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摘要： 以水-丙酮为反应溶剂,用五水硫酸铜对L-赖氨酸α-氨基和羧基进行络合保护,再在缚酸剂和催化剂碳酸氢钠作用下与二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)反应制得Nε-Boc保护的赖氨酸铜络合物。然后用脱铜试剂解释赖氨酸铜络合物α-氨基,以碳酸钠为催化剂、水-丙酮为反应溶剂,制备了Nα-9-芴甲氧羰基-Nε-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(Fmoc-L-Lys(Boc)-OH)。考察了4种脱铜试剂对Fmoc-L-Lys(Boc)-OH制备的影响,结果表明硫化钠和8-羟基喹啉是良好的脱铜试剂。以8-羟基喹啉为脱铜试剂,对Fmoc-L-Lys(Boc)-OH生产的工艺条件进行考察。优化工艺条件为:n(赖氨酸铜络合物)∶n(Fmoc-Osu)=1.00∶0.98,室温反应3h,Fmoc-L-Lys(Boc)-OH的收率达91.7%,纯度99.1%。
关键词: L-赖氨酸 ；L-赖氨酸铜络合物 ；脱铜试剂 ；Fmoc—L—Lys(Boc)-OH
被引量
1
摘要： 以N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)和N-芴甲氧羰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)为原料,采用经典的Fmoc固相合成法,通过对氨基酸N端的保护及脱保护、氨基酸的甲基化、缩合等步骤合成线性五肽,以缩合试剂六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷(Py \BOP)关环,分别以59.5%和41.1%的环合收率得到了两个新的环五肽化合物G_1和G_2,结构通过~1HNMR、^(13)CNMR、ESI-MS进行确认。采用MTT法对目标化合物G_1和G_2进行了体外抗肿瘤活性的研究。结果表明:含有脯氨酸片段的Galaxamide类似物G_2具有良好的活性,尤其对人乳腺癌细胞株(MCF-7)具有较好的细胞毒性,其IC_(50)值为5.85 mg/L。
关键词: Fmoc固相合成 ；环五肽 ；Galaxamide ；六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷 ；抗肿瘤活性 ；医药原料
被引量
2
摘要： 目的 研究利拉鲁肽的固相合成。方法 通过汇聚式合成策略,利用固相片段缩合法制备利拉鲁肽。以芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸为原料,分别合成4个全保护多肽片段,依照肽序依次偶联得到全保护利拉鲁肽主链[GLP-1(7-37)],经缩合反应在第20位赖氨酸引入侧链Nα-棕榈酰基-L-谷氨酰基,最后将其从树脂上切割并脱保护得到利拉鲁肽。结果与结论利拉鲁肽粗肽收率为25.65%,纯度为52.35%。采用制备型反相高效液相色谱技术进行分离纯化后,利拉鲁肽纯度为98.42%。该合成工艺反应条件温和、操作简单、合成周期短,是实验室规模下较好的利拉鲁肽制备方法。
关键词: 利拉鲁肽 ；人胰高血糖素样肽-1 ；多肽固相片段缩合 ；多肽固相合成
被引量
2
摘要： 以单甲氧基聚乙二醇(mPEG)和Fmoc-Lys(Boc)-OH(1)为主要原料,经过羧基苄酯化、侧链Boc脱除、ε-氨基丁二酸酐修饰得到功能化的赖氨酸化合物N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸)-L-赖氨酸苄酯(4);1和4分别与mPEG在偶联剂D IC/HOB t的作用下联接,最终分别实现了赖氨酸主链和侧链的mPEG定点修饰,合成了新型的N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸聚乙二醇酯)-L-赖氨酸苄酯(5,总收率52.6%)和N-ε-叔丁氧羰基-N-α-芴甲氧羰基-L-赖氨酸聚乙二醇酯(6,收率93.7%),其结构经1H NMR,IR和MS表征。
关键词: N-保护赖氨酸 ；赖氨酸衍生物 ；单甲氧基聚乙二醇 ；聚乙二醇化 ；合成
被引量
1
摘要： 研究多肽对人体的生理作用,可以提供许多预防和治疗人类疾病的有效方法。由于合成多肽的原料昂贵,且产率低,不易提纯,因此有必要对多肽的合成方法进行不断的简化和改进。选择赖氨酸、甘氨酸为主要研究对象,用二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、9-芴甲氧羰基琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)分别保护赖氨酸的ε-氨基和α-氨基,以水-丙酮为反应体系,制得N-9-芴甲氧羰基-N-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(Fmoc-L-Lys(Boc)-OH)。然后采用HATU为缩合剂活化Fmoc-L-Lys(Boc)-OH结构中的羧基,生成活泼酯,以乙腈-水溶液为反应体系,50-60℃回流反应5h,与甘氨酸缩合制备Fmoc-L-Lys(Boc)-Gly-OH二肽。合成的Fmoc-L-Lys(Boc)-Gly-OH经红外光谱和质谱表征,结构得到验证,为氨基酸保护及多肽合成提供了实验依据和理论参考。
关键词: 多肽 ；L-赖氨酸 ；L-甘氨酸 ；氨基保护 ；缩合剂
被引量
1
摘要： 以双芴甲氧羰基赖氨酸(Di- Fmoc -Lysine)为支化单元采用固相多肽合成技术制备了一种树枝状聚赖氨酸.该聚合物表面活性氨基通过与芴甲氧羰基苯丙氨酸(Fmoc- Phe)反应获得表面完全替代的苯丙氨酸改性树枝状聚赖氨酸.产物的分子量和结构经MS和NMR进行了表征.研究结果表明,利用该方法得到的产物分子量单一,是一种潜在的理想非病毒治疗载体.
