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摘要： 目的研究兔前交叉韧带横断术（ACLT）创伤性骨关节炎（OA）动态模型软骨中MMP-1、MMP-9mRNA的表达，探讨MMP01、MMP-9在OA软骨退变中的作用。方法30只新西兰兔随机分为对照组（10只）、ACLT组（20只），ACLT组行右膝ACLT，对照组行关节囊切开缝合术，ACLT组于术后4、8w各处死10只，对照组术后4w处死。解剖显微镜观察股骨内髁软骨形态学变化，逆转录聚合酶链反应（RT-PcR）检测股骨内髁软骨MMP．1、MMP-9mRNA的表达。结果形态学示ACLT组软骨退变重于对照组（P〈0．05），且ACLT8W组重于4W组（P〈0．05）；RT-PCR示ACLT组MMP．1、MMP．9mRNA表达量均高于对照组（P〈0．01），且ACLT8W组均高于4W组（P〈0．01）。结论创伤性OA软骨退变过程中伴随着MMP-1、MMP．9mRNA表达的上调，软骨中MMP-1、MMP．9mRNA的表达一定程度上反映了OA软骨的退变程度。
关键词: 骨关节炎 ；软骨 ；金属蛋白酶-1 ；金属蛋白酶.9
被引量
4
会议时间： 2011-11-18
摘要： 目的:研究兔前交叉韧带横断术(ACLT)创伤性骨关节炎(OA)动态模型软骨中MMP-1、MMP-9 mRNA的表达,探讨MMP-1、MMP-9在OA软骨退变中的作用。方法:30只新西兰兔随机分为对照组(10只)、ACLT组(20只),ACLT组行右膝ACLT,对照组行关节囊切开缝合术,ACLT组于术后4、8周各处死10只,对照组术后4周处死。解剖显微镜观察股骨内髁软骨形态学变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测股骨内髁软骨MMP-1、MMP-9 mRNA的表达。结果:形态学示ACLT组软骨退变重于对照组(P<0.05),且ACLT8周组重于4周组(P<0.05);RT-PCR示ACLT组MMP-1、MMP-9 mRNA表达量均高于对照组(P<0.01),且ACLT8周组均高于4周组(P<0.01)。结论:创伤性OA软骨退变过程中伴随着MMP-1、MMP-9 mRNA表达的上调,软骨中MMP-1、MMP-9 mRNA的表达一定程度上反应了OA软骨的退变程度
关键词: 创伤性骨关节炎 ；MMP-9 mRNA
摘要： 目的:探讨脐带间充质干细胞来源的外泌体对骨关节炎软骨细胞的免疫调节作用。方法:提取并鉴定脐带间充质干细胞与外泌体;脂多糖(LPS)构建骨关节炎细胞模型;实验分为软骨细胞组(Control组)、软骨细胞+40 ng/ml LPS组(LPS组)、软骨细胞+40 ng/ml LPS+10μg/ml外泌体组(LPS+Exo组),流式细胞术、ELISA分别检测三组细胞凋亡、炎症因子表达;qRT-PCR、Western blot检测三组软骨生成相关基因和蛋白表达;细胞免疫荧光检测NF-κB信号通路的激活,Western blot检测相关蛋白表达。结果:成功提取并鉴定脐带间充质干细胞及其分泌的外泌体;与LPS组相比,LPS+Exo组软骨细胞凋亡率降低,IL-6、TNF-α、NO表达量明显减少(P<0.05),软骨细胞CoL2A mRNA表达水平显著升高(P<0.05),CoL2A、AGC-1蛋白表达水平显著提高(P<0.05),MMP-13蛋白表达水平显著降低(P<0.05);细胞核中p65蛋白明显增多,p-p65与p65蛋白比值降低。结论:脐带间充质干细胞的外泌体对骨关节炎软骨细胞具有免疫调节作用,并可抑制NF-κB信号通路激活。
关键词: 外泌体 ；软骨细胞 ；骨关节炎 ；NF-κB通路
被引量
10
摘要： 目的观察消肿止痛合剂对大鼠膝骨性关节炎软骨中LC3、Beclin1、caspase-9、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(p-AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达的影响,探讨消肿止痛合剂干预膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)形成的作用机制。方法将80只Wistar大鼠随机分为4组:观察组(消肿止痛合剂组)、对照组(硫酸氨基葡萄糖片组)、模型组、假手术组,每组20只,除假手术外,其余3组通过改良Hulth法行膝骨关节炎造模。药物连续干预8周后,取各组大鼠膝关节软骨,采用ELISA方法检测血清中白细胞介素-6 (IL-6)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、环氧化酶-2(COX-2)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组软骨中LC3、Beclin1、caspase-9 mRNA的表达情况,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组软骨细胞中pAMPK、mTOR蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型组IL-6、MMP-3、COX-2水平明显升高,下调LC3、Beclin1、p-AMPK的表达量,上调caspase-9、mTOR的表达量,差异有统计学意义(P<0. 05);与模型组比较,观察组、对照组降低IL-6、MMP-3、COX-2水平,显著上调LC3、Beclin1、p-AMPK的表达量,下调caspase-9、mTOR的表达量,差异有统计学意义(P<0. 05);其中观察组优于对照组,差异有统计学意义(P<0. 05)。结论消肿止痛合剂对KOA关节软骨损伤的保护可能与AMPK/mTOR信号通路相关。
