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摘要： 目的通过构建N-乙酰转移酶基因(NAA10)腺病毒表达载体,探讨其对食管癌细胞TE-1增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法 PCR技术扩增NAA10全长编码基因,通过重组腺病毒表达系统将其克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体,重组腺病毒表达载体并包装腺病毒颗粒Ad-NAA10。将携带人NAA10基因的腺病毒感染食管癌细胞TE-1,Western blot检测NAA10蛋白的表达,CCK-8检测其对TE-1细胞增殖的影响,碘化丙啶(PI)染色检测其对TE-1细胞周期的影响,Hoechst/PI双染检测其对TE-1细胞凋亡的影响。结果酶切鉴定和测序证实NAA10腺病毒表达载体构建成功,腺病毒颗粒Ad-NAA10能在TE-1细胞中正常表达;NAA10可以抑制TE-1细胞的增值,影响细胞周期分布,促进细胞凋亡。结论 NAA10通过G1期阻滞和诱导凋亡从而抑制食管癌细胞的增殖,为进一步确定食管癌特异性生物标志物及探讨食管癌发病机制奠定基础。
关键词: N-alpha-乙酰转移酶10 ；腺病毒 ；食管癌
被引量
1
摘要： 细胞中的mRNA和非编码RNA包含着大量的表观化学修饰.在这些修饰中,N^(4)-乙酰胞苷(ac^(4)C)是较为独特的一种,在真核生物和原核生物的tRNA,rRNA和mRNA中均有发现.研究表明,ac^(4)C RNA可能具有多种生物学功能,包括调节蛋白的翻译过程、影响RNA的稳定性及改变RNA-蛋白相互作用等.但当前对其修饰路径的研究还不成熟,催化ac^(4)C RNA形成的乙酰转移酶目前仅有NAT10被鉴定出来.不仅如此,目前对ac^(4)C RNA进行检测和测序的技术手段还相当局限.本文综合评述了ac^(4)C RNA的分布以及在基因表达调控中的作用和机制,重点介绍了ac^(4)C RNA的检测技术,并对ac^(4)C RNA当前研究中的不足和机遇进行了总结和展望.
关键词: N4-乙酰胞苷 ；RNA修饰 ；检测方法
被引量
2
摘要： 乙酰转移酶10(N-acetyltransferase 10,NAT10)是mRNA乙酰化修饰的关键酶,通过介导ac4C乙酰化修饰(N4-acetylcytidine,ac4C)调控靶基因的表达并调控多种癌症的生物学功能,但NAT10对宫颈癌(cervical cancer,CC)细胞的调控却少有报道。本研究拟探讨NAT10对宫颈癌细胞恶性行为的影响。首先,通过数据库分析发现NAT10高表达与宫颈癌病人预后不良相关。MTT实验和集落形成结果显示,过表达NAT10增加了宫颈癌细胞的生长活性(P<0.05)和增殖能力(P<0.001);Transwell迁移和侵袭结果表明,过表达NAT10提高了宫颈癌细胞的迁移(P<0.01)和侵袭(P<0.05)能力;Western免疫印迹结果显示,过表达NAT10使间皮细胞标志物波形蛋白(vimentin)上调,使上皮细胞标志物E-钙黏着蛋白(E-cadherin)下降。并且,生物信息学分析显示,盘状蛋白结构域受体1(discoidin domain receptor 1,DDR1)可能是NAT10的下游靶基因,RNA结合蛋白免疫沉淀结果表明,NAT10可以直接结合DDR1的mRNA(P<0.05),Western免疫印迹和RT-qPCR的结果表明,过表达NAT10使DDR1蛋白质水平和mRNA水平明显上调(P<0.05)。此外,RNA乙酰化免疫沉淀结果表明,过表达NAT10增加了DDR1 mRNA的乙酰化水平(P<0.001),并且EGFP报告系统进一步确定了NAT10识别DDR1 mRNA的乙酰化位点。mRNA半衰期的结果显示,NAT10可提高DDR1 mRNA的稳定性(P<0.05)。综上所述,NAT10促进宫颈癌细胞的生长、增殖活性以及迁移侵袭能力,其机制是通过对DDR1 mRNA进行乙酰化修饰延长其mRNA的稳定性,这可能为mRNA乙酰化修饰对宫颈癌发生发展的分子机制提供新的见解。
关键词: 乙酰转移酶10 ；盘状蛋白结构域受体1 ；ac4C乙酰化修饰 ；宫颈癌 ；迁移 ；侵袭
被引量
3
摘要： 为了探究弓形虫组蛋白乙酰转移酶MYST-A对弓形虫蛋白质翻译后修饰的影响,在弓形虫ToxoDB数据库获取基因全长序列,构建表达载体,大量纯化His标签重组蛋白质,免疫实验动物,制备多克隆抗体并纯化。利用间接免疫荧光实验对其进行亚细胞定位分析,用不同浓度的抗体作用于弓形虫并提取全虫蛋白,进行Western-blot验证,分析其是否对虫体蛋白质翻译后修饰产生影响。ALP2a蛋白质是组成组蛋白乙酰转移酶复合物的重要组成部分,MYST-A与ALP2a可能形成组蛋白乙酰转移酶复合物共同参与组蛋白的翻译后修饰,拟通过分子互作实验验证两者是否发生相互作用。结果表明:成功构建重组表达载体并纯化重组蛋白质His-MYST-A。His-MYST-A免疫小鼠以及兔子,并获得了特异性多克隆抗体。IFA分析结果表明:在细胞内的虫体中和游离速殖子中,弓形虫MYST-A均在虫体细胞质内广泛分布。MYST-A对弓形虫蛋白质翻译后修饰影响结果表明,随着抗体浓度的增加,泛素化、单甲基/二甲基化、丙二酰化、琥珀酰化的修饰水平均增强(尤其是55 kDa处),说明该蛋白质起负调控作用。分子互作实验验证MYST-A与ALP2a两者发生相互作用。研究进一步揭示了弓形虫组蛋白乙酰转移酶MYST-A对蛋白质翻译后修饰的重要调控作用,为深入研究其生物学功能奠定了基础。蛋白质翻译后修饰的研究对了解弓形虫的致病机制及其与宿主的相互作用、致病机制有重要意义,同时也为新型弓形虫疫苗研制及药物靶标的筛选提供一定的参考价值和理论依据。
关键词: 弓形虫 ；MYST-A ；原核表达 ；多克隆抗体 ；蛋白质翻译后修饰
被引量
2
摘要： 目的:应用微小RNA(miRNA)基因芯片筛选食管癌组织中的差异miRNA,并探讨其在食管癌进程中的生物学作用。方法:选取2021年12月至2023年12月河南省人民医院收治的36例食管癌患者的食管癌组织和癌旁组织作为研究资料,采用miRNA微阵列芯片试剂盒筛选食管癌组织和癌旁组织中的差异miRNA。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒验证食管癌组织和癌旁组织中差异miRNA的相对表达水平。采用miRNA靶基因在线预测工具Targetscan对差异miRNA进行靶基因预测。采用STRING数据库对筛选出的miRNA靶基因进行基因本体论(GO)富集分析。结果:食管癌组织中miR-1268a(9.69±0.67)、miR-944(16.79±1.23)、miR-4505(7.96±0.68)、miR-21-5p(25.33±1.52)、miR-25(6.17±0.55)、miR-455-5p(11.94±0.86)、miR-142-3p(17.22±1.34)的荧光信号强度明显高于癌旁组织(1.54±0.11、3.01±0.24、2.16±0.18、5.82±0.38、2.31±0.17、3.41±0.28、6.87±0.47,t=24.13、15.66、11.82、13.44、8.53、10.65、8.23,P<0.05);食管癌组织中miR-1972(1.37±0.197)、miR-4274(5.62±0.32)、miR-6126(3.37±0.20)、miR-451a(5.50±0.41)和miR-34a-5p(2.35±0.18)的荧光信号强度明显低于癌旁组织(8.10±0.53、13.64±0.91、9.98±0.73、18.37±1.42、10.66±0.74,t=16.82、7.94、8.92、10.17、14.01,P<0.05)。食管癌组织中miR-1268a(1.24±0.15)和miR-944(1.62±0.20)的相对表达水平明显高于癌旁组织(0.64±0.12、0.70±0.11,t=18.76、24.22,P<0.05),miR-1972(1.19±0.16)的相对表达水平明显低于癌旁组织(1.54±0.10,t=11.16,P<0.05)。miR-1268a的关键靶基因为溶质载体家族8成员A2(SLC8A2)、含EH结构域的蛋白2(EHD2)、富亮氨酸重复LGI家族成员3(LGI3)、4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶1(HOGA1);miR-944的关键靶基因为结肠癌转移相关基因1(MACC1)、胞质磺基转移酶家族6B成员1(SULT6B1);miR-1972的关键靶基因为序列相似性家族83成员F(FAM83F)、N-乙酰转移酶1(NATD1)。miR-1268a、miR-944的靶基因SLC8A2、EHD2、LGI3、HOGA1、MACC1、SULT6B1的生物过程主要集中于心脏传导调节、钙离子浓度调节、内吞作用和受体内化、蛋白质和受体定位、氨基酸和化合物代谢、细胞死亡等,分子功能主要集中在与AMP依赖性蛋白激酶、钙离子转运蛋白、网格蛋白的结合,以及对细胞转氨酶活性的影响等方面。结论:miR-1268a、miR-944和miR-1972在食管癌组织和癌旁组织中存在差异表达,它们可能通过各自的靶基因间接调控相关的生物过程和信号通路,从而影响食管癌的发生和发展。
关键词: 食管癌 ；微小RNA ；靶基因 ；生物信息学分析