关键词: 非病毒载体 ；树枝状 ；多聚赖氨酸 ；表面改性
被引量
6
摘要： 目的研究二甲磺酸赖右苯丙胺的合成工艺。方法以1-苯基-2-丙酮、S-苯乙胺为原料,在三乙酰氧基硼氢化钠作用下进行不对称还原胺化得到(S)-1-苯基-N-((S)-1-苯乙基)丙烷-2-胺(2),2在Pd/C作用下脱苄基得到(1S)-1-甲基-2-苯乙基胺(3);以L-赖氨酸盐酸盐为原料,经二碳酸二叔丁酯保护得到(S)-2,6-双((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(4);中间体3和4在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑作用下经缩合反应得到(2S)-2,6-二-N-Boc-氨基-N-[(1S)-1-甲基-2-苯乙基]己酸胺(5),5在甲磺酸中脱Boc保护基并成盐制得目标物(2S)-2,6-二氨基-N-[(1S)-1-甲基-2-苯乙基]己酸胺二甲磺酸盐。结果与结论目标产物的结构经1H-NM R、13C-NM R、DEPT和HRM S谱确证,总收率为50.5%(以S-苯乙胺计)。本文采用的合成路线具有原料成本低、操作简单高效、立体选择性好、收率高等优点,更适宜工业化生产。
关键词: 二甲磺酸赖右苯丙胺 ；不对称还原胺化 ；合成工艺 ；多动症
【专利/发明】 • CN202011285045.X •
+3位作者
•
申请日：2020-11-17,
公开日：2021-02-19
申请人： 宁夏蓝博思化学技术有限公司
公开（公告）号： CN112375055A
摘要： 本发明公开了依替巴肽关键原料L‑高级精氨酸的制备方法，属于医药中间体合成领域。将1,3‑二(叔丁氧基羰基)胍与对甲苯磺酰氯反应得到1,3‑二‑Boc‑2‑(对甲苯磺酰)胍，接着与N‑芴甲氧羰基‑N'‑叔丁氧羰基‑L‑赖氨酸Fmoc‑hArg(Boc2)‑OH，再经脱Boc保护，上Pbf‑Cl得到N‑(9‑芴甲氧羰基)‑2,2,4,6,7‑五甲基‑2H‑苯并呋喃‑5‑磺酰‑L‑精氨酸。本发明路线中采用对甲苯磺酰基多肽胍基化剂，避免了超低温反应以及腐蚀性强的三氟甲磺酰氯或三氟甲磺酸酐的使用，为该类中间体合成提供了简洁高效的途径。
【专利/发明】 • CN202010046905.8 • •
申请日：2020-01-16,
公开日：2020-06-09
申请人： 浙江工业大学
公开（公告）号： CN111253287A
摘要： 一种液相汇聚式合成索马鲁肽侧链1的方法：将原料2‑(2‑氨基乙氧基)乙醇的氨基用R1保护，接着与溴乙酸乙酯发生亲核取代反应，再经酯水解一锅制得化合物4，将化合物4的羧基用R2保护，并脱除R1，得到化合物6，化合物6与芴甲氧羰基‑L‑谷氨酸1‑叔丁酯经缩合反应，得到化合物8，将化合物8的R2脱除，再与化合物6进行偶联反应，得到化合物10，脱除化合物10的Fmoc，再与18‑(叔丁氧基)‑18氧代十八烷酸进行酰胺化缩合偶联反应，得到化合物13，化合物13脱除R2，得到产物1；本发明方法合成过程有效、可控、低成本高产率，可适用于放大生产；
【专利/发明】 • CN202010047541.5 • •
申请日：2020-01-16,
公开日：2020-06-12
申请人： 浙江工业大学
公开（公告）号： CN111269137A
摘要： 一种制备索马鲁肽侧链的方法：将起始原料2‑(2‑氨基乙氧基)乙醇的氨基用R1保护，接着与α卤代酯发生亲核取代反应延长碳链，一锅法制得两端保护的脂肪链，该脂肪链分别脱除一端保护基并经缩合得到化合物7，脱除R1保护基得到化合物8，与芴甲氧羰基‑L‑谷氨酸1‑叔丁酯进行缩合反应得到化合物10，脱除芴甲氧羰基，再与18‑(叔丁氧基)‑18氧代十八烷酸进行酰胺化缩合反应，得到化合物13，脱除R2保护基得到目标产物链1；本发明方法相对于固相合成成本更加低廉，保护基的选择更加广泛，具有工业化生产应用前景；
【专利/发明】 • CN202411525001.8 •
+3位作者
•
申请日：2024-10-29,
公开日：2025-04-04
申请人： 四川什邡市三高生化实业有限公司
公开（公告）号： CN119751310A
摘要： 本申请提供了一种Fmoc‑Lys(Ivdde)‑OH的制备方法，包括以下步骤：双甲酮与异戊酸在缩合剂的作用下反应生成中间化合物，然后和N‑alpha‑叔丁氧基羰基‑L‑赖氨酸在有机碱的作用下反应得到中间体，再与酸反应，得到中间体，最后在无机碱的作用下与芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺反应，得到Fmoc‑Lys(Ivdde)‑OH。本申请提供的方法以双甲酮为起始原料，通过两步缩合反应、脱Boc反应、上Fmoc反应，共4步反应合成Fmoc‑Lys(Ivdde)‑OH，简化了工艺、且操作简单、反应条件温和，降低了工业化生产难度，不涉及贵重原料，有利于控制生产成本，获得的产品纯度高、收率高。