关键词: 消肿止痛合剂 ；膝骨性关节炎 ；信号通路 ；自噬 ；大鼠 ；动物实验
被引量
26
摘要： 目的 探讨藤黄健骨胶囊对膝骨关节炎大鼠基质代谢的影响及分子机制。方法 60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组(硫酸氨基葡萄糖胶囊0.17g·kg^(-1))及藤黄健骨胶囊高、中、低剂量治疗组(藤黄健骨胶囊0.36、0.18、0.09 g·kg^(-1)),每组10只。除假手术组外,其他各组采用改良Hulth法制备膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)大鼠模型,建模6周后分别灌胃给予硫酸氨基葡萄糖及相应剂量的藤黄健骨胶囊,假手术组和模型组灌胃给予0.9%生理盐水。上述药物连续灌胃2个月后采用Lequesne膝关节级别评分法评估大鼠右膝对疼痛的刺激反应步态改变、关节活动度和关节的肿胀程度,番红固绿O染色法观察关节软骨病理形态并进行OARSI评分;ELISA法检测血清中核心结合因子β亚基(corebinding factor subunit beta,Cbf-β)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、组织金属蛋白酶抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2,TIMP-2)、Ⅱ型胶原羧基末端肽(type II collagen carboxy terminal peptide,CTX-Ⅱ)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 4,ADAMTS-4)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS-5)浓度;RT-PCR法和Western blotting观察关节软骨组织中单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、过氧化物酶增殖激活受体γ共激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)、MMP-13 mRNA表达和蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组Lequesne MG评分呈现增加,血清Cbf-β、MMP-13、CTX-Ⅱ、ADAMTS-4、ADAMTS-5浓度明显上升,MMP-13 mRNA表达和蛋白表达则明显上升,模型组和藤黄健骨低剂量组大鼠OARSI评分也明显上升,而血清TIMP2浓度明显下降,右膝关节软骨组织PGC-1α、AMPK mRNA表达也明显下降(P<0.01)。与模型组比较,藤黄健骨胶囊高剂量组大鼠血清ADAMTS-5浓度明显下降、TIMP-2浓度明显上升(P<0.01),藤黄健骨胶囊中、高剂量组Lequesne MG评分、OARSI评分、血清Cbf-β、CTX-Ⅱ和ADAMTS-4含量均明显下降,右膝关节软骨组织PGC-1α蛋白表达及蛋白表达灰度值明显增强(P<0.05或P<0.01),藤黄健骨胶囊低、中、高剂量组大鼠血清MMP-13含量、MMP-13 mRNA表达、蛋白表达及蛋白表达灰度值明显下降,右膝关节软骨组织AMPK、PGC-1α mRNA表达明显上升,AMPK蛋白表达及蛋白表达灰度值也明显增强(P<0.01)。结论藤黄健骨胶囊延缓KOA模型大鼠的关节软骨退变可能与维持其关节软骨组织基质代谢稳态和逆转线粒体生物发生损伤有关,其中AMPK/PGC-1α信号通路激活可能发挥着关键调控作用。
关键词: 骨藤黄健骨胶囊 ；膝骨关节炎 ；AMPK/PGC-1α信号通路 ；基质代谢 ；线粒体生物发生
摘要： 目的研究独活寄生汤通过调节免疫功能缓解膝骨关节炎(KOA)小鼠软骨损伤的作用机制。方法小鼠分为正常组、模型组和独活寄生汤低、高剂量组(2、4 g/kg),除正常组外,其余各组小鼠右关节腔每周注射1次4%木瓜蛋白酶,连续3周,建立KOA模型,随后给予相应药物干预4周。给药结束后测量足趾厚度以评价小鼠关节肿胀度,ELISA法检测血清IL-1β水平,HE染色评估膝关节软骨及脾脏病理组织学改变,免疫组化染色检测软骨MMP-2、caspase3、NLRP3及脾脏CD3、F4/80表达,蛋白印迹法检测软骨NLRP3、ASC蛋白表达,RT-qPCR法检测软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、IL-10、IL-1Ra mRNA表达。结果与正常组比较,模型组小鼠右侧爪中心点厚度,血清IL-1β水平,膝关节软骨组织MMP-2、caspase3、NLRP3和ASC蛋白表达,膝关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表达,脾脏CD3、F4/80蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),软骨出现病理性损伤,病理评分升高(P<0.01),脾脏组织无明显病理损伤;与模型组比较,独活寄生汤各剂量组上述指标均有改善(P<0.05,P<0.01)。结论独活寄生汤可减轻木瓜蛋白酶诱导的KOA小鼠软骨损伤,该作用与其调节脾脏免疫功能,减少膝关节软骨NLRP3的过度激活相关。