摘要： 目的:探讨hsa-miR-223对人食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响,研究hsa-miR-223影响食管癌细胞功能改变的作用机制方法:通过Real-time PCR和Western blot检测hsa-miR-223和ARTN在人食管癌细胞系中的表达;建立了稳定过表达成熟miR-223的人食管癌KYSE-150细胞系,通过细胞划痕实验和Boyden chamber检测细胞迁移和侵袭能力的改变;在此基础上,通过报告基因分析和Western blot探讨hsa-miR-223引起食管癌细胞生物学功能改变的作用机制。结果:Real-time PCR结果表明hsa-miR-223在高转移潜能的人食管癌细胞KYSE-150中呈低表达,而ARTN在KYSE-150中呈高表达;在人食管癌细胞KYSE-150中过表达hsa-miR-223后降低细胞的迁移和侵袭能力双荧光素酶报告基因分析表明成熟的miR-223能够作用于ARTN的3'UTR区降低荧光素酶的活性,Western blot进一步证实了hsa-miR-223能够抑制内源性ARTN的表达。结论:hsa-miR-223在高转移能力的食管癌细胞KYSE-150中呈低表达,具有类似抑癌基因的作用调控ARTN的表达,降低了食管癌细胞KYSE-150的迁移和侵袭能力,ARTN是miR-223的靶基因,有可能成为肿瘤生物治疗的一个靶点。
关键词: 食管癌 ；侵袭 ；迁移 ；ARTN
被引量
4
摘要： rim I基因编码的核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶(ribosomal-protein-alanine acetyltransferase,RimI)为结核分枝杆菌GCN5相关N-乙酰转移酶家族成员,其在结核分枝杆菌中的生物学功能尚不十分清楚。为探索RimI的生物学特性及其对结核分枝杆菌致病性的影响,本研究以耻垢分枝杆菌为模式菌,构建过表达结核分枝杆菌rimI基因的重组菌株Msm∷pMV261-rimI。分别培养Msm∷pMV261-rimI菌株和对照Msm∷pMV261菌株,分析两者生长速率、菌落形态和生物膜形成的差异,以及耐受低氧、低pH值、H 2O 2、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)和0.05%~1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)等逆环境的能力;并将两种菌株分别接种于鼠巨噬细胞RAW264.7,观察两者在巨噬细胞内的存活能力。结果表明,相较于对照菌株,过表达rimI的菌株在生长前中期速率降低,生物膜早期成膜变缓,但不影响生物膜的后期成熟。同时,过表达rimI的菌株抵抗低氧、低pH值、H 2O 2等逆环境的能力增强,在巨噬细胞内的存活能力增强。结果提示,rimI基因对分枝杆菌的生物膜形成、抗逆性及细胞内生存具有重要作用,可能与结核分枝杆菌的毒力密切相关。
关键词: 结核分枝杆菌 ；rimI基因 ；乙酰转移酶 ；抗逆性 ；毒力
被引量
1
摘要： S100家族蛋白是一组由25个成员组成的小分子钙结合蛋白,在多种肿瘤的发生、发展、转移和预后中具有重要作用。近年来,越来越多的研究揭示了S100家族蛋白在食管癌中的关键生物学功能及临床意义。本综述系统总结了部分S100家族成员(如S100A2、S100A4、S100A7、S100A8/A9、S100A14、S100A16和S100B)的表达特征、分子机制及其与食管癌不良预后的关联。这些蛋白通过调控多条信号通路(如PI3K/AKT、MAPK、NF-κB等)影响细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化,同时参与肿瘤微环境的重塑及免疫调控。S100A2和S100A4与食管癌的不良预后相关,S100A7通过上调M2巨噬细胞相关蛋白,促进M2巨噬细胞浸润和极化,通过增强p-Er K和p-FAK通路的激活来促进肿瘤血管生成。而S100A8/A9在食管癌中表达下调,可能通过调节细胞周期和分化、影响化疗耐药及免疫微环境等方式促进肿瘤进展;S100A14表达下调则与食管癌的发生、发展密切相关,可能通过作用于p53通路影响细胞侵袭过程,二者均为食管癌潜在的治疗靶点和预后指标。而S100A14的下调和S100A16的上调表达会促进食管癌细胞的增殖和侵袭,为探索其在肿瘤发生中的机制提供了新视角。然而,S100家族蛋白在食管癌中的具体作用机制及其与其他分子间的相互作用尚需深入研究。本综述为部分S100家族蛋白在食管癌中的研究提供了系统性总结,并提出了未来研究的关键方向,为精准医疗和改善食管癌患者预后提供了理论依据。
关键词: S100蛋白 ；肿瘤预后 ；食管癌 ；肿瘤微环境 ；生物标志物 ；治疗靶点 ；免疫微环境 ；细胞通路
【会议论文】 • 张娜
+5位作者
会议时间： 2021-10-21
摘要： 背景:白介素-33(interleukin-33, IL-33)生理情况下聚集在核内,但在炎症条件下可作为警报素释放到细胞外,发挥其生物学功能。星形胶质细胞是神经胶质细胞中最丰富的细胞类型,已有研究报道其组成性表达IL-33,探究星形胶质细胞能否主动释放IL-33,可为中枢神经系统疾病的治疗提供线索和潜在靶点。目的:探究星形胶质细胞能否主动释放IL-33及其机制和生物学意义。方法:本研究培养了小鼠原代星形胶质细胞,并用不同浓度的IFN-γ刺激,通过台盼蓝染色、ELISA、Western blot、免疫荧光等验证星形胶质细胞能否主动释放IL-33;通过IP实验验证释放到胞外的IL-33是否存在蛋白翻译后修饰;使用组蛋白乙酰转移酶抑制剂MG149探究星形胶质细胞主动释放IL-33是否与乙酰化修饰相关;使用IL-33抗体中和IFN-γ刺激星形胶质细胞主动释放的IL-33,探究内源性释放的IL-33的生物学功能。结果:100 ng/mL IFN-γ刺激星形胶质细胞中的IL-33由胞核向胞浆转位并进一步释放到胞外,同时台盼蓝活细胞拒染发现,IFN-γ刺激不会导致星形胶质细胞死亡;IP实验发现释放到上清中的IL-33存在乙酰化修饰;MG149可以抑制IFN-γ刺激的星形胶质细胞主动释放IL-33;IFN-γ可诱导星形胶质细胞活化及向A1型和A2型反应性星形胶质细胞极化,加入IL-33抗体不影响IFN-γ诱导的星形胶质细胞活化及向A1型反应性星形胶质细胞极化,但减少其向A2型反应性星形胶质细胞极化。结论:IFN-γ刺激星形胶质细胞主动释放IL-33并与乙酰化相关,内源性释放的IL-33促进IFN-γ诱导的反应性星形胶质细胞向A2型极化。
关键词: IL-33 ；星形胶质细胞 ；IFN-γ ；乙酰化
会议时间： 2019-08-03
摘要： 深入了解烟曲霉的毒力因子是有效治疗烟曲霉感染的关键。已有证据显示组蛋白乙酰化修饰与动植物病原菌的毒力密切相关,但不同物种间乙酰化修饰的底物蛋白与调控机制差异较大。目前对于人类重要条件致病真菌烟曲霉中组蛋白乙酰化修饰的功能还知之甚少。本研究运用信息学分析预测出烟曲霉中存在13个编码组蛋白乙酰转移酶的基因,通过大蜡螟模型毒力筛选,发现组蛋白乙酰转移酶Elp3的缺失导致烟曲霉毒力显著降低。通过体内乙酰化检测证实烟曲霉Elp3具有乙酰转移酶活性,能够催化修饰组蛋白H3第14位赖氨酸。荧光定位显示,Elp3蛋白主要定位于细胞质中,并在细胞核中也有少量分布。elp3敲除菌株对过氧化氢和甲萘醌的耐受性显著高于野生型菌株。进一步研究显示Δelp3菌株中ROS含量相较于野生型明显减少,qRT-PCR结果显示过氧化氢编码基因cat2和超氧化物歧化酶编码基因sod1的表达量上升。有趣的是,我们发现Elp3通过调控生物膜合成通路相关基因uge3和adg3的表达进而影响生物膜的合成,并且其功能的发挥依赖于组蛋白乙酰转移酶结构域(HAT domain)。后续实验将进一步通过位点突变、小鼠毒力模型,研究烟曲霉组蛋白乙酰转移酶Elp3的生物学功能。并结合RNA-seq、ChIP-qPCR、乙酰化蛋白质组学等手段,探究Elp3的转录调控途径和靶点蛋白,进而从基因转录和蛋白翻译后修饰两个层面解析具体分子机制和调控网络,最终系统地阐明组蛋白乙酰转移酶Elp3与烟曲霉毒力的关系,为深入认识组蛋白乙酰化修饰调控烟曲霉乃至病原真菌毒力的作用机制奠定理论基础。
关键词: 丝状真菌 ；烟曲霉 ；功能基因 ；组蛋白乙酰转移酶
被引量
1
会议名称： 华东六省一市生物化学与分子生物学会2015年学术交流会
会议时间： 2015-12-05
摘要： 高等真菌可作为丰富的天然产物以及具有生物活性的新化合物的来源而受到极大的关注.灵芝,是中医药学宝库中的珍品,现代医学研究发现灵芝中的灵芝酸具有抗肿瘤和抗艾滋病毒等重要生物学功能,灵芝酸含量的高低作为评价灵芝等级的标准.灵芝酸作为灵芝的次级代谢物,目前对它的生物合成途径和调控过程还知之甚少.在丝状真菌中,许多次级代谢物的合成受到表观遗传调控.DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰是主要的表观遗传调节方式,其中,组蛋白乙酰化主要发生在组蛋白H3和H4的N-端尾部比较保守的赖氨酸残基上,主要依靠组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)维持乙酰化的平衡.HDACs在灵芝的细胞生长、分化及次级代谢过程中可能扮演着重要的角色.本研究使用伏立诺他(SAHA)作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂,在培养基中添加0-250μm/L的SAHA,经过静置培养,考察了组蛋白去乙酰化修饰对灵芝细胞的生长、菌丝形态、孢子的生成和灵芝酸合成的影响.随着抑制剂浓度的增加,上层灵芝细胞生长速度减慢,且灵芝的菌丝体发生断裂现象.在50μm/LSAHA条件下培养12天,表层灵芝菌丝层呈白色,灵芝酸的产量受到明显抑制.