【专利/发明】 • CN202211006819.X • •
申请日：2022-08-22,
公开日：2022-11-04
申请人： 常州吉恩药业有限公司
公开（公告）号： CN115286554A
摘要： 本申请涉及保护氨基酸合成的技术领域，尤其涉及一种N‑alpha‑9‑芴甲氧羰基‑N‑in‑叔丁氧羰基‑L‑色氨酸的制备方法，包括S1：以L‑色氨酸为原料，与缩合，得L‑色氨酸酯类盐酸盐；S2：以S1产物与三苯基甲醇在试剂A的作用下缩合，得N‑alpha‑三苯甲基‑L‑色氨酸酯；S3：以S2产物与叔丁氧基羰基酸酐缩合，得N‑alpha‑三苯甲基‑N‑in‑叔丁氧羰基‑L‑色氨酸酯；S4：步骤S2产物在酸作用下脱三苯甲基，得N‑in‑叔丁氧羰基‑L‑色氨酸酯；S5：步骤S4产物碱性水解，得N‑in‑叔丁氧羰基‑L‑色氨酸；S6：步骤S5产物与9‑芴甲氧基羰基缩合，得目标产物。本申请能够在低成本、对生产设备要求低的生产条件下以比较高的收率制备得到终产物，更适用于工业生产。
【专利/发明】 • CN202010047542.X • •
申请日：2020-01-16,
公开日：2020-06-16
申请人： 浙江工业大学
公开（公告）号： CN111285780A
摘要： 一种索马鲁肽侧链1的合成方法：将原料二甘醇胺2的端氨基用R1保护，接着与α卤代酯发生亲核取代反应，并通过酯水解一锅制得化合物4，化合物4游离的羧基用R2保护，并且脱除R1保护基，得到化合物6，化合物7与化合物6经缩合反应，得到化合物8，将化合物8的芴甲氧羰基脱除，再与18‑(叔丁氧基)‑18氧代十八烷酸进行酰胺化缩合偶联反应，得到化合物11，化合物11脱除R2保护基，再与化合物6进行缩合偶联反应，得到化合物13，化合物13脱除R2保护基，得到链1；本发明使用汇聚式合成的方法降低反应成本，缩短了反应时间，合成过程有效、可控、低成本高产率，可适用于放大生产；
摘要： 抗体药物偶联物（ADC）是一种将单克隆抗体通过化学连接子与小分子毒素偶联的组合物,已经发展成为新一代靶向抗癌药物。连接子作为ADC的重要组成部分,其稳定性和理化性质对ADC的有效性和毒性具有重要作用。酶可裂解型的肽类连接子在血液中具有良好的稳定性,可以特异性地在肿瘤细胞内经组织蛋白酶B降解释放小分子毒素,在上市药物中应用较多。本文研究了四肽连接子（MC-GGFG）和二肽连接子（MC-VC-PABOH）的合成工艺,以及两个连接子与抗体和毒素的偶联。N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酸（SM1）与四醋酸铅反应得乙酸(N-[（9H-芴-9-基）甲氧基羰基]甘氨酰基氨基)甲酯（M1）,反应溶剂革除文献的甲苯,无水四氢呋喃用量由27倍体积减为15倍体积。后处理革除柱层析,经简单的洗涤纯度96.00%以上,三批收率90.0～93.0%;M1与乙醇酸苄酯发生亲核取代反应得M2,减少乙醇酸苄酯的投料量至8eq,反应溶剂由DCM改为THF,革除柱色谱纯化,使用二氯甲烷低温析出,纯度97.00%以上;马来酰亚胺基己酸（SM2）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）缩合得6-（马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯（M4）,革除柱层析,直接正丁醇析出,纯度98.00%以上;M5与L-苯丙氨酸（L-Phe）缩合得M6,反应溶剂不加水,增加L-Phe和碱的投料量,收率提高10%;M8与M4缩合得MC-GGFG,更换反应溶剂为DMF和H2O,不加有机碱,避免了产物与有机碱成盐,1,2-二甲氧基乙烷重结晶纯化,纯度98%以上。以SM1计,主路线共6步,总收率33.6%。MC-GGFG与甲磺酸依喜替康偶联得MC-GGFG-Dxd,收率55.4%,HPLC纯度98.66%。与曲妥珠单抗偶联得IgG-GGFG-Dxd,UV-Vis法测定DAR为6.2,LC-MS法测定DAR为7.0。Fmoc-Cit与对氨基苯甲醇缩合得Fmoc-Cit-PABOH,EEDQ代替HATU作缩合剂,二氯甲烷和甲醇的混合溶剂代替DMF作反应溶剂,后处理革除柱层析,二氯甲烷打浆纯化,收率90.0%以上,纯度93.00%以上;Fmoc-Cit-PABOH脱Fmoc保护并与Fmoc-Val-OSu缩合得Fmoc-Val-Cit-PABOH,二氯甲烷和甲醇的混合溶剂代替DMF作反应溶剂,革除柱层析,二氯甲烷打浆纯化,收率92.0%以上;再次脱Fmoc保护并与MC-OSu缩合得MC-VC-PABOH,反应溶剂由NMP换为DMF,后处理革除柱层析,甲基叔丁基醚析出,二氯甲烷打浆纯化,收率90.0%以上,纯度97.00%以上。以Fmoc-Cit计,总路线共5步,总收率72.7%。MC-VC-PABOH与二（对硝基苯）碳酸酯反应得MC-VC-PAB-PNP,与依喜替康在不使用有机碱和缩合剂的条件下缩合得MC-VC-PAB-Exa,该反应体系较文献简单,后处理革除柱层析,使用甲基叔丁基醚析出,收率47.4%,HPLC纯度95.34%。最后与曲妥珠单抗偶联得IgG-VC-Exa,UV-Vis法测定DAR为4.98。