关键词: 独活寄生汤 ；膝骨关节炎 ；木瓜蛋白酶 ；脾脏 ；免疫功能 ；炎症 ；凋亡
被引量
26
摘要： 目的:探讨大黄素在改善骨关节炎软骨降解中的作用及机制。方法:大黄素(20µmol/L)预处理SD大鼠软骨细胞2 h,IL-1β(10 ng/ml)孵育24 h。MTT检测不同处理组细胞活力,RT-PCR和Western blot分析aggrecan、collagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-4、NF-κB p65、IKK-β、IκB-α表达。结果:与IL-1β组相比,IL-1β+大黄素组大鼠软骨细胞aggrecan和COL2A1 mRNA水平显著升高(P<0.05),MMP-13、ADAMTS-4、NF-κB p65和IKK-βmRNA水平显著降低(P<0.05),而IκB-αmRNA水平显著升高(P<0.05)。结论:大黄素通过抑制NF-κB途径抑制MMP和ADAMTS表达,从而发挥软骨保护作用。
关键词: 大黄素 ；骨关节炎 ；软骨降解 ；NF-κB信号通路 ；MMP ；ADAMTS
被引量
19
摘要： 目的探讨姜黄素对关节软骨中转化生长因子-β1/信号转导蛋白Smad(TGF-β1/Smad2)通路的调节作用,及对软骨细胞增殖、凋亡、细胞外基质(ECM)合成和降解的影响。方法将细胞分成对照组,模型组,姜黄素组,TGF-β抑制剂组和姜黄素+抑制剂组,共5组。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活性,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用Western Blot检测细胞中B细胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、TGF-β1、Smad2、磷酸化Smad2(p-Smad2)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、Ⅱ型胶原蛋白(COL2α1)的蛋白表达,qRT-PCR检测MMP-13、COL2α1 mRNA表达。结果姜黄素对白介素1β(IL-1β)诱导构建的骨关节炎(OA)细胞模型的最佳干预量为10μmol/L。与对照组比较,模型组细胞增殖能力下降(P<0.05),凋亡率上升(P<0.05),Bcl-2、TGF-β1、p-Smad2蛋白表达均下调(P<0.05),COL2α1 mRNA和蛋白表达均下调(P<0.05),Bax蛋白、MMP-13 mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)。与模型组比较,姜黄素组细胞增殖能力上升(P<0.05),凋亡率下降(P<0.05),Bcl-2、TGF-β1、Smad2蛋白表达均上调(P<0.05),COL2α1 mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05),Bax蛋白、MMP-13 mRNA和蛋白表达均下调(P<0.05),TGF-β抑制剂处理加重了模型组细胞的损伤。与TGF-β抑制剂组比较,姜黄素+抑制剂组数据变化呈相反结果(P<0.05)。结论姜黄素能改善IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤,减轻细胞凋亡,进而抑制ECM降解,其机制可能与激活TGF-β1/Smad2通路有关。
关键词: 骨关节炎 ；姜黄素 ；转化生长因子-β1/信号转导蛋白Smad通路 ；细胞凋亡 ；细胞外基质降解
被引量
3
摘要： 目的研究西红花酸对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的人膝关节原代软骨细胞分解代谢及炎症应答的影响。方法西红花酸0.5,1,5,10和20μmol·L^-1处理人膝关节原代软骨细胞12 h,MTT检测细胞存活率。西红花酸0.5,1,5,10和20μmol·L^-1处理人膝关节原代软骨细胞12 h后,再加IL-1β10μg·L^-1处理24 h;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基质金属蛋白酶3(MMP-3)、MMP-13及Ⅱ型胶原(CollⅡ)mRNA水平;ELISA检测MMP-3、MMP-13、前列腺素E2(PGE2)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;试剂盒检测一氧化氮(NO)含量;Western印迹法检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)P85、磷酸化PI3K P85(p-PI3K P85)、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、P65 NF-κB和p-P65 NF-κB蛋白表达水平。结果MTT结果显示,西红花酸对人膝关节原代软骨细胞存活率无影响。qRT-PCR和ELISA检测结果显示,与IL-1β处理组相比,西红花酸处理可抑制IL-1β诱导的MMP-3和MMP-13 mRNA和蛋白表达(P<0.05),上调CollⅡmRNA表达水平(P<0.05)。西红花酸还可抑制IL-1β诱导的NO和PGE2释放(P<0.05),降低IL-1β处理组炎症因子IL-6和TNF-α的产生(P<0.05)。此外,IL-1β可显著上调人膝关节原代软骨细胞中p-Akt,p-P65 NF-κB,PI3K P85和p-PI3K P85蛋白表达,而西红花酸处理后可显著抑制IL-1β诱导的p-Akt,p-P65 NF-κB和p-PI3K P85蛋白表达(P<0.05)。结论西红花酸可抑制IL-1β诱导的人膝关节原代软骨细胞过度分解代谢及炎症应答,PI3K/Akt/NF-κB信号通路参与该过程,提示西红花酸可能具有潜在的抗骨关节炎的功效。
