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摘要： GABA_B受体参与调控多种重要生理和病理过程,是重要药物靶点之一。目前,针对该受体的药物开发主要为其正位配体,上市药物非常有限。变构调节剂是GABA_B受体的新型配体,通过作用于GABA_B受体变构调节位点,特异性调控受体活性,具有很好的受体特异性和药理学特性。多种动物模型实验结果显示,GABA_B受体变构调节剂可以协同正位配体,有效改善如药物成瘾、疼痛等多种疾病症状,并具有不同于正位配体的药效特点。GABA_B受体变构调节剂生理效应机制较独特,具有较好的医药应用价值和前景,进一步的临床试验验证和变构调节剂精细作用机制的深入研究,将为新药开发提供新思路。该文介绍了GABA_B受体变构调节剂的最新研究及其应用进展,并对这类化合物的作用优势和应用前景进行概述。
关键词: GABAB受体 ；正位位点 ；正位配体 ；变构调节位点 ；变构调节剂 ；动物模型
被引量
3
摘要： 1,2,4-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物的代表性药物氯噻嗪被广泛应用于临床治疗,具有利尿和降压作用。近年来,以1,2,4-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物为母核的化合物展现出改善认知功能、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等多种药理活性,因此该类化合物已成为当前研究的热点。本文系统总结了近年来1,2,4-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物衍生物的国内外研究成果,重点综述了其结构改造和活性研究进展,总结发现1,2,4-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物可以作为α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)和红藻氨酸(KA)受体变构调节剂改善神经功能;对PI3K等癌症相关靶点具有较好的抑制活性;通过抑制HCV NS5B聚合酶发挥抗病毒活性;对糖尿病相关疾病靶点如醛糖还原酶、丙酮酸脱氢酶具有较高抑制活性;此外,该类化合物在抗菌、抗虫和抗氧化等方面也有新的研究进展。本文汇总了这些研究成果并分析了其构效关系,旨在为广大研究人员提供研究依据和思路。
关键词: 1,2,4-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物 ；研究进展 ；中枢神经兴奋作用 ；抗肿瘤 ；抗病毒 ；糖尿病
摘要： γ-氨基丁酸B型(GABA_B)受体是中枢神经系统主要抑制性神经递质GABA的代谢型受体,由GABBR1和GABBR2两个基因共同编码,属于C族G蛋白偶联受体,其介导GABA系统的功能紊乱与许多神经疾病有关,如焦虑、抑郁、癫痫、自闭症、药物成瘾和精神分裂症等。GABA_B受体相关基因及其多态性变异体参与了多种疾病的病因学过程,受体基因突变和疾病关联性研究为疾病的理解提供了新途径,也为疾病的诊断和治疗提供了潜在新靶标。本文重点对GABA_B受体编码基因相关突变和神经类疾病的关联性分析研究、不同突变和疾病具体表型的关联研究以及受体突变如何影响受体功能等方面最新进展进行综述。同时,对受体突变的可能致病机制提出了初步设想,并有针对性地指出了受体变构调节剂在相关疾病治疗领域的潜在应用,以期为这些疾病的诊断和治疗提供有效的帮助。
关键词: γ-氨基丁酸B型受体 ；GABBR1基因 ；GABBR2基因 ；神经疾病 ；变构调节剂
被引量
6
【会议论文】 • 王献
会议时间： 2015-10-16
摘要： 药物的代谢产物分析在生命科学以及医药学等领域发挥着极其重要的作用。探究药物的代谢产物以及代谢途径有助于评价新药的药物代谢动力学特征,通过研究候选药物的代谢转化、代谢产物分离鉴定从而进行药理及毒理筛选,为新药的设计和开发提供思路。近些年来,质谱分析在药物代谢研究领域发展十分迅速,尤其是高分辨串联质谱以其高分辨率和突出的定性分析能力等优势逐渐成为研究药物代谢产物及代谢转化途径的强有力工具[1]。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统的抑制性神经递质[2],GABAB受体是G蛋白偶联受体的一种,由于GABAB受体与很多神经系统疾病有关[3-4],如抑郁、焦虑、药物成瘾等,而被认为是一种非常有潜力的药物靶点。CGP7930是一种GABAB受体的正向变构调节剂,有可能代替传统的GABAB靶点药物,开发出副作用小,具有温和的抗焦虑作用、抗药物滥用和治疗精神类疾病的新型药物,而成为生物医学领域的研究热点[5]。本文采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间高分辨串联质谱方法(HPLC-Q-TOF MS/MS)对CGP7930代谢产物进行了鉴定分析,通过原药和代谢物的MS/MS特征碎片离子解析,推测出CGP7930经过肝微粒体P450酶系催化氧化得到的羟基化代谢产物,确认了代谢产物单羟基化的活性位点,并推导了MS/MS碎片离子的裂解机理。CGP7930单羟基化代谢产物的裂解途径主要包括麦氏重排反应和α-裂解(图1)。
关键词: 药物代谢 ；串联质谱 ；裂解机理 ；CGP7930