关键词: 抗体药物偶联物 ；肽类连接子 ；合成工艺 ；偶联
摘要： 罗沙司他（Roxadustat，FG-4592）是一种抑制缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶（HIF-PH）活性的小分子抑制剂，在临床上用于治疗肾性贫血。论文重点围绕Bischler-Napieralski环合反应与氧化反应在罗沙司他关键中间体新工艺合成研究中的应用展开，并研究了O-[2-[[叔丁氧羰基]氨基]乙基]-N-[芴甲氧羰基]-L-酪氨酸的合成工艺。具体内容主要包括以下几个方面： 第一章，主要介绍了罗沙司他的研究背景，综述了近年来罗沙司他的合成研究进展，并对各条合成路线进行了简要的评述;提出了两种合成罗沙司他关键中间体的设计思路和一条L-酪氨酸衍生物的合成路线。 第二章，首先根据逆合成分析可知关键中间体的合成核心步骤是环合反应和苄位亚甲基氧化反应。因此介绍了Bischler-Napieralski环合反应，简述了苄位亚甲基的氧化方法：金属催化氧化、NHPI催化氧化等。其次，研究了设计思路一：以对羟基苯甲醛为起始原料，经过O-Ullmann芳醚化、Erenmever-Plocl环合、醇解，再经Bischler-Napieralski环合制备了1-甲基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯。该路线存在各步反应收率较低、后处理复杂等问题，尤其是环合反应的收率不足10%。为此，探究了收率低的原因：(Z)-2-乙酰氨基-3-(4-苯氧基苯基)丙烯酸甲酯中双键的存在影响了电子云分布，钝化了底物的反应活性。最后，对设计思路二进行了研究，发现通过常用的苄位亚甲基氧化成酮的方法（如Oxone/KBr，KMnO4/MnO2等）氧化3,4-二氢异喹啉衍生物的4位亚甲基时，均未得到目标产物，且该二氢异喹啉衍生物较易芳构化。因此，最终确定了以L-酪氨酸为起始原料，经酯化、酰胺化、芳醚化、Bischler-Napieralski环合、脱氢芳构化、氧化、重排和水解成功制备了目标产物4-羟基-1-甲基-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯，8步反应总收率9%。然而，重排和水解的总收率仅有20%，主要原因在于重排反应主要遵循Boekelheide反应的反应机理，分离得到更多的是1-(乙酰氧基甲基)-7-苯氧基异喹啉-3-甲酸甲酯。 第三章，近年来多肽类药物在市场中扮演着愈来愈重要的地位，因此论文又以L-酪氨酸为起始原料，经酯化、酰胺化、醚化、水解和Fmoc保护成功制备了O-[2-[[叔丁氧羰基]氨基]乙基]-N-[芴甲氧羰基]-L-酪氨酸，5步反应总收率约为54%，目标产品ee值99.8%。各步反应均在室温条件下即可进行，均有中等及以上的收率。此外，醚化与水解采用一锅法避免了Mitsunobu反应（光延反应）中三苯基氧磷的柱层析分离。该制备方法具有原料廉价易得、成本较低、工艺简单、产品纯度较高、三废少等特点，适于工业化生产。
关键词: 罗沙司他 ；L-酪氨酸 ；保护氨基酸 ；合成工艺 ；小分子抑制剂
摘要： 目的:细菌感染对公共健康造成了严重的威胁,抗生素是治疗的有效手段。但由于抗生素的长期误用和滥用,导致细菌对抗生素产生耐药性,到2050年,预计每年因抗生素耐药性造成的死亡人数为1000万人。耐药性已成为21世纪主要的公共卫生威胁之一。耐药菌的检测对于指导用药的种类、时间和剂量具有重要的意义,可延缓耐药菌的出现。但是,目前对于耐药细菌检测存在耗时长、操作繁琐和仪器昂贵等缺陷。荧光探针具有灵敏度高、响应速度快、操作简单等优点,已成为生命科学领域中最重要的分析工具之一。此外,开发有效的治疗策略是延缓和遏制耐药菌的另一个有效途径。近年来,抗菌光动力疗法（a PDT）和抗菌光热疗法（a PTT）由于具有低的毒性、高的生物安全性、广谱的抗菌活性和可忽略的耐药性,已成为对抗耐药菌的有效策略。单一的a PDT和a PTT都有其不可避免的缺陷,且a PTT产生的热难免会对周围的组织造成损伤。a PTT和a PDT协同治疗集成了二者的优点,有望克服a PTT的热休克效应和a PDT感染微环境的缺氧性。