关键词: 西红花酸 ；骨关节炎 ；人膝关节原代软骨细胞 ；炎症因子
被引量
5
摘要： 目的检测不同时期膝关节骨性关节炎软骨中β-连环蛋白(β-catenin)和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达。探讨这两种蛋白在骨性关节炎患者疾病进展中的作用及临床意义。方法OA组:取自因骨性关节炎而行人工膝关节置换术(TKA)或关节镜诊治术的患者,共计70例;NOA组:取自创伤后导致的截肢或部分软骨脱落使用关节镜可取出的患者,共计13例。根据WOMAC骨关节炎指数,将70例OA患者分为轻度OA组18例,中度OA组22例,重度OA组30例。免疫组化法对β-连环蛋白和MMP-3的各组阳性细胞进行染色,根据两种蛋白的表达情况,用软件SPSS 22.0统计分析出两种蛋白与OA发展的相互关系。结果β-连环蛋白免疫组化染色结果:NOA组有2例阳性,阳性率为15.38%;OA组患者关节软骨中,轻度OA组10例阳性,阳性率55.56%;中度OA组17例,阳性率77.27%,重度OA组27例,阳性率90.00%。MMP-3免疫组化染色结果:NOA组有1例阳性,阳性率为7.69%;OA组患者关节软骨中,轻度OA组9例阳性,阳性率50.00%;中度OA组14例阳性,阳性率63.64%,重度OA组25例阳性,阳性率83.33%。卡方检验结果示β-连环蛋白与MMP-3在骨性关节炎组阳性表达率明显高于非骨关节炎组(X^2=19.053/16.803,P<0.001)。采用Spearman相关分析法结果提示:软骨组织中β-连环蛋白与MMP-3的表达水平随着WOMAC骨关节炎指数升高而增强,呈显著正相关(r=0.753/0.787,P<0.001);β-连环蛋白与MMP-3的表达水平随着Mankin评分的升高而增强,呈显著正相关(r=0.840/0.774,P<0.001),在OA关节软骨中β-catenin与MMP-3的表达强度之间存在显著正相关(r=0.891,P<0.001)。结论(1)关节软骨中β-catenin和MMP-3的表达较非骨关节炎组显著增强,且随着OA不断加重这两种蛋白的表达强度不断增强,这两种蛋白可作为OA早期诊断的依据。(2)β-catenin、MMP-3参与了OA发生发展过程中软骨的破坏。(3)OA软骨组织中β-catenin、MMP-3表达呈显著正相关,两者对OA的发生可能存在协同作用。
关键词: 骨性关节炎 ；软骨 ；β-catenin ；MMP-3
被引量
24
摘要： 目的制备负载低聚倍半硅氧烷-双氯芬酸钠(polyhedral oligomeric silsesquioxane-diclofenac sodium,POSS-DS)纳米颗粒的甲基丙烯酰透明质酸(hyaluronic acid methacrylate,HAMA)水凝胶微球,对其进行表征并探究体内外生物学特性。方法以八巯基POSS(sulfhydryl POSS,POSS-SH)为纳米构筑平台,采用“点击化学”法将聚二乙醇和DS以化学键接枝其上,构建功能化纳米颗粒POSS-DS,并使用核磁共振波谱仪分析成分,透射电镜对形貌进行表征。为实现药物长期缓慢释放,将POSS-DS包载于HAMA中,通过微流控技术制备多功能水凝胶微球,即HAMA@POSS-DS;利用光镜及扫描电镜对其形态进行表征,观察体外降解及药物释放效率,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)试剂盒及活/死染色法检测对软骨细胞增殖的影响;并构建软骨细胞炎症模型后用HAMA@POSS-DS进行处理,通过免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测相关炎症指标,即Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGG)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、解聚蛋白样金属蛋白酶5(recombinant A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5,Adamts5)、速激肽1(recombinant tachykinin precursor 1,TAC1),以正常培养软骨细胞及未作处理的炎症模型分别作为对照组及空白组,进一步评估其抗炎性能。最后,通过构建大鼠膝关节骨关节炎模型,经X线片及Micro-CT检查,验证HAMA@POSS-DS对骨关节炎的治疗效果。结果POSS-DS纳米颗粒总体粒径均一,约100 nm。HAMA@POSSDS为不透明球体,粒径约100μm,呈多孔结构;体外降解周期为9周,期间缓释负载的POSS-DS。CCK-8试剂盒及活/死染色法检测显示HAMA@POSS-DS无明显细胞毒性,且其释放的POSS-DS对细胞增殖有促进作用(P<0.05)。软骨细胞抗炎实验中,HAMA@POSS-DS组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量高于对照组和空白组、AGG mRNA相对表达量高于空白组、MMP-13、Adamts5以及TAC1 mRNA相对表达量低于空白组,上述差异均有统计学意义(P<0.05)。体内实验显示术后大鼠骨关节炎关节间隙宽度减小,但HAMA@POSS-DS可延缓关节间隙变窄进程,并改善关节周围骨赘增生情况(P<0.05)。结论HAMA@POSS-DS可有效改善局部炎症微环境,并显著促进软骨细胞增殖,有利于促进骨关节炎的软骨再生与修复。