关键词: 灵芝 ；灵芝酸 ；生长代谢 ；组蛋白乙酰化
会议时间： 2011-08-09
摘要： 一氧化氮(nitric oxide,N0)作为内皮源性血管舒张因子,对多种血管具有舒张作用,从而发挥重要的生物学功能,N0由神经型一氧化氮合酶(neurona1 nitric oxidesynthase,nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)催化左旋精氨酸产生。非对称性二甲基精氨酸(asymmetrical dimethylarginine,ADMA)是三种NOS的共同内源性抑制剂,它能够竞争性抑制NOS活性进而降低N0生物效应,在体内它主要是由二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)降解,DDAH有两种类型,DDAH1和DDAH2。ADMA/DDAH系统异常可通过NOS及NO引发多种心血管疾病。蛋白质乙酰化在多种基因表达调控中发挥重要作用,HAT可通过将乙酰辅酶A的乙酰基团转移至蛋白质特定赖氨酸残基而引起蛋白质乙酰化,p300是一种具有HAT活性的转录辅激活因子,可乙酰化组蛋白以及多种转录因子,调节基因表达。本研究拟探索乙酰转移酶p300对DDAH2基因表达影响,从而推断乙酰化在ADMA/DDAH系统中的调控作用。我们通过酶切方法鉴定了野生型及HAT结构域缺失的突变型p300表达载体,用脂质体转染的方法将两种载体转入HEK293细胞,Western Blot方法检测细胞中DDAH2蛋白质表达水平的变化。最终,转染野生型p300表达载体后,HEK 293细胞中DDAH2蛋白质的表达水平明显升高,而转染HAT结构域缺失的突变型p300表达载体后的DDAH2蛋白质表达水平无明显变化,提示p300可通过其乙酰转移酶的功能上调DDAH2蛋白的表达,这可能是乙酰化调节DDAH2基因表达的一种机制。
关键词: NOS ；ADMA ；DDAH2 ；乙酰化 ；p300
会议时间： 2014-08-13
摘要： 目的探讨外泌体穿梭miR-21对食管癌细胞生物学功能的影响及其与食管癌发病风险的关系。方法 DiI染料荧光标记食管癌细胞株EC9706培养上清来源的外泌体,应用活细胞实时成像技术追踪观察外泌体的运动;应用荧光标记的miR-21 mimic转染EC9706,通过流式细胞术检测miR-21 mimic在供受体细胞间的转移效率,qRT-PCR技术检测受体细胞中miR-21的表达水平;将不同浓度GW4869与EC9706共培养,qRT-PCR检测GW4869对外泌体miR-21生成的影响;通过建立稳定的供受体细胞培养模型,应用EDU染色法、流式细胞技术、Transwell细胞体外迁移和侵袭试验来观察供受体细胞间非接触性细胞交流对受体细胞生物学功能的影响;应用生物信息学技术预测与上述生物学功能相关的miR-21靶基因,采用Western Blot技术分析预测靶基因的蛋白水平。最后,通过检测67对食管癌病人和健康对照血浆miR-21的表达水平,利用logistic回归分析血浆miR-21表达水平与食管癌发病风险的关系。结果活细胞实时成像技术显示胞外的外泌体可以通过细胞膜进入到活细胞内;外泌体穿梭miR-21在细胞间传递特征分析显示外泌体来源的miR-21可以被转移进入受体细胞,在3h、6h、24h时转移效率分别为85.3%、82.6%和85.0%,各时间点转染组miR-21在受体细胞中平均倍数变化分别为1.49,1.41,2.08;GW4869与EC9706共培养实验显示细胞外miR-21的表达水平与外泌体的分泌抑制作用密切相关。供受体细胞共培养实验表明外泌体穿梭miR-21可以促进食管癌细胞的增殖、抑制其凋亡,增加其体外迁移和侵袭能力;Western Blot结果显示过表达miR-21后受体细胞中PDCD4表达较对照组降低了86.4%,提示PDCD4可能是miR-21参与食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学行为调控的靶标之一。人群流行病学研究显示miR-21在病例组血浆中的表达水平较对照组高2.96倍,条件logistic回归分析表明miR-21表达上调可增加食管癌的发病风险。结论胞外外泌体可通过细胞膜进入细胞内,并能够作为miR-21的载体实现细胞间转运,从而参与食管癌的发生发展,提示血浆miR-21可能成为食管癌高危人群筛检和诊断的候选生物标志。
关键词: 食管癌 ；外泌体 ；miR-21 ；生物标志
被引量
3
摘要： 研究背景 人脂肪间充质干细胞(Human adipose-derived mesenchymal stem cells,hAD-MSCs)和人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)作为骨组织工程的替代性干细胞来源,因具有高可用性和易用性的特点,近年来受到越来越多的关注。目前,对hAD-MSCs和hUC-MSCs潜在表观遗传学机制的研究有限,极大地阻碍了它们在骨修复中的临床应用。 研究发现组蛋白乙酰化在调节间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中起着重要作用。组蛋白乙酰化水平的升高往往与成骨分化的增强有关,但它们在MSCs成骨分化中的特异性作用仍不清楚。H3K18乙酰化(H3K18acetylation,H3K18ac)是一种常见的组蛋白修饰,参与多种重要的细胞生物学过程。研究报道p300作为一种具有组蛋白乙酰化转移酶活性的转录共激活因子,激活H3K18乙酰化,使得胚胎干细胞向中胚层分化。而SIRT7作为H3K18乙酰化的特异性组蛋白去乙酰化酶,通过使H3K18去乙酰化,抑制核糖体蛋白相关基因的转录,从而防止造血干细胞的衰老。在本研究的第一部分内容中,我们旨在探究p300和SIRT7介导的H3K18乙酰化在hAD-MSCs成骨分化中的生物学作用和相关的表观遗传学机制。由于难以从医院获取高质量脂肪样本,后续研究采用hUC-MSCs进行。 传统的二维(2D)单层培养虽然操作简单,但不能准确模拟体内微环境,并且MSCs移植后存活率低,限制了其在骨组织工程中的应用。细胞球培养更接近体内微环境,有利于增强MSCs移植存活率。MSCs细胞球是骨组织工程构建的重要原料,与二维培养相比,其干性更强,诱导分化效果更优。并且与2D成骨诱导培养相比,移植成骨诱导后的MSCs细胞球治疗骨缺损的效果更强。但长时间的体外成骨诱导耗时费力、长期培养费用昂贵、延长了整体治疗周期。在本研究的第二部分内容中,我们通过细胞实验探究hUC-MSCs细胞球的干性维持和促成骨自发分化效果。更重要的是,我们通过体外构建的hUC-MSCs细胞球,仅经过短时间的正常培养即进行骨缺损移植,验证其在体内促进骨再生的效果。并且进一步探究hUC-MSCs细胞球通过p300和SIRT7介导的H3K18乙酰化调控成骨自发分化的潜在表观遗传学机制。 MSCs细胞球中细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用产生的机械信号,都将传递到细胞骨架纤维,随后细胞骨架纤维产生内部机械转导途径,并将力转导至细胞核骨架蛋白,最终以分子信号的形式传递到染色质,从而影响MSCs的生物学特性。Lamin A/C作为一种与染色质结构重塑密切相关的核骨架蛋白,可将细胞球内部的机械信号从细胞骨架传导至染色质,从而调控细胞核内的基因表达。在本研究的第三部分内容中,我们旨在探究Lamin A/C通过H3K18乙酰化调控hUC-MSCs细胞球成骨自发分化的表观遗传学机制。该研究对于探索培养维度通过细胞骨架-核骨架直接调控MSCs的基因表达具有重要启示,并且为进一步优化骨组织工程提供参考。 第一部分p300激活的H3K18乙酰化促进人脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化 目的: 探讨H3K18乙酰化在hAD-MSCs成骨分化中的生物学作用和相关的表观遗传学机制。 方法: 1.hAD-MSCs成骨分化的转录组学分析和乙酰化蛋白质组学测序: (1)生物信息学分析公共数据库中关于hAD-MSCs诱导成骨的转录组学数据:在生长培养基(Growth medium,GM)和成骨诱导(Osteogenic medium,OM)组之间进行差异表达分析,筛选出与hAD-MSCs成骨分化相关的生物学功能。 (2)收集成骨诱导后的hAD-MSCs进行乙酰化蛋白质组学测序,鉴定与组蛋白乙酰化相关的位点。 2.H3K18乙酰化和与其相关的乙酰转移酶p300、去乙酰化酶SIRT7对成骨分化的调控作用: (1)筛选调控成骨分化的H3组蛋白乙酰化位点:Western blot验证乙酰化蛋白质组学测序鉴定出的H3组蛋白乙酰化位点。为了评估H3组蛋白乙酰化位点与成骨分化的调控关系,我们通过染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)-qPCR检测H3K18ac、H3K9ac和H3K14ac在成骨相关基因启动子区的富集程度。 (2)p300和SIRT7与hAD-MSCs成骨分化的调控关系:Western blot检测与p300和SIRT7的蛋白水平,酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测p300和SIRT7的酶催化活性。生物信息学分析公共数据库中h MSCs诱导成骨的数据,评估GM和OM组之间p300和SIRT7的表达,并且在小鼠骨折数据集中分析不同时间点p300和SIRT7的m RNA水平。 3.p300在hAD-MSCs成骨分化中的调控作用:p300抑制剂A-485处理成骨诱导的hAD-MSCs,ELISA检测p300的酶活性,筛选出抑制成骨分化的最佳浓度。在A-485处理后,通过碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红S(ARS)染色观察细胞外的ALP活性和矿化结节的形成,通过定量比色法检测细胞内的ALP活性和钙含量。 4.p300介导的H3K18乙酰化在hAD-MSCs成骨分化中的调控作用:实验分为GM、OM、OM+A-485三个组,RT-qPCR和Western blot检测成骨指标的表达。Western blot和免疫荧光检测各组H3K18乙酰化水平,ChIP-qPCR检测各组H3K18乙酰化在成骨相关基因启动子区的富集丰度。 5.SIRT7对hAD-MSCs成骨分化和H3K18乙酰化的调控作用: (1)SIRT7的抑制剂97491:实验分为GM、OM、OM+97491(5μM)三个组,通过ARS染色和细胞内的ALP活性检测评估成骨的功能表型,Western blot检测H3K18乙酰化和成骨指标的蛋白水平。 (2)在成骨诱导条件下,慢病毒过表达SIRT7:ARS染色评估细胞外矿化沉积,Western blot检测H3K18乙酰化和成骨指标的蛋白水平。 结果: 1.hAD-MSCs成骨分化升高组蛋白乙酰化水平:转录组学的生信分析结果提示,hAD-MSCs成骨诱导可能会激活乙酰化状态。乙酰化蛋白质组学测序鉴定出与hAD-MSCs成骨分化相关的多个常见的H3组蛋白乙酰化位点,包括H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K36ac、H3K56ac。 2.p300激活的H3K18乙酰化促进成骨基因转录: (1)H3K18乙酰化激活成骨基因转录:hAD-MSCs成骨分化显著上调H3K18乙酰化水平。更重要的是,成骨诱导显著升高H3K18ac在OSX、BMP2、COL1A1和OPN基因启动子区的富集丰度,但H3K9ac和H3K14ac未在成骨相关基因启动子区富集。 (2)p300和SIRT7与hAD-MSCs成骨分化的调控关系:与GM组相比,OM组中p300的蛋白水平和酶活性升高,而SIRT7的蛋白水平和酶活性下降。生物信息学分析结果说明p300在h MSCs成骨分化后明显上调,在小鼠骨折后的愈合阶段表达逐渐升高,而SIRT7的表达无明显变化。 3.抑制p300活性可抑制hAD-MSCs成骨分化:3μM A-485显著降低p300的酶活性,并且显著抑制细胞内外的ALP活性和钙结节的形成。 4.p300抑制剂A-485抑制H3K18的乙酰化,从而抑制hAD-MSCs成骨分化:A-485能降低成骨相关基因的表达,显著抑制H3K18乙酰化水平,并且降低H3K18ac在成骨相关基因启动子区的富集丰度。 5.SIRT7未抑制hAD-MSCs成骨分化,与H3K18乙酰化的调控无关: (1)SIRT7的抑制剂97491与hAD-MSCs成骨分化:97491不影响ALP活性,不能增强细胞外矿化沉积、成骨指标的表达和H3K18乙酰化水平。 (2)慢病毒过表达SIRT7与hAD-MSCs成骨分化:过表达SIRT7不影响细胞外矿化沉积、成骨指标的表达和H3K18乙酰化水平。 结论: 我们的研究表明,p300通过促进H3K18乙酰化富集到成骨相关基因启动子区,增强成骨基因的转录,从而促进hAD-MSCs的成骨分化。H3K18乙酰化对hAD-MSCs成骨分化的调控作用与SIRT7无关。这为揭示hAD-MSCs成骨分化的作用机制并促进其在骨组织工程中的应用提供新的见解。 第二部分人脐带间充质干细胞球上调H3K18乙酰化促进成骨自发分化 目的: 探讨hUC-MSCs细胞球通过H3K18乙酰化促进成骨自发分化的效果和相关的表观遗传学机制。 方法: 1.不同培养维度对hUC-MSCs生物学特性的影响: (1)RT-qPCR和Western blot检测二维与细胞球在生长培养基条件下hUCMSCs的干性指标以及成骨、成软骨和成脂分化指标的表达水平。 (2)hUC-MSCs在二维生长培养基(2D-GM)、二维成骨诱导培养基(2DOM)、细胞球生长培养基(Spheroid-GM)、细胞球成骨诱导培养基(Spheroid-OM)中培养14-21天,通过ARS染色、细胞内的ALP活性和钙含量检测评估成骨的功能表型。RT-qPCR和Western blot检测各组hUC-MSCs中成骨指标的表达。 2.hUC-MSCs细胞球成骨自发分化的应用价值评估:为了在体内比较hUCMSCs细胞球的成骨自发分化能力与化学试剂诱导成骨的效果,我们构建了SD大鼠颅骨临界骨缺损模型,并且设置了空白、Gel MA材料、2D-GM、2D-OM、Spheroid-GM、Spheroid-OM六个组。将各组hUC-MSCs移植于缺损部位治疗6周和12周时拍摄活体micro-CT,并对扫描图像进行骨定量分析。于12周取材进行HE和Masson染色的骨组织学实验。 3.hUC-MSCs转录组学测序:对2D-GM(n=6)和Spheroid-GM(n=6)组的hUC-MSCs进行RNA-Seq,进行差异表达分析后,在转录组学水平筛选出与hUC-MSCs细胞球成骨自发分化相关的生物学功能。 4.4D Fast DIA乙酰化定量组学测序:对2D-GM、Spheroid-GM组的hUCMSCs进行乙酰化定量蛋白质组学测序。通过定量分析筛选差异修饰蛋白,对上调的修饰蛋白进行功能注释,在乙酰化蛋白质组学水平筛选出与hUC-MSCs细胞球成骨自发分化相关的生物学功能。 5.hUC-MSCs细胞球中H3K18乙酰化水平:Western blot验证乙酰化定量蛋白质组学测序筛选出的差异性H3组蛋白乙酰化位点。为了评估H3K18乙酰化对hUC-MSCs细胞球的调控作用,我们通过ChIP-qPCR检测H3K18ac在成骨相关基因启动子区的富集程度。 6.p300在不同培养维度中对H3K18乙酰化和hUC-MSCs成骨自发分化的调控作用: (1)将hUC-MSCs正常培养在二维与细胞球条件下,Western blot检测与H3K18乙酰化相关的乙酰转移酶p300的蛋白水平,ELISA法检测p300的酶催化活性。 (2)p300的抑制剂A-485(3μM)处理生长培养基中不同培养维度的hUCMSCs:ELISA检测p300的酶活性以验证A-485处理不同培养维度下hUC-MSCs的有效性。Western blot或RT-qPCR检测H3K18乙酰化水平和成骨指标的表达。 7.SIRT7在不同培养维度中对H3K18乙酰化和hUC-MSCs成骨自发分化的调控作用: (1)将hUC-MSCs正常培养在二维与细胞球条件下,Western blot检测与H3K18乙酰化相关的去乙酰化酶SIRT7的蛋白水平,ELISA法检测SIRT7的酶催化活性。
关键词: H3K18乙酰化 ；人脂肪间充质干细胞 ；成骨分化 ；p300 ；H3K18乙酰化 ；人脐带间充质干细胞 ；细胞球 ；成骨自发分化 ；Lamin A/C ；人脐带间充质干细胞 ；细胞球 ；H3K18乙酰化 ；成骨自发分化
摘要： 活性氧（ROS）作为信号分子,能够调控植物的生长、向地性反应以及应对环境刺激等。乙酰化修饰是细胞中主要的蛋白质翻译后修饰,参与细胞的新陈代谢、生物和非生物胁迫以及器官的形态建成等过程。已有研究表明在植物应对环境胁迫和生长发育过程中产生的ROS可以抑制去乙酰化酶（HDACs）的活性,从而改变蛋白质的乙酰化修饰状态。冠根作为水稻根系的主要组成成分,其发育过程中产生的ROS是否会影响冠根发育相关蛋白质的乙酰化修饰仍不清楚。本研究以水稻冠根发育特异转录因子WOX11为研究对象,探究其在ROS调控以及乙酰化修饰中的生物学功能。主要研究进展如下:
1.对wox11突变体和野生型（WT）根尖蛋白组和转录组进行联合分析,发现wox11根尖中参与ROS代谢的过氧化物酶（PRXs）基因的转录和蛋白水平显著下降,并对wox11突变体根尖ROS水平检测发现其ROS水平显著下降,随后选取含有WOX11结合位点且在wox11突变体中蛋白水平变化最为显著的PRX111利用EMSA、转录激活、Ch IP-q PCR和突变体构建等实验证明WOX11通过直接激活PRX111的表达进而调控水稻冠根中ROS的水平;