摘要： G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCR）是人体内庞大的膜蛋白受体家族,几乎参与了所有的生理和病理过程,是非常重要的药物靶标。随着结构功能研究的发展,多种以单体形式发挥功能的GPCR复合物结构已经被解析。单体GPCR偶联G蛋白采用相似的模式:即受体的激活使跨膜结构域（Transmembrane domain,TM）第六个螺旋发生外移,进而形成较大的口袋用于结合Gα亚基的C末端。然而,这种偶联G蛋白的机制是否在以二聚化形式发挥功能的C类GPCR中保守仍然未知。代谢型γ-氨基丁酸受体（γ-aminobutyric acid receptor type B,GABAB）是第一个被发现和证实的GPCR异源二聚体。GABAB受体广泛表达在中枢神经系统,通过GABA介导慢速、长效的应答,参与学习、记忆和突触信号传递等重要的生理进程。GABAB受体由GB1和GB2两个亚基组成,其激活过程采取典型的反式调节机制,由GB1的胞外域结构（Extracellular Venus flytrap,VFT）负责配体识别,而GB2亚基的TM偶联G蛋白调控下游多种信号。由于缺乏整体结构的支撑,GABAB受体激活过程的构象变化、G蛋白偶联模式等问题均未被揭示,严重阻碍了人们对C类GPCR激活机制的理解以及特异性药物的研发。本课题主要使用单颗粒冷冻电镜技术以及多种细胞内信号检测技术,通过比对多种状态条件下的高分辨率结构,来阐释GABAB受体的结构基础、配体口袋、激活机制以及G蛋白偶联模式。GABAB受体在非激活状态时GB1和GB2亚基的VFT都处于打开状态,TM区则由TM3-TM5/TM3-TM5形成相互作用界面。GABAB受体在激活状态时GB1亚基的VFT关闭,GB2亚基的VFT旋转,进而引起两个亚基之间的TM界面重排,形成了TM6/TM6的作用界面。所使用的正向变构调节剂（Positive allosteric modulator,PAM）结合在一种特殊的口袋,通过镶嵌在两个亚基的界面并稳定了受体的激活形态。GABAB受体采取独特的偶联Gi蛋白模式:一方面GB2-TM3上的关键性氨基酸F568发生旋转,TM3和TM5底部发生较小幅度的外扩,使三个胞内环（Intracellular loops,ICLs）形成一个较浅的口袋。另一方面G蛋白上G.H5.23氨基酸的类型决定了GABAB受体主要偶联Gi亚型蛋白。GABAB受体的激活并没有像其它类型GPCR发生了典型的TM6偏转,而是采用了一种新颖的非对称性激活机制。本工作首次完整鉴定非激活状态、激活状态、以及G蛋白偶联状态GABAB受体的高分辨电镜结构,全面揭示C类GPCR激活时的构象转变过程以及G蛋白偶联新机制。其次,GPCR二聚化逐渐成为具有发展前景的药物靶标,本文所揭示新颖的PAM口袋填补了GPCR二聚体药物口袋研究领域的空白,将有效推动靶向GPCR二聚体特异性药物的研发。因此,本研究对于推动GABAB受体,C类GPCR乃至多种GPCR二聚体的研究具有重大意义。
关键词: G蛋白偶联受体 ；GABAB受体 ；信号转导 ；构象变化 ；非对称性激活
摘要： 代谢型γ-氨基丁酸B型受体（Metabotropicγ-aminobutyric acid receptor B,GABABreceptor）属于C族G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor,GPCR）,由两个亚基GB1和GB2组成。GABAB受体是重要的抑制性神经递质受体,其功能异常与多种疾病相关。据报道,编码GB2亚基的GABBR2的A567T、A707T突变与雷特综合征相关,S695I和I705N突变与癫痫性脑病有关,G693W、G440R、T394M突变与发育和癫痫性脑病相关。然而这些突变对GABAB受体功能的影响尚不明确。
因此,本课题以人源GABBR2的A567T、A707T、S695I、I705N、G693W、G440R、T394M突变为对象,采用酶联免疫吸附实验、胞内钙离子释放的检测、磷酸肌醇积累检测和生物发光共振能量转移技术在细胞水平检测了这些突变对受体功能的影响。结果显示,G440R突变影响了受体的上膜。进一步检测受体下游信号通路发现,A567T、G693W、S695I、I705N、A707T突变增强了受体的组成性活性,进而降低了受体下游信号对激动剂的响应。最后,研究发现A567T、G693W、S695I、I705N、A707T、G440R突变型受体激活下游不同亚型Gi/o蛋白具有偏向性,这些突变对受体激活下游Go A、Gi1、Gi2蛋白的影响趋势基本一致,而对受体激活下游Go B、Gi3蛋白的影响则呈现出不同的趋势。
综上,本课题研究了神经疾病相关的GABBR2 A567T、A707T、S695I、I705N、G693W、G440R、T394M突变对受体下游信号的影响,发现A567T、G693W、S695I、I705N、A707T突变增强了受体的组成性活性进而影响下游信号,并且突变体A567T、G693W、S695I、I705N、A707T、G440R介导了偏向性的Gi/o蛋白信号通路,暗示了GABAB受体通过偏向性激活不同G蛋白进而调控不同神经功能的信号机制,并为以GABAB受体变构调节剂为基础的药物开发提供了相关理论基础。
关键词: GABAB受体 ；GABBR2突变 ；神经系统疾病 ；组成性活性 ；Gi/o蛋白
被引量
1