因此,本论文主要设计合成近红外荧光探针用于快速、高效的检测耐药菌;合成细菌感染酸性微环境响应的多功能光敏材料,在激光照射下,a PDT和a PTT协同高效清除耐药菌,主要工作如下:1.设计合成了检测β-内酰胺酶（β-lactamase）的近红外荧光探针ASC-BL,探索了ASC-BL探针对β-lactamase的检测性能,并在细菌层面研究其监测耐药菌的能力,预期为耐药细菌感染的快速精确检测开发新的技术手段。2.合成了细菌感染酸性微环境响应的有机分子ASC-Le,测试其在不同p H条件下的光热性能和光动力性能,研究其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及其形成的生物膜的杀灭破坏性能,最后在活体层面上评估其治疗伤口感染的能力,试图为耐药菌感染的治疗提供一种新的方法和策略。方法:1.以2,3,3-三甲基-3H-吲哚、3-溴丙酸、2-氯-3-甲酰基环己-2-烯-1-羧酸、乙酸钠、乙酸酐、3-羟基苯硫酚和碳酸钾为原料经三步合成近红外荧光团ASC,然后以4-甲氧基苄基（7S）-3-（氯甲基）-8-氧代-7-（2-苯基乙酰胺）-5-噻-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯和ASC为原料经亲核取代反应得到荧光探针前体化合物。接着在以苯甲醚、三氟乙酸和二氯甲烷为脱保护剂将前体化合物的保护基团脱去,得到近红外荧光探针ASC-BL。利用高分辨质谱、核磁氢谱和碳谱对近红外荧光探针ASC-BL的结构进行了表征。通过紫外-可见分光光度计（UV-Vis）、荧光光谱仪和质谱仪研究了近红外荧光探针ASC-BL对β-lactamase的检测性能。利用分子对接、理论计算和反应液质谱研究了近红外荧光探针ASC-BL响应β-lactamase的机制。运用MTT实验检测了ASC-BL的生物安全性。进一步,利用UV-Vis和荧光光谱仪测试ASC-BL体外检测耐药菌的能力。在细菌层面上,利用激光共聚焦显微镜（LSCM）来研究ASC-BL对耐β-内酰胺耐药菌的成像检测能力。2.以N-（叔丁氧羰基）-L-亮氨酸一水合物、对氨基苯甲醇和三溴化磷为原料经过两步合成丁基(1-((4-（溴甲基）苯基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯。以丁基(1-((4-（溴甲基）苯基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯和ASC为原料通过亲核取代反应合成（E）-2-(2-(6-((4-(2-(（叔丁氧基羰基）氨基)-4-甲基戊酰胺基)苄基)氧基)-2,3-二氢-1H-噻吨-4-基)乙烯基)-1-（2-羧乙基）-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓前体化合物。最后以三氟乙酸为脱保护剂,二氯甲烷为溶剂,脱去保护基团,得到化合物ASC-Le。利用高分辨质谱、核磁氢谱和碳谱对ASC-Le进行了结构表征。通过测定ASC-Le在不同p H条件下的紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）和荧光光谱来研究其光学性能。利用红外热成像仪测定不同p H条件下ASC-Le的光热性能。利用660 nm激光器和荧光光谱仪来研究ASC-Le产生活性氧（ROS）的能力。采用稀释涂布平板法来研究ASC-Le对MRSA及其生物膜的破坏和抗菌性能。最后,在动物水平上,通过感染伤口的大小、小鼠体重和病理切片来评估ASC-Le的抗MRSA感染性能和生物安全性。结果:1.合成的近红外荧光探针ASC-BL有宽的吸收峰,且最大吸收波长位于705nm;探针ASC-BL的荧光发射波长为763 nm。探针可以高选择性和灵敏性地响应β-lactamase,并且表现出良好的荧光增强效应,且响应时间为7 min,可用于耐药细菌的快速检测。同时测得β-lactamase的米氏常数（Km）为1.79μM,细菌水平的实验显示探针ASC-BL可以很好地对产生β-lactamase的耐药细菌进行检测和成像。2.合成的多功能光敏分子ASC-Le在激光照射下同时具有产生ROS和热的性能,并且在酸性环境中可增强其产生ROS和热。与正常的生理环境p H 7.4相比,ASC-Le在酸性环境中（p H 5.5）温度可升高10~oC。稀释涂布平板法、STYO-9/PI染色和生物膜结晶紫染色显示ASC-Le具有良好的协同清除MRSA生物膜和抗MRSA的性能。在动物水平上,ASC-Le可以杀灭感染部位的MRSA,并且伤口愈合良好,同时对小鼠主要的脏器无影响。结论:本论文以半花菁骨架ASC为母体分别合成了检测耐药菌的近红外荧光探针ASC-BL和具有PTT/PDT协同抗菌作用的细菌感染酸性微环境响应型有机功能分子ASC-Le。以耐药菌中的β-lactamase为生物标志物,探针ASC-BL显示出高的灵敏性和选择性,并且发射波长达到763 nm,可以快速精准检测耐药菌。ASC-Le可以响应酸性微环境增强PTT/PDT,可以杀死MRSA及其形成的生物膜,但是对正常组织损伤较小,在耐药细菌治疗中具有广阔的应用前景。