2.基于质谱对WT、wox11、WT-KI（利用ROS清除剂KI处理后的WT,模拟wox11中ROS水平）和wox11-H2O2（利用H2O2处理后的wox11,模拟WT中ROS水平）的根尖进行定量蛋白质乙酰化组分析,发现wox11突变体根尖中参与代谢的蛋白质乙酰化修饰水平降低。当体外施加H2O2,wox11突变体根尖ROS水平恢复的同时,根尖中蛋白乙酰化修饰水平也提高至WT水平;当用KI处理WT后,根尖低的ROS水平也导致根尖蛋白乙酰化修饰水平显著下调,与wox11根尖中的乙酰化修饰水平相近。以上结果表明水稻根尖中ROS可以正向调控蛋白质的乙酰化修饰;
3.对ROS处理前后的WT和wox11突变体蛋白质组学数据分析发现,乙酰转移酶、HDACs以及调节乙酰辅酶A生成的代谢酶的蛋白质水平无明显变化,AMS迁移实验和HDACs酶活测定实验揭示了水稻冠根中的ROS调控了HDACs的氧化还原状态,从而改变了其生物活性,表明WOX11通过ROS介导HDACs活性的变化影响水稻根尖蛋白的乙酰化水平;
4.通过分析水稻根尖蛋白组数据、表达谱和hda705突变体表型发现HDA705参与水稻冠根发育调控。AMS和BIAM标记等实验验证了HDA705蛋白能够被氧化修饰并形成同源多聚体,且其氧化修饰不影响其亚细胞定位,推测可能通过影响其酶活性从而影响其功能;
5.对ROS处理前后的WT和wox11突变体根尖定量乙酰化组分析发现,wox11突变体根尖蛋白质的上调表达与核糖体蛋白乙酰化下降密切相关。进一步分析wox11和wox11-H2O2的定量乙酰化组发现,wox11突变体根尖中核糖体蛋白的乙酰化水平下降促进了蛋白质的翻译,从而导致蛋白质水平的显著增加。最后对根尖样品进行多聚核糖体图谱分析和总蛋白含量的测定发现,核糖体蛋白的低乙酰化可以促进wox11突变体中核糖体80S和多聚核糖体的水平,进而促进了翻译,最终导致根尖蛋白质含量的增加,进一步验证了WOX11通过影响核糖体蛋白质的乙酰化水平调控水稻根尖蛋白翻译。
综上所述,本研究解析了水稻冠根发育关键调控因子WOX11介导的ROS信号对蛋白质乙酰化修饰的调控机制,同时揭示了WOX11通过乙酰化修饰调控翻译信号,进而调控冠根发育的分子机制,进一步深化了我们对水稻冠根发育调控网络的认识,为水稻分子育种改良提供夯实的理论依据。
关键词: 水稻(Oryza sativa L.) ；蛋白质乙酰化 ；活性氧 ；WOX11 ；蛋白组学 ；冠根
摘要： 研究背景
乳腺癌是全球性的公共卫生难题,是女性最常见的恶性肿瘤和癌症死亡的主要原因之一。乳腺癌治疗周期长且因癌症异质性导致部分患者治疗失败,其中以三阴性乳腺癌的恶性侵袭性程度最高。所以当前预防、早期检测诊断和寻找有效的靶向治疗分子对于乳腺癌的治疗至关重要。当前mRNA的转录后修饰被证实显著影响癌症的进程,研究表明N-乙酰转移酶10(NAT10)是目前已知的被证实能催化mRNA发生乙酰化修饰的酶,且NAT10在癌症中高表达并促进癌症发生和进展。目前虽有文献报道NAT10高表达增强乳腺癌耐药性,但暂时还未深入研究NAT10促进乳腺癌细胞增殖和迁移的相关分子机制。所以本课题开展对NAT10在乳腺癌细胞增殖和迁移中的作用及初步机制的研究。
研究目的
探讨NAT10影响乳腺癌细胞生物学功能(增殖和迁移)的初步作用机制。研究方法
1.通过生物信息学方法和在线数据库(TCGA数据库、c Bio Portal for Cancer Genomics数据库、TIMER网站、DNMIVD数据库、MEXPRESS数据库、UALCAN数据库)分析NAT10在乳腺癌中的表达水平和预后相关性、拷贝数变异类型是否影响基因表达、NAT10启动子区域甲基化水平变化情况以及免疫细胞浸润情况。
2.选取三株不同乳腺癌亚型的细胞作为实验对象(MDA-MB-231,HR-HER2-;AU565,HR-HER2+;MCF-7,HR+HER2-)。通过si RNA和慢病毒构建稳转株的方法敲低NAT10在乳腺癌细胞MDA-MB-231、AU565和MCF-7中的表达水平。利用CCK8实验、克隆形成实验、Transwell小室实验以及凋亡试剂盒检测其表达水平的变化对癌细胞的增殖活力、迁移能力以及细胞凋亡水平的影响。
3.利用NAT10抑制剂Remodelin按浓度梯度处理乳腺癌细胞,检测三株细胞的IC50值。选取20μM浓度处理三株乳腺癌细胞,利用CCK8实验、克隆形成实验、Transwell小室实验比较处理组和对照组在细胞增殖和迁移能力方面的差异。
4.提取MDA-MB-231细胞转染si RNA 48h后的细胞总RNA,送公司做RNA-seq测序。筛选处理组和对照组的差异基因数,通过富集分析富集下游信号通路Kras-down通路,利用q-PCR验证通路差异基因的mRNA水平。
研究结果
1.NAT10在乳腺癌肿瘤中高表达,且提示预后不良。
(1)利用TCGA数据库、UALCAN数据库的临床数据分析表明NAT10在乳腺癌中的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于癌旁组织,而且提示恶性程度越高的亚型乳腺癌组织中该基因表达水平越高。
(2)将TCGA数据按临床分级排列后显示临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期样本中的NAT10表达水平显著高于对照组,且高表达组提示患者预后不良。
(3)通过c Bio Portal数据库分析提示拷贝数变异Amplification(扩增)突变可能上调NAT10 mRNA表达水平。
(4)通过TIMER数据库分析得出乳腺癌中NAT10基因表达与细胞免疫浸润呈正相关,且提示基因拷贝数突变影响不同免疫细胞的浸润水平。
(5)通过DNMIVD数据库分析得出乳腺癌中NAT10基因的高表达伴随着启动子区域甲基化水平下调,MEXPRESS数据库则展示出了具体的甲基化位点。
2.敲低NAT10表达可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7、AU565的增殖活力,尤其抑制了乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移能力。
3.抑制剂Remodelin对乳腺癌细胞MDA-MB-231和AU565细胞的增殖和迁移能力有显著的抑制作用。
4.RNA-seq测序结果通过对对照组和靶点组的差异表达基因进行通路富集分析,富集到Kras-down通路并通过q-PCR技术在mRNA水平进行验证。
结论:
1.NAT10在乳腺癌中表达上调且与预后呈负相关;
2.敲减NAT10或者抑制NAT10表达显著抑制乳腺癌细胞的增殖活力和迁移能力;
3.敲减NAT10可能通过Kras-down通路从而抑制乳腺癌细胞的增殖活力和迁移能力。
关键词: 乳腺癌 ；乙酰化转移酶NAT10 ；乙酰化修饰(ac4C) ；mRNA修饰 ；增殖 ；迁移
摘要： 研究背景:结核病（tuberculosis,TB）是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）引起的呼吸道传染病,严重危害人类健康。巨噬细胞是人体抗感染免疫系统的主要功能细胞,可通过自噬、活性氧、炎性小体等多种途径杀灭并清除外来病原体。现有的研究结果表明,自噬作为巨噬细胞防御及清除结核分枝杆菌的重要机制之一,与结核病的发生发展密切相关,但相关的调控机制截至目前却仍未阐明。N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine,ac4C）是一种广泛存在于真核及原核生物中的保守化学修饰类型,由N-乙酰转移酶10（N-acetyltransferase 10,NAT10）催化合成,调节mRNA的稳定性及翻译效率,进而实现特定的生物学功能。近年已有研究报道NAT10可通过催化mRNA发生ac4C乙酰化修饰参与多种疾病的发生发展过程,但有关NAT10及ac4C修饰在结核病中的作用及相关机制仍未明确,深入研究ac4C乙酰化修饰机制在结核病中的作用或将为研发新型治疗策略提供科学依据。研究目的:探讨乙酰基转移酶NAT10在巨噬细胞感染结核分枝杆菌后的表达规律和其在巨噬细胞抗结核免疫中的作用及分子机制。研究方法:1、采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、Western blot和斑点印迹法（Dot-blot）检测肺结核患者和健康人外周血单个核细胞（PBMC）中NAT10的表达情况及ac4C修饰水平。2、以不同感染复数（MOI=1、5、10）的结核分枝杆菌H37Ra感染THP-1来源巨噬细胞24h和以MOI=10的H37Ra感染THP-1来源巨噬细胞后不同时长,分别采用RT-qPCR和Western blot检测NAT10的表达情况。3、使用干扰和过表达NAT10的慢病毒转染THP-1构建稳转细胞株,经RT-qPCR、Western blot和Dot-blot鉴定转染成功后,将H37Ra以MOI=10感染干扰和过表达稳转株,在感染后24h收集样本,采用Western blot和免疫荧光检测NAT10表达情况及自噬水平。4、将菌H37Ra以MOI=10感染用NAT10抑制剂Remodelin预处理过的THP-1来源巨噬细胞,在感染后不同时间点（4h、12h、24h）收集样本,观察细胞自噬水平的变化。