摘要： 阿尔兹海默症（Alzheimer disease,AD）是中枢神经系统退行性疾病,是一种常见的老年痴呆症。其临床症状表现为认知能力下降、不可逆记忆丧失、语言功能障碍等。随着人口老龄化,AD患病率呈逐渐递增趋势。在AD临床症状出现之前,病理过程在大脑中已经持续数年甚至数十年,因而当前临床使用的药物并不能治愈AD或阻止病情发展,只能在一段时间内减轻症状。因此,开发预防或早期诊断AD的有效方法迫在眉睫。PET技术,是比较先进的临床检查影像技术,具有高灵敏度、高特异性、无创伤且安全性好等特点。PET诊断技术是利用放射性核素标记的PET示踪剂在人体不同部位聚集分布情况,结合成像技术对疾病进行诊断。PET诊断技术已应用在肿瘤、神经系统疾病和精神病以及心血管疾病这三大类疾病的诊疗中。目前PET诊断技术已初步应用于AD的诊断,是较先进的AD早期诊断技术,但仍缺乏灵敏度高、特异性好的PET示踪剂。本论文研究合成了3种11C标记和1种18F标记的PET示踪剂作为潜在的AD早期诊断的示踪剂。1、γ-分泌酶与Aβ42的产生密切相关。γ-分泌酶调节剂（GSMs）可以选择性的转移γ-分泌酶的切割位点,形成更短、更可溶的肽,从而抑制大多数淀粉样蛋白和神经毒性Aβ42的产生。通过文献研究,我们选用体内外高活性和高选择性的化合物5-(7-(（4-氟苯基）氨基)-4,5,6,7-四氢苯并[d]异唑-3-基)-2-（4-甲基-1H-咪唑-1-基）苯酚（2-11）为目标化合物,合成了用于放射性核素标记的前体化合物2-10和标准化合物2-11。通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS等现代仪器方法确定了结构。利用放射性核素11C对前体化合物2-10标记合成了2-12。Chemdraw计算化合物2-12的Log P值为4.32。化合物2-12作为以GSMs为靶点的AD早期诊断PET示踪剂的相应PET影像研究正在进行中。2、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR）是离子型受体的一种,介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递。Aβ在神经元之间的聚集可造成突触功能障碍和记忆障碍,AMPARs正变构调节剂调节AMPARs信号,可以缓解认知功能障碍。在本研究中,我们合成了一种用于11C放射性核素标记的AMPARs调节剂的前体化合物3-9和标准化合物3-10,通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS等现代仪器方法确定了其结构。利用同位素标记的方法合成了11C标记的可以用作PET示踪剂的化合物3-11a。通过对比化合物3-11a与多种进入临床实验的AD诊断PET示踪剂的Log P和Clog P值表明,化合物3-11a与其相当,具有较好的亲脂性。化合物3-11a作为新型潜在示踪剂,结合PET成像技术,可用于突触功能障碍患者的体内成像,有望成为突触可塑性的潜在PET诊断剂。3、姜黄素可与β-amyloid蛋白特异性结合以减少体内Aβ沉积。我们利用姜黄素的结构特性,以Aβ为靶点,设计合成了两种稳定的姜黄素衍生物,包括其前体化合物4-2、标准化合物4-3a和4-3b。利用1H-NMR、13C-NMR、HRMS等现代仪器方法确定了结构。利用放射性同位素标记方法,合成了Aβ潜在靶向的PET示踪:11C标记的化合物4-4a和18F标记的化合物4-4b。通过测定4-3a、4-3b和姜黄素与β-amyloid蛋白结合的IC50,化合物4-4a和4-4b能否用于AD的诊断有待进一步的研究,其中包括实验动物的PET影像研究和代谢分布研究。对化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价,结果表明,与姜黄素相比化合物4-3b对Colon-26、MCF-7、BT474、SK-BR-3、MCF-10A、A549等癌细胞具有更好的抑制作用。其构效关系和抗肿瘤活性机理有待进一步研究。
关键词: AD诊断 ；PET示踪剂 ；γ-分泌酶调节剂 ；AMPARs正变构调节剂 ；姜黄素
摘要： 疲劳是一种亚健康状态,由体力消耗过度、睡眠缺少、脑力消耗过多、疾病等多种因素引起,表现为主观上乏力、注意力无法集中、思维迟钝,机体各项生理功能不能维持在正常状态的综合生理心理过程并导致工作学习效率的下降,严重影响人们的生活质量。疲劳存在于广大人群中并危害着人们的身心健康,因此研制能够有效缓解疲劳作用且不良反应小的药物具有重要理论意义与实用价值。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-Isoxaz-olepropionic acid,AMPA）受体是其中一种中枢兴奋性离子型谷氨酸受体,位于突触前和突触后的质膜上,介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递,而AMPA受体正向变构调节剂可稳定AMPA受体的活性构象并增强突触电流,从而促进突触传递,这是记忆形成的一种突触可塑性的重要形式。AMPA受体参与多种神经活动过程,目前是治疗神经和精神疾病的重要靶点。1-（1,3-苯并二噁英-5-基羰基）-哌啶（1-BCP）作为AMPA受体的正向变构调节剂,可以调节AMPA受体门控离子电流,与谷氨酸受体（Glu A1-Glu A4）亚单位变构结合并限制脱敏,具有缓解疲劳和改善认知的作用。本论文以AMPA受体为作用靶点,以1-BCP为先导化合物,利用生物电子等排原理设计了五种结构类型的化合物。将其结构与AMPA受体蛋白进行模拟对接,发现大部分化合物与AMPA受体蛋白的结合自由能低,结合力强,证实了结构设计的合理性。共合成了34个化合物,以1H NMR、13C NMR及HRMS进行了结构确证,其中19个化合物未见文献报道。对合成的化合物,通过小鼠戊巴比妥钠催眠实验初步评价其中枢兴奋性,小鼠负重游泳实验及小鼠游泳致疲劳生化指标测定评价其抗疲劳活性。实验结果综合分析表明:化合物F3、F5和F6有值得深入研究的前景,F5和F6可显著减少小鼠戊巴比妥钠诱导睡眠时间、延长小鼠负重游泳时间、抑制疲劳所致小鼠尿氮素、肌糖原和肝糖原的含量变化（P<0.05）;F3可显著延长小鼠负重游泳时间、降低疲劳所致小鼠尿素氮、乳酸含量（P<0.05）。初步构效关系分析表明,先导化合物中酰胺连接桥可能非活性必需基团,可替换为磺酰胺连接桥,有利于与氨基酸残基形成氢键,使配体深入受体空腔中,从而结合更紧密。同时发现Lys251氨基酸残基可作为关键位点来重点考察。2,4,5-三甲氧基苯甲酰胺类的抗疲劳作用突出,表明苯环上甲氧基数量越多,抗疲劳活性越强;其中含氮杂环中N,N-二乙基哌嗪-1-甲酰胺和（2-甲氧基苯基）(哌嗪-1-基)甲酮对抗疲劳活性贡献更大。本论文工作为深入开展新结构类型的抗疲劳分子设计合成进而发现安全高效的抗疲劳活性分子提供了重要参考。