关键词: 低聚倍半硅氧烷 ；水凝胶微球 ；抗炎 ；软骨再生 ；骨关节炎
被引量
12
摘要： 目的探究电针对骨关节炎大鼠的影响及其作用机制。方法将30只大鼠随机分为模型组、电针组及对照组,10只/组。模型组与电针组大鼠采用改良DMM手术造模法制造骨关节炎模型,电针组造模成功后给予双侧“后三里”和“膝前穴”电针灸治疗,模型组不予干预,对照组为假手术组。根据LequesneMG评分标准,对3组大鼠进行大鼠行为学检测。观察各组大鼠软骨下骨的退变情况。通过ELISA法检测各组大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、聚蛋白多糖酶-7(ADAMTS-7)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、软骨寡聚基质蛋白的含量;通过Western blot检测各组大鼠膝关节软骨组织IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3的表达变化;通过RT-PCR检测软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7,MMP-3的mRNA。结果行为学检测发现,模型制备后与对照组相比,模型组、电针组LequesneMG评分升高(P<0.05)。治疗20 d后,与模型组比较,电针组LequesneMG评分降低(P<0.05)。Micro-CT结果显示,与对照组相比,电针组与模型组大鼠软骨下骨均受到损伤,但电针组大鼠的关节软骨下骨损伤程度低于模型组。与模型组比较,电针组大鼠血清中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3、软骨寡聚基质蛋白的含量降低(P<0.05),软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3含量降低(P<0.05)。RT-qPCR结果显示与模型组比较,电针组大鼠软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3 mRNA含量降低(P<0.05)。结论电针能够有效改善关节疼痛等症状,改善关节软骨下骨的损伤,并且可以降低关节软骨组织、血清中IL-1β缓解关节内炎症,同时通过调控Wnt-7B/β-catenin信号通路降低ADAMTS-7、MMP-3等细胞因子,起到保护软骨的作用。
关键词: 电针 ；骨关节炎 ；软骨 ；软骨下骨 ；运动功能
被引量
12
摘要： 背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养。动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致。如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键。目的:探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法,观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化。方法:取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准,伦理批号为S2017-23-7),男2例,女4例;年龄62-72岁,平均(68.3±3.39)岁,采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞,并进行传代培养,从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系。倒置相差显微镜观察各代细胞形态;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定。采用Western blot法检测各代软骨细胞于70%融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达。结果与结论:经过Ⅱ型胶原酶消化后,培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞,3周左右可传代进行下一步研究;形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞。第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P<0.01),且随着培养代数增加表达逐渐降低;MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P <0.01)。结果表明,Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养。体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强,功能性蛋白表达整体下降。3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现,可能是用于实验研究的最佳选择。