关键词: 有机功能分子 ；β-内酰胺酶 ；pH响应 ；耐药菌
摘要： 基因密码子扩展技术是通过遗传编码的形式将功能基团引入到蛋白质实现其新功能。目前主要基于氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对系统基因编码非天然氨基酸以及构建正交小分子配体对应用于蛋白质工程研究中。目前此正交系统在模式动物小鼠体内的应用已有报道,但尚无经济动物羊或牛等的应用报道。本文旨在研究利用基因密码子扩展技术调控羊功能基因的分子遗传育种方法。通过对免疫力相关蛋白粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF)的克隆、生物信息学分析与功能研究,利用 Nε-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(Nε-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysine,BocK)参与的正交表达系统构建以及羊原代细胞中BocK参与的功能性蛋白正交表达研究,阐明利用基因密码子扩展技术调控羊功能基因的分子遗传育种方法的可行性。论文包含三部分内容:1绵羊粒细胞集落刺激因子的克隆、生物信息学分析与功能研究GCSF调节中性粒细胞前体细胞的成熟、增殖和分化,在许多物种中得到广泛研究。为探讨绵羊GCSF(sGCSF)变异株的功能,本研究首先比较了其mRNA表达水平的差异,结果表明GCSFv2的活性和mRNA表达水平均高于GCSFv1。序列比对结果表明,它们与牛GCSF的同源性最高。其次克隆并表达预测的绵羊GCSF亚型及其保守的C末端(命名为GCSFwt),并在哺乳动物细胞中稳定表达。纯化后的GCSF在体内和体外均具有不同的刺激粒细胞增殖分化的功能,GCSFwt为最佳。这些结果表明,羊GCSF的各种异构体都能够刺激前体细胞的增殖和分化,激活中性粒细胞的成熟,可用于研究有效的非抗生素蛋白药物。此外,GCSF还可以作为提高绵羊免疫力等遗传育种的候选靶点。2利用BocK参与的正交表达系统构建利用BocK参与的正交表达系统在多种原核和真核细胞中都有成功的研究报道,但是尚无该系统在羊原代细胞中的研究报道。本研究为了验证构建本系统的成功与否,将GFPwt/GFP151TAG作为报告基因融入非天然氨基酸的表达系统——利用BocK参与蛋白质表达的正交表达质粒,确认非天然氨基酸嵌入型质粒系统的可靠性。为了增加BocK参与的蛋白质合成的表达效率,对构建的表达系统进行了优化。分别用ExpiCHO-S细胞、HEK293F细胞、绵羊颗粒细胞和绵羊胚胎成纤维细胞进行转染测试,结果显示构建的质粒表达系统可以分别在几种细胞中利用BocK,在真核表达系统中将其嵌入到测试蛋白中,参与GFP151TAG-BocK蛋白的表达。本研究成功的构建了可以利用BocK参与蛋白表达的正交表达系统,并证明该正交表达系统在绵羊颗粒细胞和绵羊胚胎成纤维细胞中应用的可行性,为在羊中利用非天然氨基酸参与的功能性蛋白质表达及相应的表达调控的研究奠定基础。3羊原代细胞中BocK参与的功能性蛋白正交表达研究为了研究BocK参与功能蛋白GCSF3TAG-BocK表达的正交表达系统在羊细胞中应用的可行性,本文构建了哺乳细胞真核表达载体pRTL1-GCSF3TAG、pLou-PylRSwt-8xRU-GCSF3TAG-BocK 和 pLou-PylRSwt-8xRU-GCSFwt,分别检测非天然氨基酸BocK嵌入到各种突变型蛋白中的表达。表达和纯化的非天然氨基酸BocK嵌入蛋白GCSF3TAG-BocK,通过M-NSF60细胞检测,结果确认其具有生物学活性。将BocK嵌入型的GCSF注射到小鼠体内进行体内试验,包括体内代谢试验和刺激机体产生粒细胞及其祖细胞的动力学试验,结果显示注射到小鼠体内的GCSF3TAG-BocK蛋白与GCSFwt蛋白一致,在8h达到最大浓度,之后迅速代谢到低水平,24 h测试时可以检测到蛋白刺激机体产生大量粒细胞及其祖细胞。将纯化的GCSFwt/GCSF3TAG-BocK分别添加到颗粒细胞和成纤维细胞培养基中作为试验组,以培养基中未添加GCSF的细胞为对照,通过Alarmarblue检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化;转染真核表达质粒到颗粒细胞中后,利用RT-PCR方法检测GCSF在细胞中的表达水平,利用Alamarblue检测细胞培养基上清中表达的GCSFwt/GCSF3TAG-BocK的生物学活性。