关键词: AMPA受体 ；正向变构调节剂 ；负重游泳 ；抗疲劳 ；设计合成
摘要： G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCR）是人类最大的膜蛋白受体超家族,它可以响应多种信号分子并介导胞内众多生理进程。以GPCR为靶点的药物约占现有批准药物的三分之一,是目前研究最深入和最吸引人的药物靶点。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质,在大脑的神经信号传递中起着关键作用,影响着许多生理和精神心理过程。GABA信号紊乱将导致大脑皮层兴奋与抑制信号失衡,是精神分裂症发病机制的关键因素之一。GABA主要通过离子型GABAA/GABAC受体和代谢型GABAB受体发挥生理功能。越来越多的证据表明GABAB受体在精神分裂症中扮演着重要角色。针对GABAB受体已经开发了大量的拮抗剂、激动剂以及变构调节剂,但仅有两种激动剂被批准作为临床治疗药物:用于治疗肌肉痉挛和酒精成瘾的巴氯芬（Baclofen）和用于治疗嗜睡症的γ-羟基丁酸（γ-Hydroxybutyric acid,GHD）。“发现一种新药的最好方法是从一种旧药物开始。”新药研发是一个耗时且成本高昂的研发过程,与新药开发相比,药物重定位（也称为老药新用）具有很多优势。批准上市药物由于具有良好的生物活性、药代动力学特性和安全性,适宜旧药新用的研究,并且对药物机制作用的深入理解将为药物发现、临床试验和耐药性克服等提供信息。在本文中,我们选取多个临床抗精神分裂症药物代表作为筛选对象,探究它们与GABAB受体之间的作用关系。我们发现其中一种抗精神分裂症药物是靶向GABAB受体的一种新型负向变构调节剂,它可以作用于GABAB受体的异源二聚体界面,阻碍GABAB受体激活过程中的7次跨膜区二聚体界面的转换,进而阻碍GABAB受体下游信号通路。同时,我们发现它还可以抑制GABAB受体的Rett综合症相关突变体的组成型活性,暗示该药物可以作为Rett综合症的潜在治疗药物。该研究拓展了GABAB受体的临床用药,为老药新用提供了新的案例,促进了以GPCR为靶点的药物开发进展。
关键词: G蛋白偶联受体 ；GABAB受体 ；抗精神分裂症药物 ；老药新用 ；负向变构调节剂
摘要： GABAB受体是中枢神经系统主要抑制性神经递质GABA的代谢型受体,属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）超家族C家族,是由GABAB1亚基和GABAB2亚基组成的异源二聚体,其中GABAB1亚基负责正位配体结合,GABAB2亚基则负责偶联下游特异性G蛋白。GABAB受体在中枢神经系统中表达和分布十分广泛,其功能紊乱与许多神经和精神类疾病相关。目前,针对GABAB受体研发上市的唯一药物是其正位激动剂巴氯芬（Baclofen）,它在临床上对肌肉痉挛和酒精依赖等多种疾病表现出功效,但在生理使用过程出现镇静、肌肉松弛和体温降低等副作用。变构调节剂同GABAB受体相互作用位点在拓补结构上不同于正位位点,它们既可以协同改善正位配体引起的GABAB受体相关活性,又表现出更好的受体选择特异性,可以为药物开发和疾病治疗提供新可能。目前,针对GABAB受体特异性正向变构调节剂（Positive allosteric modulator,PAM）研究取得了较好进展,包括CGP7930、GS39783以及rac-BHFF在内的多种正向变构调节剂在体外细胞功能以及活体动物实验中都表现出很好的功能活性,某些正向变构调节剂还表现出内在激动剂效应,进一步为GABAB受体活性调控提供了新选择。但具有内在激动剂效应的变构激动剂如何单独激活GABAB受体等相关分子机制细节并不清楚。本课题以GABAB受体3种典型正向变构调节剂为基础工具,采用体外功能检测方法对这些正向变构调节剂活性特征进行了研究,进一步确认了它们同GABAB受体相互作用的部位,并采用多种功能检测方法确认了rac-BHFF的内在激动剂效应。通过三维同源建模,我们对参与影响rac-BHFF激动剂活性的潜在功能区域进行了预测,并采用定点突变功能筛选等方法对相关功能区域进行了确认。我们在GABAB2亚基的七次跨膜结构域中发现一个全新的功能区域,该功能区域可以显著影响rac-BHFF的激动剂效应,并参与了GABAB受体组成性活性的调控过程。此外我们还发现,GABAB1亚基七次跨膜结构域可以对rac-BHFF的激动剂效应产生直接影响。正向变构调节剂激动剂效应研究可以为GABAB受体激活机制及新型变构调节剂的开发等研究提供帮助。
关键词: G蛋白偶联受体 ；GABAB受体 ；正向变构调节剂 ；变构激动剂 ；同源模型 ；定点突变 ；组成性活性