关键词: 骨关节炎 ；关节置换 ；人软骨细胞 ；一步酶消化法 ；Ⅱ型胶原酶 ；Ⅱ型胶原 ；聚集蛋白聚糖 ；国家自然科学基金
被引量
14
摘要： 目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探究膝痹宁方(XBN)对膝骨关节炎(KOA)模型大鼠的改善作用机制。方法 将36只大鼠随机分为空白组、模型组、XBN组(12.56 g/kg)、XBN+二甲双胍(AMPK激动剂)组[12.56 g/kg XBN+100 mg/kg二甲双胍],每组9只。除空白组外,其余各组大鼠均通过离断前交叉韧带的方法复制KOA模型。造模成功后,各组大鼠给予相应药物/生理盐水,XBN和生理盐水每天灌胃1次,二甲双胍隔天腹腔注射1次,连续4周。观察大鼠软骨组织病理形态学变化并进行Mankin评分,检测大鼠软骨组织中聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表达水平,血小板反应蛋白解整合素金属肽酶4(ADAMTS-4)、ADAMTS-5、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、MMP-13的mRNA和蛋白表达水平,及AMPK、mTOR蛋白的磷酸化水平。结果 与空白组比较,模型组大鼠软骨组织结构分层紊乱,软骨层基质淡染,潮线出现扭曲或中断,Mankin评分显著升高(P<0.05);软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平和AMPK蛋白的磷酸化水平均显著降低(P<0.05),ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13 mRNA和蛋白的表达水平以及mTOR蛋白的磷酸化水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组大鼠软骨病理形态学变化明显改善,上述评分或指标水平均显著逆转(P<0.05)。与XBN组比较,XBN+二甲双胍组大鼠软骨病变程度进一步减轻,上述评分或指标水平进一步改善(P<0.05)。结论 XBN可改善KOA模型大鼠的软骨损伤,促进软骨合成,减少软骨降解,其作用机制可能与激活AMPK/mTOR信号通路有关。
关键词: 膝痹宁方 ；膝骨关节炎 ；腺苷酸活化蛋白激酶 ；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 ；软骨
被引量
13
摘要： 目的探讨柠檬苦素(Limonin)对膝骨关节炎(KOA)大鼠软骨损伤的影响及机制。方法采用改良Hulth法制备KOA大鼠模型,造模成功后将大鼠分为模型组、硫酸氨基葡萄糖组、柠檬苦素低剂量组和柠檬苦素高剂量组,另设置假手术组,每组10只。灌胃给予硫酸氨基葡萄糖或柠檬苦素,1次/天,连续8周。测量膝关节肿胀程度;HE染色观察软骨组织病理改变,并进行Mankin’s评分;ELISA检测滑膜液中IL-1β、TNF-α及MMP-13水平;实时荧光定量PCR、Western blot检测软骨组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠软骨细胞排列紊乱,边缘结构破坏严重,Mankin’s评分显著升高(P<0.01),膝关节肿胀明显(P<0.01),滑膜液中IL-1β、TNF-α及MMP-13水平显著增加(P<0.01),软骨组织中TLR4、MyD88和NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,柠檬苦素低、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组大鼠软骨细胞分布偶见不均,但结构趋于正常,Mankin’s评分均显著降低(P<0.05),膝关节肿胀改善明显(P<0.05),滑膜液中IL-1β、TNF-α及MMP-13水平均显著降低(P<0.05),软骨组织中TLR4、MyD88和NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论柠檬苦素能明显改善KOA大鼠关节软骨损伤,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。
关键词: 柠檬苦素 ；大鼠 ；膝骨关节炎 ；TLR4/NF-κB信号通路 ；软骨损伤
被引量
5
摘要： [目的]评估天然药物化学成分石松碱(LAs)在前交叉韧带重建(ACLR)术后创伤后骨关节炎(PTOA)兔模型中对炎症通路和软骨完整性的调节作用.[方法]结合生物信息学方法与传统研究手段,识别关键基因并预测干预效果.将兔模型分为正常组、对照组、LAs组和生理盐水组(NS组),并进行ACLR手术.通过分析血清中的促炎细胞因子、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-13、解聚蛋白酶-4(ADAMTS-4)和ADAMTS-5的mRNA和蛋白水平来评估治疗效果.组织病理学变化通过苏木精-伊红染色和番红-固绿染色进行评估.[结果]LAs组中促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平显著下调(P<0.05);同时,MMP-1、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),软骨降解得到抑制.组织学评估结果与分子水平的表现一致,显示LAs组的软骨保存情况和炎症减轻情况显著优于对照组.[结论]LAs在干预PTOA进程中可以显著降低炎症标志物和软骨降解酶的表达水平.
