中高表达且与肝癌不良预后密切相关,但目前无可获得的CTAG2蛋白3D结构。PRSS3在肝癌组织中高表达,GSEA分析的相关KEGG信号通路与肿瘤增殖有关。3、多肽WZ-1通过虚拟计算显示以Pro、Cys、Arg等关键锚点与PRSS3的3D空间结构进行结合。4、多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥是以多肽WZ-1为靶向部位的PDC类化合物。5、合成的多肽WZ-1偶联苯丁酸氮芥对肝癌细胞系具有细胞毒性作用,可以作为新型抗肿瘤靶向药物候选物。
关键词: 肝细胞肝癌 ；拓扑分析 ；CTAG2 ；PRSS3 ；多肽偶联药物 ；药物设计
摘要： 目的:在前期的研究中,我们课题组设计合成了一系列不同分子骨架的新型黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XO）抑制剂,如异烟酰胺类、苯并咪唑-5-甲酰胺类和咪唑-4-甲酰胺类等,其中N-(4-(（3-氰基苯）氧基)-3-（1H-四唑-1-基）苯基)异烟酰胺(TS10,IC50=0.031μM)具有较好的体外XO抑制活性。基于前期分子模拟结果,我们推测TS10在体内会被XO靶向代谢为TS10-2-OH。本研究将通过体外定向XO抑制机制实验进行验证,并通过体外代谢实验、体外细胞毒性实验、急性高尿酸血症模型大鼠的体内药效学实验、正常大鼠血浆药代动力学实验和粪尿排泄实验,对TS10及其4'-戊氧基类似物TS06进行一系列研究,以期为新型XO抑制剂的研发提供新的思路。 研究方法: 1.体外XO抑制机制实验: （1）XO定向代谢实验: （1）定向代谢稳定性实验:将药物与XO和底物黄嘌呤在37℃条件下共孵育不同时间,在到达设定时间后使用预冷的含内标乙腈溶液终止反应,经过涡旋和离心处理后得到上清液进行HPLC-MS/MS定量分析。除此之外,还考察了在不含底物黄嘌呤的情况下,药物与XO的代谢稳定性。 （2）定向代谢产物鉴定实验:将药物与XO在37℃条件下共孵育8小时,在到达设定时间后使用预冷的含内标乙腈溶液终止反应,经过涡旋和离心处理后得到的上清液通过氮吹仪吹干后复溶,进行UPLC-Q-TOF-MS/MS全扫描定性分析,鉴定其代谢产物。 （2）定向代谢产物（TS10-2-OH）的合成:以市售2-氨基-4-硝基苯酚为原料,经过合环、烃化、还原、缩合四步反应得到TS10-2-OH。 （3）TS10-2-OH的体外XO抑制实验和分子对接:在确定定向代谢产物（TS10-2-OH）后,通过体外XO抑制实验研究了TS10-2-OH的体外酶抑制活性。并且进一步使用分子可视化操作平台软件MOE,通过分子对接技术阐述了TS10-2-OH与XO的构效关系。 2.体外代谢实验 （1）体外代谢稳定性实验:将TS10和TS06（1.25μM）分别与人工胃液、大鼠肝微粒体、大鼠空白血浆在37℃条件下孵育不同时间。在到达设定时间后使用预冷的乙腈（托匹司他,200 ng/m L）终止反应,经过涡旋和离心处理后得到上清液进行HPLC-MS/MS定量分析。 （2）体外代谢物鉴定实验:在体外代谢稳定性实验的基础上,扩大相应的孵育体系,延长孵育时间,上清液通过氮吹仪吹干后复溶,进行UPLC-Q-TOF-MS/MS全扫描定性分析。此外,本次研究通过将TS10与CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4和CYP3A5共孵育,初步进行体外肝微粒体酶系代谢表型的鉴定。 3.细胞毒性实验 在对数生长期收集培养的细胞,用0.25%胰蛋白酶进行细胞分散,用PBS稀释成单细胞悬液。然后将每种细胞类型接种到96孔板中并孵育24小时。将不同浓度的TS10和TS06加入到96孔板中。然后将这些板37℃温育24小时,加入20μL MTT溶液（5 mg/m L）并培养4小时。缓慢移去营养液,每孔加入100μL DMSO。使用酶标仪在490 nm处检测每个孔的光密度（OD）。 4.体内药效学实验 空白组、模型组、阳性对照组（托匹司他）、给药组（高、中、低剂量）,每组6只。急性高尿血酸模型通过大鼠腹腔注射氧嗪酸钾（300 mg/kg）造模。除空白组外,均需造模。阳性对照组和给药组大鼠从腹腔注射氧嗪酸钾一小时后分别灌胃给予托匹司他、TS10和TS06,空白组和模型组中大鼠灌胃给予同体积的羧甲基纤维素钠溶液。大鼠造模期间自由活动,自由进水。观察大鼠的扭体反应并检测大鼠血清中的尿酸含量变化。 5.正常大鼠血浆药代动力学及粪尿排泄实验 （1）HPLC-MS/MS定量检测方法的建立与确证:依据2018年美国食品药品监督管理局生物样品分析方法指导原则,分别建立了生物样品中TS10及其主要代谢产物TS10-hydrolysate和TS10-2-OH的HPLC-MS/MS分析方法;以及生物样品中TS06的HPLC-MS/MS分析方法,并且考察这些方法的专属性、灵敏度、线性、精密度和准确度、基质效应和提取回收率和样品稳定性。 （2）TS10在正常大鼠中的血浆药代动力学实验:6只SD大鼠经口服给药（TS10:16 mg/kg）后,于0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h从大鼠眼眶静脉丛采血,取上层血浆,经过蛋白沉淀法取得上清液,并在24h内进行HPLC-MS/MS定量分析;TS06在正常大鼠中的血浆药代动力学实验:6只SD大鼠经口服给药（TS06:14 mg/kg）后,于0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h从大鼠眼眶静脉丛采血,取上层血浆,经过蛋白沉淀法取得上清液,并在24h内进行HPLC-MS/MS定量分析。 （3）TS10在正常大鼠中的粪尿排泄实验:口服给药（TS10:16mg/kg）后,将6只大鼠转移到代谢笼中,分别收集1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d的尿液和粪便样本。称量粪便样品,并用10倍当量体积的去离子水使粪便样品匀浆。经过蛋白沉淀法取得上清液,并在24h内进行HPLC-MS/MS定量分析。 结果: 1.体外XO抑制机制实验揭示了XO作为TS10和TS06的代谢酶,特异性地催化TS10/TS06产生一种单羟基化产物（TS10-2-OH/TS06-2-OH）,说明当TS10/TS06特异性地结合于XO的钼喋呤口袋以后,在催化机制下TS10/TS06通过氧原子与钼喋呤发生了共价连接,以生成羟基化产物。TS10-2-OH的体外酶抑制实验表明,TS10-2-OH具有一定的XO抑制活性,是一种活性代谢物,但是活性低于TS10。分子对接研究显示,TS10-2-OH与XO具有良好的结合亲和力,但由于缺乏与XO的共价作用（在TS10的定向代谢中未检测到双羟基化产物）,TS10-2-OH的体外酶抑制活性低于TS10。 2.体外代谢实验结果表明,TS10和TS06在人工胃液中稳定性良好;TS10和TS06在大鼠肝微粒体中稳定性较差,可代谢为2种单羟基化代谢产物（TS-OHs）,其中酶代谢表征实验表明CYP2C9、CYP3A4和CYP3A5参与催化TS10-OHs的生成;在大鼠血浆中TS10/TS06主要通过水解代谢生成TS10-hydrolylate/TS06-hydrolylate,此外在血浆当中仍有少量单羟基氧化产物（TS10-2-OH/TS06-2-OH）。 3.通过MTT法测定TS10和TS06在人乳腺细胞（MCF10A）和人支气管上皮细胞（16HBE）的细胞毒性。结果表明在所有设定浓度下,两种细胞系存活率均高于80%,说明TS10和TS06均具有较小的细胞毒性。 4.造模后大鼠蜷缩少动,背部上弓,出现明显疼痛表现,扭体反应成阳性,血清当中尿酸含量与空白对照组相比明显升高,结果证明大鼠急性高尿血酸模型建立成功。给药组和阳性对照组在各时间点的血清中的尿酸含量均低于模型组,表明TS10及TS06对该急性高尿血酸模型大鼠具有治疗作用。此外TS10组较TS06组具有更为优秀的降尿酸能力。 5.（1）HPLC-MS/MS方法专属性、灵敏度、线性、精密度和准确度、基质效应、提取回收率和样品稳定性均符合要求。（2）TS10血浆药代动力学实验结果表明,TS10系统暴露量低,TS10和TS10-hydrolysate的浓度在给药后48 h内均低于定量下限（1 ng/m L）。但在大鼠血浆中能检测到TS10-2-OH,因此TS10-2-OH即为TS10在大鼠体内主要的存在形式,并以TS10-2-OH数据替代TS10计算了药代动力学参数。（3）TS10大鼠体内排泄实验表明,大鼠单次灌胃给药后,在粪便中能够检测到大量原型药、少量的TS10-hydrolysate和TS10-2-OH,在尿液中仅能检测到少量的TS10-2-OH。 结论: 在本次研究中,XO定向代谢实验显示,TS10和TS06作为XO的底物,可被催化生成一种单羟基化产物TS10-2-OH/TS06-2-OH,说明当TS10或TS06特异性地结合于XO的钼喋呤口袋以后,在催化机制下,TS10通过氧原子与钼喋呤发生了共价连接。因此,除别嘌醇和托匹司他外,TS10/TS06是一种新型共价XO抑制剂。此外,TS10-2-OH的体外酶抑制和分子对接研究表明,TS10-2-OH是一种低活性代谢产物,其活性降低的主要原因可能是TS10-2-OH无法与XO形成共价键。在体外代谢实验中,TS10和TS06在大鼠肝微粒体中表现出低稳定性,其主要代谢方式是由CYPs介导的单羟基化代谢（TS-OHs）。此外,TS10和TS06在血浆中也能发生转化,其主要为水解代谢物（TS10-hydrolysate/TS06-hydrolysate）。在MTT实验中,TS10和TS06在健康细胞系16HBE和MCF10A中都显示出低细胞毒性。药效学实验表明TS10和TS06均对急性高尿酸血症大鼠模型表现出明显的剂量依赖性降尿酸血作用。但是在同物质的量的条件下,其降尿酸能力均弱于阳性药托匹司他。大鼠血浆药代动力学和粪尿排泄实验表明,由于TS10在体内的快速代谢和较差的吸收能力,因此TS10具有较差的系统暴露量,这可能是TS10在体内降尿酸能力弱于阳性药的主要原因。综上所述,TS10是一种强大的基于机制的共价XO抑制剂,具有强大的降尿酸作用。鉴定的代谢物和观察到的不良口服吸收能力可以为未来的结构优化提供见解。
关键词: 异烟酰胺化合物 ；黄嘌呤氧化酶抑制剂 ；药效学 ；代谢稳定性 ；药代动力学 ；共价结合抑制机制
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