摘要： 研究目的 在全球范围内,抑郁症负担不断加剧,而目前临床上靶向单胺能系统的抗抑郁药物通常需要2-4周才能起效,而且对30%的患者无效,亟需研发新型快速抗抑郁药物。最新研究表明,靶向谷氨酸能系统的抗抑郁药物相对于传统的单胺能系统药物可以发挥更快速的抗抑郁效果,并且离子型谷氨酸受体α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid,AMPA）受体的激活可快速介导脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的表达释放及其下游磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide 3-Kinase,PI3K）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,m TOR）等信号通路的激活,增加突触相关蛋白的转录及翻译,在数小时内产生快速抗抑郁效果。本研究在计算机辅助设计基础上构建了靶向AMPA受体的小分子化合物库,初步筛选发现化合物7k显示出较高的正向调节活性和成药性。进而就其对AMPA受体的结合位点、调节活性、选择性、安全性及体内抗抑郁样作用进行研究,为后续临床转化奠定了基础。 研究方法 本研究设计了一系列以3,4-二氢苯并[e][1,2,3]噁噻嗪2,2-二氧化物为母核的化合物,通过原代海马神经元的细胞钙内流活性和体内的药代动力学筛选得到目标化合物7k,继而通过膜片钳技术、激酶谱筛选、动物行为学、组织病理学、免疫印迹、以及结构生物学等手段对7k的AMPA受体调节活性、抗抑郁样活性、安全性以及结合模式进行研究,综合评价新型AMPA受体正向变构调节剂7k在抑郁治疗中的临床转化价值。 研究结果 首先,我们以3,4-二氢苯并[e][1,2,3]噁噻嗪2,2-二氧化物为母核,在其8、7、6或5号碳原子位置引入4-苯氧基苯基为侧链设计了化合物5aa-5ad,分子对接结果显示侧链位于母核8号碳原子位置化合物5aa和位于5号碳原子位置的5ad在AMPA受体的配体结合结构域（Ligand-binding domain,LBD）内部具有更好的结合构象,以及更低的结合自由能,其结合自由能分别为-10.0kcal/mol和-9.6 kcal/mol。随后合成化合物5aa-5ad,通过原代海马神经元的细胞钙内流对其活性进行了评价,结果显示化合物5aa配体依赖的激活细胞的钙内流,在1μM（S）-AMPA配体存在下调节活性相对于阳性化合物（10μM的TAK-137）为77.3%,且几乎无激动活性（4.1%）。其他三个化合物则既无调节活性也无激动活性。 随后将化合物5aa的侧链基团4-苯氧基苯基替换为具有不同官能团的苯基和联苯基,设计合成了一系列的化合物,通过钙内流的筛选方法,得到了调节活性高于5aa且激动活性比其低的化合物共四个,分别为5d、7e、7k和7n,对其进行分子对接,它们都与5aa具有非常相似的结合构象,且都和LBD内部的氨基酸残基GLY752形成氢键作用。对筛选到的四个化合物和5aa分别进行了剂量效应研究,化合物5aa具有最大的效应峰值(Emax),而7k具有最低的半数激活浓度(EC50)。 大鼠体内药代动力学显示,化合物5aa和7k具有相似的吸收和代谢模式,但是7k的半衰期和生物利用度表现更好。随后对7k在大鼠体内血脑屏障透过性研究表明化合物口服给药后脑组织和血浆中药物浓度比值在2 h达到峰值2.15,直到24 h仍维持1.5左右的水平。 随后选择化合物7k,进一步评价了其对AMPA受体的调节活性。在原代海马神经元中,其可以配体依赖地激活细胞钙内流和AMPA受体介导的兴奋性突触后电流（EPSC）,且这些作用均可被AMPA受体拮抗剂NBQX所阻断。在小鼠海马急性切片中,7k显著显著增强CA3-CA1区的长时程增强（LTP）,在不影响振幅的情况下显著增加微小兴奋性突触后电流（m EPSC）的频率,显著增加AMPA受体介导的诱发兴奋性突触后电流（e EPSC）以及显著降低双脉冲易化（PPF）的脉冲比。表明7k可能通过AMPA受体介导的突触前谷氨酸递质的释放增强了突触功能,导致突触可塑性的提升。 免疫印迹实验中,10 n M和30 n M的7k配体依赖的激活BDNF的表达,AMPA受体Glu A1亚基Ser831位点以及核糖体蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase,p70S6K）Thr389位点的磷酸化水平,且这些激活作用被NBQX阻断。 晶体学研究在1.7?的分辨率下解析了7k与人源AMPA受体Glu A2亚基的共晶结构,正如分子对接预测的结果,7k和Glu A2亚基LBD两处氨基酸残基形成氢键相互作用,以较稳定的构想结合物LBD内部。为3,4-二氢苯并[e][1,2,3]噁噻嗪2,2-二氧化物为母核的AMPA受体变构调节剂的后续研发奠定了结构基础。 在安全性评价中,高剂量的化合物7k对人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,SD大鼠原代海马神经元和小鼠小胶质细胞（BV2）三种细胞的抑制率均在20%以下。对人类心室肌特异性钾离子通道基因（Human Ether-à-go-go-Related Gene potassium channel,h ERG）编码的钾通道以及7大类310多种人类激酶均无显著抑制作用。连续两周高剂量给药（0.2 mg/kg和0.4 mg/kg）未引起小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏的病理性变化。 在小鼠抑郁样模型中,0.05 mg/kg的化合物7k在强迫游泳测试（Forced swimming test,FST）、悬尾测试（Tail suspension test,TST）以及蔗糖偏好测试（Sucrose preference test,SPT）中表现出显著的抗抑郁样作用,且旷场测试（Open field test,OFT）未检测到其对小鼠的自主活动（Locomotion activity,LMA）有显著的影响。提前半小时腹腔给予10 mg/kg的NBQX可以阻断7k的抗抑郁样作用,表明AMPA受体介导了7k在小鼠模型中的快速抗抑郁样作用。 结论 综上所述,我们设计合成了一系列3,4-二氢苯并[e][1,2,3]噁噻嗪2,2-二氧化物类似物,并对通过体外活性评价以及构效关系研究筛选得到了化合物7k。随后对化合物7k的AMPA受体调节活性、作用机制、体内抗抑郁作用、体内外安全性以及共晶结构进行研究和评价,结果表明化合物7k作为抗抑郁候选化合物具有继续开发的临床价值。