关键词: 石松碱 ；创伤后骨关节炎 ；前交叉韧带重建 ；炎症细胞因子 ；软骨降解 ；生物信息学分析
摘要： 目的:通过观测游泳运动对膝骨关节炎(KOA)小鼠软骨基质降解及NF-质降信号通路介导的炎症反应的影响,探讨游泳运动延缓KOA小鼠软骨退变的分子机制。方法:3月龄C57BL/6小鼠40只,随机分为空白组(Blank)、ACLT模型组(ACLT)、ACLT模型+游泳组(ACLT+Swim)、假手术组(Sham)和假手术+游泳组(Sham+Swim)。采用前交叉韧带横断术(ACLT)制作KOA模型,手术2周后,游泳组小鼠进行6周的无负重游泳运动(40 min/d,5 d/周)。游泳结束后,取各组小鼠膝关节软骨,HE染色观察软骨病理学改变,免疫组织化学染色检测软骨中炎症介质表达、RT-PCR法检测软骨基质相关指标mRNA表达、Western blot技术检测软骨基质及NF-κB通路相关分子蛋白表达,ELISA方法检测血清中炎症指标表达水平。结果:1)与空白组相比:ACLT组软骨损伤明显,Mankin’s评分显著升高(P<0.01);软骨Col II含量显著下降,而MMP-13表达增高(P<0.01);软骨中炎症介质COX-2、iNOS表达增高,血清炎症因子TNF-α、IL-6表达亦增高(P<0.01);NF-κB通路中磷酸化p65、IκBα蛋白水平显著升高(P<0.01)。2)与ACLT组相比:ACLT+Swim组Mankin′s评分明显下降(P<0.01)Col IImRNA(P<0.05)及蛋白水平(P<0.01)均提升,MMP-13mRNA及蛋白水平均显著下降(P<0.01),软骨中炎症介质COX-2、iNOS及血清炎症因子TNF-α、IL-6均显著降低(P<0.01),p65、IκBα磷酸化水平亦明显下降(P<0.01)。结论:中等强度游泳运动可能通过调控NF-κB信号通路介导的炎症反应,抑制软骨基质降解从而延缓软骨退变,干预KOA小鼠病理进程。
关键词: 游泳运动 ；膝骨关节炎 ；软骨退变 ；基质降解 ；炎症反应 ；核转录因子κB信号通路
被引量
6
摘要： 目的:研究表明蛇床子素(osthole,OST)可以改善骨关节炎小鼠的软骨退化,但机制尚未充分阐明。本研究利用网络药理学和分子对接技术以及软骨细胞炎症损伤模型探讨OST改善骨关节炎软骨退化的机制。方法:从4个数据库中收集OST靶基因和膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)靶基因。通过UniProt数据库对获得的靶基因进行标准化转换,使用Venny工具获得了2个的交叉基因,并在STRING数据库中获得相应蛋白质的相互作用,随后通过Cytoscape软件筛选和可视化核心靶基因,并通过基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析通路富集交叉基因预测OST作用的靶基因。再通过分子对接模型验证其结合可能,并可视化其结合结果。通过体外培养兔原代软骨细胞,利用白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导软骨细胞炎症损伤模型。将细胞分为对照组、IL-1β、IL-1β+OST低(IL-1β+OSTL)、中(IL-1β+OST-M)、高(IL-1β+OST-H)剂量处理组及IL-1β塞来昔布处理(IL-1β+celecoxib)组;CCK-8法检测软骨细胞活力;Western blot及免疫荧光检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNFα)和基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)蛋白表达;RT-qPCR法检测IL-6、TNF-α和MMP-13 mRNA的表达。结果:80个OST靶点被鉴定为治疗KOA的潜在靶点,并筛选了10个核心靶基因胱天蛋白酶3(caspase-3,CASP3)、TNF-α、缺氧诱导因子1A(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF1A)、IL-1β、核因子KB1(nuclear factor kappa B subunit1,NFKB1)、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]、NFE2样bZIP转录因子2(NFE2like bZIP transcription factor 2,NFE2L2)、Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、丝裂原活化蛋白激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAKP1)、糖原合酶激酶3b(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3B)。