5、将H37Ra以MOI=10感染THP-1稳转株,在感染后不同时间点（4h、24h、48h）收集细胞裂解液,采用固体培养法检测胞内菌的存活率。6、通过生信分析筛选出ac4C修饰调控潜在靶基因Bcl-2,采用acRIP-qPCR技术检测NAT10对Bcl-2 mRNA的ac4C修饰作用;采用RNA稳定性实验检测NAT10对Bcl-2 mRNA稳定性的影响;采用RT-qPCR和Western blot检测NAT10对Bcl-2表达的影响。研究结果:1、肺结核患者PBMC中NAT10在mRNA、蛋白水平及ac4C修饰水平上均健康对照组显著下调。2、H37Ra以MOI=10感染THP-1来源巨噬细胞24h时,NAT10在mRNA及蛋白水平上均较未感染组显著下调。3、干扰NAT10可下调巨噬细胞转录组ac4C修饰水平,过表达NAT10可上调巨噬细胞转录组ac4C修饰水平;且干扰NAT10可促进巨噬细胞感染结核分枝杆菌后发生自噬,过表达NAT10可抑制巨噬细胞感染结核分枝杆菌后发生自噬。4、NAT10抑制剂Remodelin可显著诱导巨噬细胞感染结核分枝杆菌后自噬水平上调。5、干扰NAT10可增强巨噬细胞对胞内结核分枝杆菌的清除,过表达NAT10可抑制巨噬细胞对胞内结核分枝杆菌的清除。6、干扰NAT10可下调Bcl-2 mRNA的ac4C修饰水平,降低Bcl-2 mRNA的稳定性,减少Bcl-2蛋白的生成,诱导巨噬细胞自噬。研究结论:结核分枝杆菌感染可下调巨噬细胞中NAT10的表达,进而下调其靶基因Bcl-2 mRNA的ac4C修饰水平,降低Bcl-2 mRNA的稳定性,进而诱导巨噬细胞自噬及杀菌。
关键词: 结核分枝杆菌 ；N4-乙酰胞苷 ；N-乙酰转移酶10 ；巨噬细胞 ；自噬
摘要： 研究背景与目的:食管癌（Esophageal cancer,EC）是常见的消化道恶性肿瘤,具有高发病率高死亡率的特点。食管癌的发生多因素长时间共同作用的结果,其影响因素包括环境因素、饮食习惯和遗传因素等。近来越来越多的研究发现:人体微生物菌群在食管癌的发生、发展中起着重要的作用。食管由于其所处的特殊构造,通过口腔与外界环境相连,据估计每天约有1011个细菌从口腔经过食管到达胃部,口腔致病菌可能通过饮食、饮水等方式从口腔迁移至食管,并在此定植繁殖,从而造成食管菌群失调,进而促进肿瘤发展进程。因此本研究基于Pac Bio SMRT第三代测序技术评估食管癌特异性口腔微生物谱和组织微生物谱,寻找可能在食管癌发生发展过程中起重要作用的差异微生物,探讨差异微生物毒力因子对食管癌细胞生物学功能的影响并识别其影响食管癌细胞糖酵解可能的机制。为进一步提示口腔食管微生物群与食管癌发生发展之间的关联,寻找食管癌诊断和治疗的新靶点提供合理的参考和研究支持。研究方法:1.收集2020年7月-2020年12月江苏省淮安市第一人民医院招募的首次诊断为食管癌的新发病例38例,同时招募38例性别、年龄相匹配的健康人为对照组。采用标准化的方法留取食管癌患者的癌组织、癌旁组织样本和所有研究对象的唾液样本。应用DNA提取试剂盒提取微生物DNA,随机选取其中5组食管癌患者唾液、癌组织、癌旁组织和匹配的健康人唾液的微生物DNA进行第三代测序PACBIO SMRT技术进行全长16S r RNA测序后,基于测序结果识别食管癌特异性口腔微生物谱和组织微生物谱,分析病例组和健康组间差异菌群,利用PICRUSt软件进行功能预测,通过LEf Se评分选取代表性的种水平生物标志物。2.基于测序结果选取代表性的差异菌种牙周梭杆菌,序列分析筛选出其毒力因子BCT,应用Q-PCR在33对食管癌组织和癌旁组织中验证牙周梭杆菌毒力因子BCT丰度的差异。3.基于原核表达系统纯化牙周梭杆菌重组毒力蛋白BCT。通过CCK8实验,观察牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞增殖的影响,通过Transwell实验观察牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞侵袭和迁移能力的影响。4.基于细胞代谢组学利用高分辨串联质谱系统鉴定重组毒力蛋白BCT对食管癌细胞代谢的影响,运用偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）对代谢组学数据进行代谢轮廓分析,鉴定差异代谢物,并对其进行通路分析,探讨BCT在食管癌发生发展过程中可能作用机制。5.利用Elisa等实验观察牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞葡萄糖摄取、丙酮酸蓄积、乳酸释放水平及LDH活性的影响。利用DCFH-DA荧光探针,观察牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞内ROS水平的影响。6.通过Western Blot实验检测TLR4/PI3K-AKT/HIF-1α轴中关键蛋白的表达情况,并分别使用TLR4特异性通路抑制剂TAK242、PI3K-AKT特异性通路抑制剂LY294002和HIF-1α特异性通路抑制剂2-ME处理食管癌细胞后,比较食管癌细胞侵袭和迁移能力的变化。7.利用Elisa等实验比较在有无TLR4特异性通路抑制剂TAK242、PI3K-AKT特异性通路抑制剂LY294002和HIF-1α特异性通路抑制剂2-ME处理的情况下,牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞葡萄糖摄取、丙酮酸蓄积、乳酸释放水平及LDH活性的变化。通过Western Blot实验分别比较在有无上述三种抑制剂处理下糖酵解关键蛋白Glut1蛋白,HK2蛋白和LDHA蛋白表达水平的差异。8.通过Western Blot实验比较在有无TLR4特异性通路抑制剂TAK242、PI3K-AKT特异性通路抑制剂LY294002和HIF-1α特异性通路抑制剂2-ME处理的情况下EMT通路中关键蛋白E-cadherin蛋白,N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达水平的差异。研究结果一、食管癌患者组织微生物谱及唾液微生物谱的识别1.共获得OTU代表序列4682个,其中食管癌组口腔、健康对照口腔、癌组织、癌旁组织菌群特有OUT分别为991,1388,571和481。样本的稀释曲线趋于平坦,表明样品测序结果有代表性的,测序深度基本覆盖。2.α多样性分析发现,与健康对照人群相比,食管癌患者口腔微生物菌群物种丰富度显著降低。与癌旁组织相比,癌组织物种丰富度显著增加。3.β多样性分析发现癌组织和癌旁组织物种组成无明显差异,食管癌病人口腔微生物和健康对照组口腔微生物的物种组成之间也没有明显差异,而食管癌患者口腔微生物与癌组织微生物得物种组成则明显不同。4.对食管癌患者口腔微生物、健康对照人群口腔微生物、食管癌组织微生物与癌旁组织微生物菌群结构分析发现:（1）在门水平上,共检测到20个门。其中食管癌口腔、健康对照组口腔、食管癌组织、癌旁组织分别检出16、15、10和10个门。食管癌组和健康对照组口腔微生物都以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门为优势门。食管癌组织与癌旁组织都以变形菌门、厚壁菌门、放线菌门为优势菌门。（2）在属水平上,共检测到279个属。其中食管癌口腔、健康对照组口腔、食管癌组织、癌旁组织分别检出136、118、147和126个属。食管癌组口腔菌群以链球菌,韦荣氏球菌属,奈瑟菌属为优势属。健康人口腔菌群以链球菌、奈瑟菌、韦荣氏球菌属为优势属。食管组织菌群以中慢生根瘤菌属、微杆菌属、寡养单胞菌属为优势属,食管癌旁组织以中慢生根瘤菌属、寡养单胞菌属、链球菌为优势属。（3）在种水平上共检测到489个种。其中食管癌口腔、健康对照组口腔、食管癌组织、癌旁组织分别检出260、243、224和184个种。食管癌患者口腔菌群以Streptococcusoralis、Streptococcus mitis、Veillonella parvula、Granulicatella elegans、Neisseriaperflava为优势菌种。健康人口腔菌群以Neisseria perflava、Streptococcus mitis、Streptococcus oralis、Granulicatella elegans、Veillonella parvula为优势菌种。食管组织菌群以Mesorhizobium australicum、Microbacterium hominis、Methylocapsaacidiphila、Stenotrophomonas pavanii、Prevotella melaninogenica为优势菌种,食管癌旁组织的菌群以Streptococcus agalactiae、Mesorhizobium australicum、Methylocapsaacidiphila、Stenotrophomonas pavanii、Microbacterium hominis为优势菌种。