关键词: AMPA受体 ；正向变构调节剂 ；抗抑郁 ；脑源性神经营养因子
摘要： 第一章二型谷氨酸受体PET探针的开发 谷氨酸(glutamate)是人体内重要的神经递质，通过与突触前的谷氨酸受体(GluR)结合，激活下游信号通路，负反馈调节谷氨酸的释放。谷氨酸受体分为离子型谷氨酸受体(iGluR)和代谢型谷氨酸受体(mGluR)，每类受体均分多个亚型。研究表明，高选择性作用于代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)可实现抗精神失常、抗焦虑、抗抑郁、治疗强迫症、提高认知能力等作用，因此mGluR2作为一种潜在的药物靶点引起了企业界与学术界的广泛关注。开发靶向mGluR2的PET探针，对评估体内mGluR2分布、活性，测定新药靶点占有率，推进药物研发，以及神经系统疾病诊断治疗等方面具有重要价值。 基于药理学和信号传导机制不同，mGluR可分为三组，其中mGluR2和mGlu3共属于同一组。传统的正性结合(orthostericbinding)基于靶向mGluR2和mGlu3高度保守的谷氨酸结合位点，难以实现亚型间的高选择性。因此变构调节(allostericmodulation)是一种非常有潜力的策略，用以筛选出针对亚型的高选择性结合配体。 在此项研究中，研究人员基于四氢萘啶杂环结构进行构效关系研究，通过对合成的新型mGluR2别构抑制剂进行活性筛选，得到了其中亲和力最高的两个变构调节剂MG1-1904和MG2-1904结构，并对其进行碳-11放射化学标记从而得到mGluR2靶向型PET探针。体外放射自显影实验显示，[11C]MG2-1904在大鼠脑切片中呈差异性分布，在纹状体、大脑皮层、海马和小脑有高的放射性结合信号，阻断后各脑区信号下降45％-69％，具有良好的体外特异性。大鼠脑PET影像结果显示，该探针可迅速通过血脑屏障，最高摄取量高达2.0SUV，脑区摄取量由高到低依次为纹状体～扣带回＞大脑皮层＞小脑＞脑桥，洗脱速率快。阻断后各脑区差异性分布消失，摄取信号明显降低，表明该探针具有良好的体内特异性，与体外放射自显影实验结果相符。 第二章基于SNAP报告基因的细胞示踪技术的开发 嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T疗法）通过基因改造T细胞对肿瘤进行治疗，对血液肿瘤具有良好疗效。然而CAR-T治疗存在的严重并发症，特别是细胞因子释放综合征、神经毒性和脱靶效应发展迅速且难以预测，危及患者生命。如何检测和调控CAR-T治疗引发的并发症是临床亟待解决的难题。 本工作基于DNA烷基转移酶标签(SNAP)与苄基鸟嘌呤底物(BG)共价键结合的原理，设计了一种适用于SNAP标签的PET探针18F-Al-NOTA-BG。18F-Al-NOTA-BG通过PEG链接子将靶向SNAP结构的BG与可放射性标记的配体链接，通过Al-F标记获得，放射化学合成产率可以达到32±7％。在小鼠血清中的体外稳定性实验表明18F-BG-surface有较好的体外稳定性。通过构建表达SNAP-GPI标签的人肝癌细胞HCCLM3-SNAP，进行体外细胞摄取实验，发现18F-BG-surface可以高选择性地靶向表达SNAP标签细胞(4.81±0.08％AD/106cellvs.2.26±0.10％AD/106cell)。在进一步的小鼠PET显像实验中，通过皮下注射HCCLM3-SNAP和HCCLM3-Vector细胞利用18F-BG-surface进行体内细胞示踪发现，18F-BG-surface在小鼠体内仍然具有对SNAP标签的高靶向性(1.90±0.05vs.0.55±0.02％ID/g,p＜0.01)。
关键词: 二型代谢型谷氨酸神经受体 ；PET探针 ；SNAP报告基因 ；细胞示踪技术
摘要： γ-氨基丁酸（γ-gammaaminobutyricacid，GABA）是最为重要的神经递质，主要在脊椎动物中枢神经系统中发挥抑制性作用，调节许多重要的生理进程。代谢型γ-氨基丁酸受体GABAB受体与代谢型谷氨酸受体、钙敏感受体、信息素受体和味觉受体等同属于G蛋白偶联受体家族C，介导缓慢的、长时间的突触抑制效应。GABAB受体是最具有药理学意义的药物靶点之一，具有精细和复杂的调控机制，过度抑制和激活都会导致各种疾病的发生。GABAB受体传统的靶点药物开发集中于激动剂和拮抗剂，然而这类药物在临床应用上受到许多的限制，如机体药物代谢困难、较强的副作用、耐药性差等等。变构调节剂结合于天然配体结合位点之外，能够调节异源二聚体亚基或结构域间的相互作用，并具有较高的特异性和药物安全性，同时还能够保持GABAB受体信号在时间和空间上的可控性。因此变构调节剂为GABAB受体靶点药物开发提供了新思路。
本文主要针对GABAB受体变构调节剂小分子化合物的高通量筛选和作用分子机制的研究。目前针对GABAB受体的变构调节剂的研究尚仅仅集中于CGP7930（2001）、GS39783（2003）、BHF177（2008）、CMPPE（2011）四种正向变构调节剂，而且负向变构调节剂还未见报道。通过与上海国家新药筛选中心（NCDS）的合作，由新药筛选中心运用组合化学的方法以CGP7930为母核改造并合成了多种小分子化合物。我们通过放射性IP3功能检测技术对小分子化合物进行药物筛选，并构建CGP7930构效关系图谱。