结果表明,在24 h和48 h,在0.06-600 ng/mL的范围内随着加入GCSFwt/GCSF3TAG-BocK的终浓度增加,颗粒细胞活力升高。试验组颗粒细胞体外培养24 h后,与阴性对照组相比,细胞周期的分布显著改变。试验组凋亡率和对照组相比,48h检测时凋亡率显著降低(P<0.05)。转染后72 h,转染了携带GCSF基因质粒的颗粒细胞中GCSF的表达量显著提高了 20万倍以上;转染了携带GCSFwt基因质粒和转染了携带GCSF3TAG基因质粒并在培养基中添加了 BocK的颗粒细胞培养基上清与对照相比有极显著的GCSF生物学活性。在成纤维细胞中的结果表明,绵羊成纤维细胞培养基添加0.03-300 ng/ml GCSFwt/GCSF3TAG-BocK,细胞活力变化差异不显著。试验组与对照相比,细胞周期的分布显著改变。试验组(GCSFwt)与对照组相比,24 h和72 h检测时凋亡率差异极显著(P<0.01),48 h检测时凋亡率差异不显著(P>0.05)。转染后72 h,转染了携带GCSF基因质粒的成纤维细胞中GCSF的表达量显著提高了 5万倍以上;转染了携带GCSFwt基因质粒和转染了携带GCSF3TAG基因质粒并在培养基中添加了 BocK的成纤维细胞培养基上清与对照相比有显著的GCSF生物学活性。综上表明,GCSF在体外培养的绵羊颗粒细胞中,可调控绵羊颗粒细胞周期,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。GCSFwt和GCSF3TAG-BocK蛋白可以在绵羊颗粒细胞中表达并具有生物学活性。GCSF可调控绵羊成纤维细胞周期,抑制细胞凋亡;GCSF蛋白可以在成纤维细胞中表达并具有生物学活性。BocK参与功能性蛋白GCSF3TAG-BocK表达的正交表达系统可用于分子遗传育种。
关键词: 绵羊 ；粒细胞集落刺激因子 ；蛋白质功能 ；GCSF3TAG-BocK ；正交表达系统
被引量
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摘要： 多西他赛(Docetaxel,DTX)已广泛用于治疗多种癌症。然而,DTX水溶性差,临床用DTX注射液是在非离子表面活性剂聚山梨醇酯80和乙醇中配制而成,从而导致超敏反应和严重的副作用;另外患者注射前要服用苯海拉明等药物进行脱敏处理。将DTX与水溶性强的高分子聚合物进行偶联,可以提高DTX的水溶性,降低毒副作用,是DTX新剂型的主要研发方向。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种高度不饱和的ω-3脂肪酸,能够抑制肿瘤细胞增殖,同时DHA还可以抑制多种肿瘤细胞的耐药性,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,DHA可以增强DTX的抗肿瘤作用。本论文把DTX和DHA与合成的双功能化右旋糖酐(Dextran)通过化学偶联合成双药偶联物Dextran-DHA-DTX。该反应首先将叠氮赖氨酸和谷氨酸二甲酯盐酸盐同时与右旋糖酐连接生成含有叠氮基团以及负电性的功能化右旋糖酐;之后将DTX的7-OH以及10-OH进行保护,只裸露2'-OH唯一的反应位点;然后以N-alpha-芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸为起始氨基酸,通过保护、脱保护以及酰胺反应等反应连接其他氨基酸及DHA,使其与保护的DTX发生酯化反应,之后脱去7-OH和10-OH的保护,生成含有DTX和DHA的连接臂;最后将DHA-DTX-连接臂与功能化的右旋糖酐通过高效、专一的点击化学共价连接到一起,生成双药偶联物Dextran-DHA-DTX。我们对偶联物的理化性质进行了研究。通过核磁共振氢谱对偶联物中的DTX含量进行确定,DTX含量为13.9%(w/w)。偶联物Dextran-DHA-DTX具有高水溶性,DTX的水溶性为6-7μg/mL,而偶联物中DTX的水溶性为27.1 mg/mL,其水溶性约为DTX的4000倍。通过透射电子显微镜观察该偶联物在水溶液中为球形的纳米颗粒;马尔文粒径仪测定纳米粒的直径为98.0±6.4nm,适合于肿瘤纳米颗粒的治疗;zeta电位为-24.1±1.5mV,表明该偶联物结构比较稳定。该偶联物在大鼠血浆中进行了释放实验,结果表明在8 h时血浆累积释放达到60%,之后趋于平缓;而DTX在0.5 h时即达到最大值,之后缓慢下降,结果表明偶联物在血浆中具有缓释作用。之后进行了偶联物在PBS中的释放实验,偶联物在pH7.4和pH5.7的PBS中在24 h内均缓慢释放,之后趋于平稳,而DTX在12 h时释放达到100%,之后趋于平缓;表明偶联物在人体生理条件下能够持续释放DTX。