（4）在种水平上,筛选出分组预测准确性最高的差异微生物,并按重要性排名,前十的分别是是Haemophilus parahaemolyticus、Methylocapsa acidiphila、Vaginisenegaliamassiliensis、Prevotella jejuni、Bradyrhizobium embrapense、Porphyromonas gingivalis、Selenomonas noxia、Streptococcus oralis、Fusobacterium periodonticum、Rothiadentocariosa.5.对各组的优势菌种相关性网络分析,发现人体微生物间存在互利共生与互斥共生的关系。首先比较组织样本和唾液样本,发现组织样本微生物间的相关性更为复杂。然后比较食管癌患者口腔与健康人口腔微生物内部的相互联系,发现食管癌患者口腔微生物之间的复杂程度高于健康人。同时也发现食管癌组织内部微生物之间的复杂程度高于癌旁组织。6.LEf Se分析结果表明,发现四组间样品微生物群落有较大的差异。筛选出的特征性生物标志物包括Stenotrophomonas pavanii、Granulicatella elegans、Microbacterium hominis、Veillonella parvula、Methylocapsa acidiphila、Neisseria perflava、Streptococcus oralis、Streptococcus mitis、Mesorhizobium australicum、Streptococcus agalactiae。7.利用PICRUSt软件进行功能预测发现食管癌组与健康组对照口腔菌群在脂质代谢中的胆汁酸代谢,黄酮和黄酮醇和类胡萝卜素等的生物合成代谢存在显著差异,而癌组织与癌旁组织菌群的功能预测结果显示其二者在磷酸葡萄糖转移酶系统有显著差异（P<0.05）。二、基于细胞代谢组探讨牙周梭杆菌毒力因子BCT在食管癌中的作用1.基于测序结果选取代表性的差异菌种牙周梭杆菌（Fusobacterium periodonticum）,序列分析筛选出其毒力因子BCT,建立原核表达系统诱导表达后镍柱层析纯化获得浓度和纯度都较高的牙周梭杆菌毒力蛋白BCT。2.基于上清代谢组研究牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞的影响,共采集到9990个代谢物峰,包括正离子模式下代谢物峰6549个,负离子模式下代谢物峰3441个,从上清样本中一共检测并鉴定出947种代谢物。PLS-DA模型可有效区分对照组与各浓度处理组。将各浓度共培养组分别与对照组两两比较,对筛选出的差异代谢物进行鉴定,分别得到差异代谢物49种（Control vs Low）、46种（Control vs Medium）、62种（Control vs High）。对差异代谢产物进行分析发现有32个共有差异代谢物,我们推测与其相关代谢途径可能在牙周梭杆菌毒力因子BCT影响食管癌细胞代谢过程中起着重要作用。Metabo Analyst分析发现,3种主要代谢途径（牛磺酸和亚牛磺酸代谢;花生四烯酸代谢;糖酵解/糖异生）受到影响。3.基于胞内代谢组研究牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞的影响,共采集到代谢物峰有9496个,包括正离子模式下代谢物峰6377个,负离子模式下代谢物峰3119个,从胞内一共检测并鉴定出1261种代谢物。PLS-DA模型可有效区分对照组与各浓度处理组。将各浓度共培养组分别与对照组两两比较,对筛选出的差异代谢物进行鉴定,分别得到差异代谢物58种（Control vs Low）、36种（Control vs Medium）、52种（Control vs High）。对差异代谢产物进行分析发现有25个共有差异代谢物,我们推测与其相关代谢途径可能在牙周梭杆菌毒力因子BCT影响食管癌细胞代谢过程中起着重要作用。将共有差异代谢物输入Metabo Analyst平台系统进行分析发现,8种主要代谢途径（牛磺酸和亚牛磺酸代谢;谷胱甘肽代谢;花生四烯酸代谢;糖酵解/糖原异生;精氨酸和脯氨酸代谢;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;嘧啶代谢;丁酸代谢）受到影响。三、牙周梭杆菌毒力因子BCT对食管癌细胞EC109生物学功能的影响1.应用QPCR比较食管癌组织和癌旁组织中牙周梭杆菌毒力因子BCT的丰度,结果显示在食管癌组织中,BCT的丰度相较于癌旁组织显著升高（相对丰度为癌旁组织的11.15倍,P<0.05）。2.将食管癌细胞EC109用不同浓度的牙周梭杆菌毒力因子BCT（0,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/m L,20μg/m L,40μg/m L,80μg/m L）共培养24h,通过CCK-8法检测其增殖能力。结果发现:随着染毒剂量的增加,呈现出低浓度促进细胞增殖,高浓度抑制细胞增殖的效果,其中20μg/m L的促增殖效果最强（其相对增值率约为1.3倍）,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.用不同浓度的牙周梭杆菌毒力因子BCT（0,10μg/m L,20μg/m L,40μg/m L）处理食管癌细胞EC109,
关键词: 牙周梭杆菌 ；毒力因子 ；糖酵解 ；上皮间质转化 ；食管癌
摘要： 第一部分 基于UHPLC-QTOF/MS筛选食管鳞癌代谢生物标志物 研究背景 食管癌是全球第七大最常见的癌症,具有地域和种族特征。在中国,食管癌的发病率在肿瘤发病中位居第五,食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最主要的病理类型,能够占到所有病例的90%以上。近年来,尽管食管癌的诊断方法和治疗手段都取得了一些进展,患者的预后仍没有得到显著改善,五年生存率仅为15%至25%,是严重威胁国人健康的疾病。 目前,X线钡餐造影、CT等影像学检查常用于食管癌的诊断,但对早期食管癌不甚敏感,更适用于中晚期患者的诊断和分期。食管内镜+活检是食管癌临床诊断的金标准,但该方法为有创检查,且技术难度大、检查成本高。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin-19-fragment,CYFRA21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell cancer antigen,SCC)等是常用的食管癌标志物,但灵敏度不高。临床尚缺乏灵敏可靠,且经济高效的食管癌生物标志物,适合在常规体检中推广。代谢组学是后基因时代生物医学研究领域的新热点。基因或转录水平的改变提示机体发生特定行为的可能性,而代谢物处在下游,是一系列生物学效应的最终表现,能够更加具体、准确地反映出机体的生理或病理状态。因此,代谢生物标志物更适合用于临床诊断疾病。 ESCC的代谢生物标志物研究正在逐步展开,但仍然存在一定局限性。目前的研究大多采用体液样本,其中最常用的是血液。血液参与人体各种组织和器官的生理生化反应和病理过程,其优点是采样方法简便,缺点是与混杂因素常常导致假阳性生物标志物的发现。组织样本来源于肿瘤发生的直接场所,使用患者组织的不同部分配对地进行代谢组学分析,可以消除个体差异,受混杂因素的影响相对较小,不足之处是组织样本的获得需要有创操作,不利于大规模推广。所以,组织代谢组学与体液代谢组学互相配合,有利于扬长避短,能够发现肿瘤组织所诱导的特定代谢失调。 研究目的 认识ESCC的代谢特点,筛选ESCC血清生物标志物,为进一步探索可靠、高效的ESCC诊断方法奠定理论基础。 研究方法 我们采集ESCC患者配对的癌组织和癌旁组织样本,及其治疗前的血清样本,并招募健康志愿者采集其血清样本。利用UHPLC-QTOF/MS平台进行代谢组学检测,获得代谢指纹图谱,并借助MetDNA方法对代谢物进行分析注释。采用主成分分析和偏最小二乘判别分析对获得的数据进行多维统计分析,并结合单变量Wilcoxon秩和检验进行组间比较,分别筛选出ESCC组织及血清中的异常代谢物。最后,根据代谢物的极性、质量电荷比及保留时间,将组织和血清差异代谢物进行匹配,发现两类样本之间一致性的代谢改变,并利用这些代谢物构建随机森林模型。 研究结果 1.癌组织和癌旁组织之间,以及ESCC患者血清和对照血清之间均存在明显的代谢轮廓差异。经过单变量和多维统计分析,根据Padj<0.05且VIP>1的标准,癌组织中共筛选出1692个差异代谢物,ESCC患者血清中共筛选出457个差异代谢物。 2.对组织和血清中的差异代谢物进行匹配,共有36种代谢物在两类样本中表现出一致性的代谢失调,主要涉及氨基酸代谢(4-氨基丁醛、3-磺基丙酮酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸盐等)、中心碳代谢(L-谷氨酸、L-天冬氨酸、甘油等)以及嘌呤代谢(次黄嘌呤、黄嘌呤)等代谢通路。 