我们使用工具细胞人胚肾细胞HEK293，进行电穿孔转染GB1、GB2及Gqi9质粒，孵育[3H]myo-inositol后，50μM药物与不同浓度GABA同时刺激细胞，用50μMCGP7930与不同浓度GABA同时刺激细胞作为正对照，不同浓度的GABA单独刺激作为负对照，然后进行放射性IP3功能检测。从合成的小分子化合物库中挑选15种在结构上具有代表性和规律性的小分子化合物，15种小分子化合物分别在R1、R2、R3、R4、R5共5个基团位置进行改造。根据改造后的小分子化合物放射性IP3功能检测的结果，分别总结出了R1-R5不同基团位置的作用，并成功构建出了CGP7930构效关系图谱。并推测R1基团位置的羟基和R2基团位置的两个叔丁基支链是CGP7930识别GB2亚基位点所必需的；在CGP7930三维结构中，R5基团位置碳原子所连接的基团对CGP7930的变构调节活性有关键的影响，改变该位置结构可能会使CGP7930的特性发生改变，从而筛选获得更加高效和不同特性的药物。
总之，我们对GABAB受体变构调节剂CGP7930构效关系图谱的建立，对我们下一步的改造优化提供了依据，同时对GABAB受体新药研发奠定了基础。
关键词: GABAB受体 ；CGP7930 ；构效关系 ；药物筛选 ；变构调节剂
摘要： 药物的代谢产物分析是生命科学以及医学领域的热点研究内容之一，研究药物的代谢产物有助于候选药物的筛选，为新药开发提供思路，提高用药安全性，降低候选药物的淘汰率。近年来，四极杆串联飞行时间质谱（Q-TOF-MS）以其高分辨率和强大的定性分析能力等优势逐渐成为研究药物代谢产物及代谢转化途径的强有力工具。
该课题首先以睾酮和咪达唑仑为探针底物，建立肝微粒体体外代谢模型，采用高效液相色谱串联质谱法对睾酮和咪达唑仑及其代谢产物进行检测分析，并对色谱及质谱条件进行优化使探针底物及其代谢产物得到很好的分离，及获得药物及其主要代谢产物的质谱图，为初步鉴定代谢产物提供理论依据。依据色谱峰积分面积比可以计算药物的代谢率，从而对CYP450同工酶活性做出评价。合理的利用特异性探针药物测定CYP450同工酶的活性，不仅有助于确定药物的代谢特征，而且对新药的临床应用开发也有重大意义。
GABAB受体与很多神经系统疾病有关，如抑郁、焦虑、药物成瘾等，因此GABAB受体被认为是一种最优秀、最有潜力的药物靶点。CGP7930为GABAB受体的正向变构调节剂，研究CGP7930及其代谢产物有助于新药的开发及临床应用。课题在CYP3A4探针药物的代谢模型实验基础上对梯度洗脱程序加以优化并应用于CGP7930的代谢产物分析中，实验结果表明优化后的梯度洗脱程序对CGP7930及其代谢产物分离效果明显，且分离分析时间较短。根据CGP7930代谢产物的一级质谱图我们可以得到代谢物的分子量，依据CYP450酶系的常规氧化反应结合CGP7930结构分析，我们推断CGP7930经肝微粒体CYP450酶系发生了单羟基化的氧化反应，再通过代谢物的二级质谱图解析，我们推断发生羟基化的位点，从而确认CGP7930代谢产物的结构及其经过碰撞诱导裂解产生离子碎片的裂解途径。
课题最后以HSA标准蛋白为模型对凝胶渗透色谱(GPC)分离纯化蛋白的方法进行了探索。蛋白质经过凝胶渗透色谱(GPC)柱时，由于每种蛋白之间分子量的差异，导致其保留时间不同，通过流速及管路长度可以精确计算出目标蛋白经检测器流出的时间，从而将纯品目标蛋白从其他杂蛋白中分离出来，以达到质谱进样要求。通过HSA经ESI-MS检测的检测结果可以看出HSA已经同其他杂蛋白分离开来，说明此纯化方法的可行性。我们采用上述凝胶渗透色谱模型对FAK蛋白进行纯化，由于FAK蛋白浓度较低，质谱的条件相对苛刻等原因，通过ESI-MS检测尚未发现完整的FAK片段。虽然没有确定检测到完整的FAK片段，但是也为蛋白纯化提供了理论及实验依据，为后续FAK蛋白纯化及研究其与小分子抑制剂相互作用奠定基础。
关键词: 药物 ；代谢产物 ；串联质谱 ；蛋白纯化
被引量
5
摘要： 本论文包括三部分工作：第一部分围绕G蛋白偶联受体119(Gprotein-coupledreceptor119，GPR119)建立细胞水平的激动剂及正向变构调节剂高通量筛选模型，通过大规模筛选发现一个小分子激动剂，并进行了细胞水平的功能验证，最后应用糖尿病db/db小鼠初步研究了体内药效。第二部分涉及一个糖皮质激素受体(Glucocorticoidreceptor，GR)拮抗剂的分子与细胞药理学研究，以及通过构效关系分析和结构优化改造发现的一个活性更好的衍生物。第三部分介绍了应用结核杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)的分子水平筛选模型和高通量筛选发现的DHFR特异性小分子抑制剂。 糖尿病是一组由遗传和环境因素共同作用引起的临床综合征，主要包括1型(Type1diabetesmellitus，T1DM)和2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)这两种类型，其中以T2DM最为普遍，症状主要表现为胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能障碍。GPR119是一个通过基因组测序、序列比对分析发现的一个孤儿受体。该受体被激活后，可以发挥治疗糖尿病的作用。由于GPR119主要与Gs蛋白发生偶联，我们建立了基于萤光素酶报告基因的细胞水平筛选系统，旨在寻找GPR119的小分子激动剂或正向变构调节剂。通过对320000个化合物的筛选，找到了一个结构新颖的小分子激动剂MW1219。MW1219可以剂量依赖性的刺激cAMP产生以及下游萤光素酶的表达。在功能细胞株Min6和GluTag上，MW1219可以特异性地通过GPR119途径刺激胰岛素和胰高血糖素样肽-1的分泌。当GPR119的表达水平被siRNA下调后，MW1219的促分泌功能也相应减弱。给予雄性db/db小鼠MW1219(100mg/kg、每日一次灌胃给药)连续6周治疗后，其空腹血糖和糖化血红蛋白水平较之未治疗组明显降低，外周血胰岛素含量显著升高，糖耐量也有所改善。