GO和KEGG分析进一步阐明了OST治疗KOA的分子机制,涉及多种信号通路。分子对接模拟证实了OST与IL-17信号通路中的TNF-α及IL-1β关键靶点稳定结合。兔软骨细胞实验证实,软骨细胞呈长梭型、铺路石样;2.5~40μmol/L的OST增加软骨细胞存活。与IL-1β处理组比较,OST抑制L-1β处理的软骨细胞表达IL-6、TNF-α和MMP-13,且OST低、中、高剂量OST抑制IL-6和TNF-α表达的效应与塞来昔布处理组比较无统计学差异,但塞来昔布不能抑制IL-1β诱导的MMP-13的表达。结论:OST可以促进软骨细胞的存活,抑制IL-1β处理的软骨细胞表达IL-6、TNF-α和MMP-13,从而减轻软骨细胞损伤。这些结果提示OST抑制软骨细胞炎症反应和MMP的表达可能是其改善关节炎的分子机制。
关键词: 蛇床子素 ；骨关节炎 ；软骨细胞 ；白细胞介素1β ；炎症
被引量
1
摘要： 目的:研究身痛逐瘀汤含药血清对膝骨关节炎(KOA)大鼠软骨细胞氧化应激及凋亡的保护作用。方法:50只雄性大鼠分别灌胃给予生理盐水、身痛逐瘀汤低、中、高剂量(1.73、3.46、6.92 g·kg^(-1))和硫酸氨基葡萄糖(0.3 g·kg^(-1)),连续给药2周后收集血清。构建KOA模型,分离软骨细胞,随机分为正常组、模型组、身痛逐瘀汤含药血清低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组。软骨细胞培养过程中添加磷酸腺苷(AMP)依赖的蛋白激酶(AMPK)抑制剂Compound C(10μmol·L^(-1)),分为正常组、模型组、身痛逐瘀汤含药血清组、Compound C+身痛逐瘀汤含药血清组。5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)染色检测细胞增殖;原位末端标记法(TUNEL)测定凋亡;DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)水平;比色法测定谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、MMP-13、胶原酶Ⅱ型(ColⅡ)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Weatern blot)检测磷酸化(p)-AMPK及沉默信息调节因子1(Sirt1)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组软骨细胞增殖率、GSH活性、ColⅡ与Aggrecan mRNA表达、p-AMPK和Sirt1蛋白水平显著降低(P<0.01),而ROS水平、MDA含量、TUNEL阳性细胞率、MMP-3与MMP-13 mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,身痛逐瘀汤含药血清能提高KOA大鼠软骨细胞中EdU阳性细胞数、GSH活性、ColⅡ和Aggrecan mRNA表达水平、p-AMPK和Sirt1蛋白水平(P<0.05,P<0.01),而TUNEL阳性细胞率、ROS水平、MDA含量、MMP-3和MMP-13 mRNA表达水平则明显降低(P<0.05,P<0.01)。与身痛逐瘀汤含药血清组比较,Compound C+身痛逐瘀汤含药血清组细胞p-AMPK和Sirt1蛋白表达、GSH活性、ColⅡ和Aggrecan mRNA水平明显降低(P<0.01),TUNEL阳性细胞率、ROS水平、MDA含量、MMP-3和MMP-13 mRNA水平显著升高(P<0.01)。结论:身痛逐瘀汤含药血清能减弱KOA大鼠软骨细胞氧化损伤,降低细胞凋亡,其保护作用可能与激活AMPK/Sirt1信号通路有关。
关键词: 身痛逐瘀汤 ；膝骨关节炎 ；氧化应激 ；细胞凋亡 ；AMP依赖的蛋白激酶(AMPK) ；沉默信息调节因子1(Sirt1)
被引量
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