3.将36种差异代谢物纳入构建随机森林模型,ROC分析结果显示模型的判别效能良好,在早期(TNM:0-Ⅱ)和中晚期(TNM:Ⅲ-Ⅳ)ESCC患者的判别中灵敏度分别为97.5%和92.7%,特异性分别为98.9%和93.8%。 研究结论 ESCC中存在明显的代谢扰动,通过对两类样本中的差异代谢物进行匹配,共鉴定出36种潜在的血清生物标志物;将其用于构建ESCC诊断模型,显示出良好的判别效能。 第二部分 利用转录组学验证食管鳞癌代谢生物标志物及通路 研究背景 在第一部分中,我们通过代谢组学研究,综合比较了 ESCC患者组织和血清中的异常代谢特征,筛选并鉴定出36种潜在的代谢生物标志物。然而,目前的研究结果实现临床转化存在一定局限性。首先,生物标志物数量过多,在诊断效能提高的同时也会增加检测成本与技术难度,需要进一步筛选出对于ESCC更为关键的代谢物,争取以最少的检测指标实现尽可能大的诊断效能;其次,单一组学无法揭示不同层面分子之间的交叉与联系,所以在探索分子标志物与生物表型之间的因果关系方面能力有限。 多组学技术联合已逐步应用于不同研究领域,借助组学数据之间的整合分析,不仅可以有效去除单个分子层面的随机事件,锁定真正的疾病候选因子,还可以将不同层面的调节关联到一起,从而更好地诠释疾病发生机制。代谢物是细胞生物学过程的最终产物,能够反映上游生物学事件,如基因表达改变和环境变化。而基因及其编码的蛋白质在代谢物的代谢过程中起着重要的作用,与机体的代谢调节密切相关。转录组学能够反映在特定时间、特定环境下,机体基因表达所发生的特定改变,是揭示疾病机制的有效手段。所以,通过代谢组学来探索肿瘤的代谢特征和生物标志物,然后通过转录组学验证筛选出的代谢物和代谢途径,不仅可以进一步验证代谢层面的研究发现,还提供了一个系统水平的视角,有助于我们更好地理解肿瘤的代谢失调。 研究目的 通过整合代谢组学与转录组学数据,更深入的了解ESCC中的代谢变化,寻找代谢标志物相关通路的关键基因线索,进一步缩小候选生物标志物范围,建立可靠且经济高效的ESCC诊断方法,并为研究ESCC发生发展的分子机制奠定基础。 研究方法 研究第一部分收集到的组织样本,我们随机抽取23组配对的癌组织和癌旁组织进行转录组学测序和差异基因分析,并借助KEGG数据库,采用超几何检验方法对ESCC组织差异代谢物和基因共同进行通路富集,通过分析失调代谢通路,挖掘ESCC中步调一致的代谢物-基因变化。然后,利用组织测序数据以及免疫组织化学染色技术(immunohistochemistry,IHC)分析关键基因在ESCC中的表达情况。采用Wilcoxon秩和检验比较组间的基因表达水平差异;利用Fisher精确检验和Logistics回归分析比较基因与患者临床病理特征的相关性;使用Pearson相关性分析代谢物与基因表达之间的相关性。最后,通过代谢物-基因的分析结果,缩小生物标志物范围,并对生物标志物的诊断效能进行外部验证。 研究结果 1.经过差异基因分析,根据Padj<0.05且abs(log2(Foldchange))>1的筛选标准,共获得了差异表达的mRNA 3110个,其中表达上调的mRNA有1742个,表达下调的mRNA有1368个。 2.将ESCC组织差异代谢物和差异表达的mRNA共同进行通路富集,结果显示两类分子主要富集在神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、蛋白质消化吸收、嘌呤代谢及氨基酸生物合成等通路。 3.通过对富集通路的逐一检查,我们在嘌呤挽救途径中发现了步调一致的代谢物-基因变化。在ESCC组织中,次黄嘌呤、黄嘌呤和调控二者利用的关键基因HPRT1表现出显著上调,同时下游代谢产物鸟苷酸(GMP)丰度增加。并且,组织中次黄嘌呤和黄嘌呤的丰度上调与血液中相一致,而GMP在血液中的丰度没有显著变化。 4.HPRT1在ESCC患者癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。测序数据显示,HPRT1 mRNA的高表达与患者较大的肿瘤组织(≥5cm)显著相关(OR=29.33,95%CI:3.52-675.53,p=0.007)。IHC结果显示:肿瘤组织较大(≥5cm)的患者,其HPRT1蛋白表达水平显著高于肿瘤组织较小(<5cm)的患者(p=0.039)。 5.与癌旁组织相比,癌组织中的次黄嘌呤和黄嘌呤丰度均显著增高(p<0.001);ESCC患者血清中次黄嘌呤和黄嘌呤丰度均显著高于对照血清(p<0.001)。组织和血清中次黄嘌呤和黄嘌呤的丰度,均与ESCC组织中的HPRT1 mRNA水平(p<0.001)及蛋白表达量显著相关(p<0.001)。Pearson相关性分析结果显示,ESCC组织和血清中的次黄嘌呤和黄嘌呤水平与血尿酸水平之间均不存在显著的相关性(p>0.05)。 6.利用次黄嘌呤和黄嘌呤构建随机森林模型并进行交叉验证。ROC分析结果显示,模型在血清内部发现集(第一部分代谢组学数据)中判别ESCC的AUC为0.825(95%CI=0.758-0.889),灵敏度为74.7%,特异度为85.2%;在外部验证集中判别ESCC的AUC为0.765(95%CI=0.680-0.843),灵敏度为72.4%,特异度为80.2%。次黄嘌呤和黄嘌呤作为生物标志物,其灵敏度高于CEA(17-28%)、CYFRA21-1(19.7-40%)以及SCC(64%)。 研究结论 ESCC组织中发生了与嘌呤挽救途径相关的代谢物-基因显著改变,这些改变既减轻了嘌呤核苷酸从头合成的压力,也减轻了嘌呤核苷酸降解及排出的压力,同时满足了癌细胞生长增殖的需要。代谢生物标志物次黄嘌呤与黄嘌呤有实现无创、经济、高效诊断ESCC的潜力,嘌呤挽救途径有可能成为治疗ESCC的关键靶点。第三部分 次黄嘌呤和HPRT1在食管鳞癌中的作用机制研究 研究背景 在前两部分的研究中,我们首先利用代谢组学筛选并鉴定出36种潜在的ESCC血清生物标志物,进而通过整合分析代谢组学与转录组学数据,在嘌呤挽救途径中发现次黄嘌呤和黄嘌呤及其调控基因HPRT1呈现步调一致的上调趋势。但代谢物与基因是否在肿瘤发生发展中发挥作用,需要我们通过基础实验进行深入探索。 HPRT1编码的蛋白-次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1是嘌呤挽救途径中的关键酶。HPRT1曾经被认为是一种管家基因,但是最近的研究揭示它可能与多种癌症的发生发展有关。目前,HPRT1在ESCC中的生物学功能尚无报导。此外,次黄嘌呤与黄嘌呤在ESCC中的异常增高是否也具有生物学意义,仍需要我们进行研究探讨。 研究目的 研究次黄嘌呤与HPRT1在ESCC中的相互作用关系,并探讨次黄嘌呤与HPRT1在ESCC发生发展中发挥的生物学功能。 研究方法 分析TCGA数据库中HPRT1在各类癌组织中的表达及其与患者预后的相关性,验证HPRT1的研究价值。利用qRT-PCR以及western blot技术检测5种ESCC细胞系(KYSE-30、KYSE-150、KYSE-180、KYSE-450 和 KYSE-510)中 HPRT1 的表达水平,选择HPRT1表达水平居中的两种细胞系,利用慢病毒转染技术在两种细胞系中分别构建HPRT1稳定沉默和过表达的细胞株。黄嘌呤与次黄嘌呤在体内可以互相转化,所以本部分我们以次黄嘌呤为代表进行研究。细胞计数实验、克隆形成实验、Transwell实验以及次黄嘌呤Elisa检测实验,用于研究次黄嘌呤与HPRT1在ESCC细胞中的相互作用关系。细胞计数实验和克隆形成实验评估HPRT1对ESCC细胞增殖的影响。划痕愈合实验和Transwell实验评估HPRT1对ESCC细胞迁移的影响。流式细胞术评估稳定沉默HPRT1表达对ESCC细胞周期进程及细胞凋亡的影响。构建裸鼠移植瘤模型评估稳定沉默HPRT1表达对ESCC细胞体内成瘤能力的影响。细胞转录组学测序用于研究稳定沉默HPRT1表达所影响的信号通路,western blot技术验证HPRT1对通路的调控作用。 研究结果 1.TCGA数据库中,与正常组织相比,HPRT1在食管癌、乳腺癌、宫颈癌等12类癌症中表达显著上调。Cox比例风险模型结果显示,在包括食管癌在内的17类癌症中,与HPRT1低表达组相比,高表达组的死亡风险显著增加。在食管癌中,HPRT1高表达组的死亡风险较低表达组增加了 2倍以上(HRs=2.215,95%CI:1.143-4.293,p=0.018),HPRT1高表达组的中位OS为18.2个月,明显短于HPRT1低表达组的31.
关键词: 食管鳞状细胞癌 ；代谢组学 ；生物标志物 ；血液 ；组织 ；诊断模型 ；食管鳞状细胞癌 ；代谢组学 ；转录组学 ；嘌呤挽救途径 ；次黄嘌呤 ；黄嘌呤 ；HPRT1 ；食管鳞状细胞癌 ；次黄嘌呤 ；HPRT1 ；增殖 ；迁移 ；YAP
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