糖皮质激素受体是核受体超家族的成员之一，为配体激活的转录因子。糖皮质激素主要通过与受体结合发挥代谢调节作用。库欣氏综合症和一些长期接受糖皮质激素治疗的患者体内糖皮质激素的水平异常升高，严重时则出现糖尿病、血脂异常和肥胖等代谢紊乱症状。NC3327是前期经过高通量筛选获得的一个糖皮质激素受体小分子抑制剂。研究表明，NC3327可以与地塞米松竞争性结合糖皮质激素受体，抑制前者诱导的基因表达，但对糖皮质激素受体本身没有激动活性。NC3327也不能诱导糖皮质激素受体从细胞质向细胞核的转移。然而，NC3327可以下调肝细胞HepG2内糖异生的关键性限速酶PEPCK和G6pase的表达，降低TAT酶的活性，而对NFκβ无抑制活性。对NC3327开展的一系列结构优化改造产生出一个活性明显改善的衍生物YZ105。该化合物不仅可以阻断肝糖异生，而且能够拮抗地塞米松诱导的3T3-L1前脂肪细胞分化作用。综上所述，NC3327和YZ105都是糖皮质激素受体的“竞争性”拮抗剂，对于库欣氏综合症引发的代谢紊乱也许具有潜在的治疗效果。二氢叶酸还原酶是结核分枝杆菌生命活动中不可或缺的蛋白酶，主要参与核苷酸和蛋白质生物合成等重要的生命活动。因此，针对此酶开发抑制剂有望找到治疗结核病的新药。通过将二氢叶酸还原酶反应与一个产生荧光产物的反应相偶联，建立了高效稳定的筛选模型。经过大规模筛选，发现了三个可抑制二氢叶酸还原酶活性的小分子化合物，其中一个化合物的抑制活性对二氢叶酸还原酶呈现高特异性。
关键词: 2型糖尿病 ；G蛋白偶联受体 ；正向变构调节剂 ；糖皮质激素受体 ；结核分枝杆菌
摘要： γ-氨基丁酸B型受体(GABABR)是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制型神经递质受体，它参与了许多重要的生理活动和病理变化。它结构的复杂性使得对其结构和机理的研究存在着诸多困难。活性导向的蛋白谱技术（activity-based protein profiling，ABPP）是一种研究功能蛋白质组学的策略，它利用活性导向的探针分子(activity-based probes，ABPs)特异性标记处于功能状态下的蛋白质，从而实现靶标蛋白的示踪、纯化以及蛋白-蛋白相互作用的研究。 本论文第一部分是ABPP技术在GABABR研究上的应用。基于GABABR高活性抑制剂CGP64213，分析其构效关系，我们设计并合成了一系列含有多样化标签的探针分子，它们具有GABABR强亲和力、高选择性的结合能力，成功地用于在活细胞水平对膜上GABABR的标记、示踪、纯化以及分析因激活或拮抗引起的胞内相关信号蛋白的动态变化过程。基于GABABR的正向变构调节剂CGP7930，我们进行了构效关系研究，合成了一系列结构类似物，不仅找到一批活性较好的正向变构调节剂，还首次发现了GABABR的负向变构调节剂，通过进一步的结构修饰，我们总结了负向变构调节剂的构效关系，并合成了探针分子，以期实现对受体变构位点的标记。这些具有不同变构调节活性的化合物，既可进行下一步的药物开发，也可作为工具用于GABABR变构机理研究。 四氢异喹啉类生物碱是含有多手性中心的复杂结构，具有显著的抗肿瘤和抗菌活性。因此发展便捷的合成路线来构建其核心骨架，有利于该类结构化学空间的拓展。 本论文第二部分是以α-氨基丙烯酰胺的RCM反应以及分子内的N(o)的SN2取代反应作为关键步骤，成功地发展了一条立体选择性合成三类四氢异喹啉四环核心骨架的方法，为下一步的结构改造提供了便利。
关键词: γ-氨基丁酸B型受体 ；小分子探针 ；四氢异喹啉 ；四环核心骨架 ；药物合成
摘要： GABAB受体属于G蛋白偶联受体家族C,在大部分神经元中都有表达。它被神经系统中主要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸激活,介导持久和缓慢的突触传递效应,进而影响神经细胞的兴奋性以及突触的可塑性。最近有研究表明GABAB受体可能促进神经存活,但是这种神经保护作用的具体机制并不清楚。
在本实验室已经发表的文章中确认了GABAB受体的激活可以通过PI3K引起ERK1/2活性的增加。而GABAB受体的激活对Akt活性的影响以及分子机制目前还并不清楚。
我们以小鼠小脑颗粒神经元在低钾培养条件下诱导凋亡为模型,通过TUNEL和Hoechst33258染色以及caspase-3活性检测等研究方法与技术,对GABABR的神经保护功能进行了深入研究。研究发现GABAB受体的特异性激动剂baclofen和变构调节剂CGP7930均对低钾诱导的小脑颗粒神经元的凋亡具有明显的抑制作用,而且这种效应与GABAA受体以及GABAC受体无关。
接着我们还研究并初步阐明了GABAB受体激活后抗凋亡的分子机制。研究发现Gi/o蛋白抑制剂PTX和PI3K抑制剂LY294002不仅能阻断GABAB受体激活而产生的对低钾环境中小脑颗粒神经元的保护作用,而且能明显阻断GABAB受体的激活对caspase-3活性的抑制。这表明Gi/o蛋白和PI3K均参与了GABAB受体介导的神经保护作用。另外,我们研究发现GABA,baclofen和CGP7930都可以瞬时地增强Akt的磷酸化,而且GABAB受体介导的Akt激活可被PTX、LY294002的抑制剂所阻断,Gi/o蛋白和PI3K等参与了GABAB受体介导的Akt信号通路。综上所述,在小脑颗粒神经元中,GABAB受体的激活信号通过Gi/o蛋白、PI3K诱导Akt信号通路的激活,从而通过下游的相关信号途径抑制caspase-3的活性,最终对神经元具有一定的保护作用。本研究不仅进一步揭示和丰富了GABAB受体在神经元中的新功能,而且为以GABAB受体及其下游相关蛋白为靶点的药物筛选与研发奠定了一定的理论基础。
关键词: GABAB受体 ；小脑颗粒细胞 ；凋亡 ；PI3K/Akt通路
被引量
1