肿瘤细胞药物吸收实验结果显示,偶联物在乳腺癌细胞MCF-7中持续释放游离的DTX,具有时间依赖性,在0-72 h细胞中游离DTX和总DTX含量逐渐升高,然后开始降低;与原型药DTX不同的是,在1 h和3 h时偶联物处理的细胞中游离DTX含量明显低于原型药DTX,表明偶联物进入细胞后DTX从偶联物中缓慢释放。SRB法进行的细胞增殖抑制实验结果显示,与MCF-7细胞和人肺癌H460细胞共同孵育72h时,DTX的IC50值分别为6.48±2.61 ng/mL和6.03±2.45 ng/mL,偶联物的IC50值分别为9.48±3.12ng/mL和6.92±2.36ng/mL,原型药DTX和偶联物在抑制细胞增殖活性方面没有显著性差异,表明偶联物和原型药DTX具有相似的肿瘤细胞增殖抑制活性。使用乳腺癌细胞4T1构建的Balb/c小鼠荷瘤模型进行了药代动力学和组织分布实验,偶联物与原型药DTX分别以12mg/kg剂量尾静脉给药。药代动力学结果显示,原型药DTX组其最大血药浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC)分布为1.85±0.20μg/mL 和 14.22±5.38 μg/mL×h,偶联物组 Cmax 和 AUC 分别为 35.46±5.22 μg/mL 和129.38±12.05 μg/mL×h;另外偶联物的半衰期和清除率与原型药DTX相比较也有显著性差异,结果表明Dextran-DHA-DTX偶联物比原型药DTX组具有更高的浓度和更长的血液循环时间。组织分布结果显示,原型药DTX给药组肿瘤中游离DTX含量在0.5 h时最高,然后迅速下降;而偶联物组肿瘤中游离DTX含量在12 h时达到最高、然后缓慢下降。在给药12、24和96 h时偶联物组肿瘤中游离的DTX含量是原型药DTX组的5.69、6.88和2.75倍,并且偶联物组在脾、肺中的DTX含量低于原型药DTX组,表明Dextran-DHA-DTX偶联物相较于DTX能够在肿瘤中聚集,在正常组织中的分布减少,具有肿瘤靶向性和组织选择性。Dextran-DHA-DTX偶联物在H460和MCF-7两种异种移植瘤裸鼠模型中均表现出优异的治疗效果。当给药剂量为6 mg/kg,每周给药1次,给药4次时,偶联物组在H460裸鼠模型中的抑瘤率为36.8%,显著高于同等剂量下DTX的抑瘤率(19.6%);在12 mg/kg剂量组,偶联物抑瘤率为58.8%,且没有引起裸鼠体重的下降,各正常组织的组织切片没有明显的病变,而预实验结果显示12mg/kg原型药DTX会导致裸鼠死亡或者体重下降超过20%,表明偶联物具有较高的抗肿瘤活性和安全性。在乳腺癌细胞MCF-7裸鼠模型中,12 mg/kg偶联物抑瘤率为99.8%,几乎可以使肿瘤完全消失,且没有引起裸鼠体重下降,表明该偶联物对MCF-7乳腺癌肿瘤具有极强的抑制作用。综上所述,合成的双药偶联物Dextran-DHA-DTX载药量高,形成的纳米颗粒均匀,结构稳定,具有高溶解性、缓释性、肿瘤靶向性、高抗肿瘤活性和低毒性等特点,具有继续研究和开发的价值。
关键词: 多西他赛 ；右旋糖酐 ；二十二碳六烯酸 ；纳米颗粒 ；偶联物
摘要： 智能型抗肿瘤药物载体具有控释药物、降低药物毒副作用和提高药物的生物利用度等优势,对于提高化疗药物的抗肿瘤疗效具有重要意义。本论文以赖氨酸为母体、以酰胺键为敏感基团,修饰小分子药物,构建一系列具有酶、离子响应的水凝胶药物载体。首先,设计合成N-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-氨甲苯酸凝胶因子,在PBS（pH=7.4）中制备了一类胰酶敏感的小分子水凝胶。凝胶因子之间存在着π-π作用促使凝胶因子具有良好的成胶性能。通过HPLC与扫描电镜研究了凝胶的胰蛋白酶敏感过程,验证了该凝胶的酶响应性能,并对阿霉素包载,体现出了良好的载药及胰酶敏感控制释放性能。其次,构建了一类含有γ-氨基丁酸与赖氨酸结合的可修复型水凝胶,通过HPLC检测该凝胶的胰蛋白酶敏感性能以及药物释放性能,该凝胶通过酰胺键断裂,实现良好的胰蛋白酶控制释放阿霉素和胰蛋白酶酶解释放药物γ-氨基丁酸的能力。最后,以酰胺键为敏感基团,利用D-苯丙氨酸与赖氨酸构建了一类酶、离子双重响应载药水凝胶,在PBS7.4缓冲溶液具有良好的成交性能,临界成胶浓度为8mg/m L。通过高效液相色谱验证该水凝胶具有良好的胰蛋白酶敏感性。通过紫外荧光检测验证了其离子敏感性,可实现对Ce2+阳离子和BH4-阴离子的特异性响应,对BH4-离子的敏感范围在10-2mol/L至10-1mol/L之间。本研究工作为缓释药物水凝胶药物载体以及联合给药系统提供一种新的方式。
关键词: 药物载体 ；水凝胶 ；酶敏感 ；离子响应 ；缓释药物
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