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摘要： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC i)通过影响组蛋白乙酰化水平,调节基因表达而产生抗肿瘤作用。本研究合成一种新型异羟肟酸类HDACi N-Hydroxy-4-phenylacetylamino-N-p-tolyl-benzamide(HPAPB),以伏立诺他(SAHA)为阳性对照,测定其对A549、HeLa、HepG2和EC109等肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用和小鼠体内抗肿瘤作用。结果HPAPB对HepG2和A549增殖抑制活性较强(100μ M肿瘤抑制作用与SAHA相当。并建立HPAPB含量HPLC测定方法:C18(4.6mmX250mm,5um);检测波长283nm;流动相(CH3OH:0.1甲酸水=6832);流速1.OmUmin;柱温30℃。以此建立生物样本分析方法,获得HPAPB大鼠体内血药浓度曲线和药动学参数,结果HPAPB大鼠体内血药浓度变化符合二室模型,t1.2=0.592h,V1=1.475,CL=0.611,AUC(0-∞ =40.942,动力学方程 =15.981e1.171t+ 0.967e-0.018t。
关键词: N-Hydroxy-4-phenylacetylamino-N-p-tolyl-benzamide ；抗肿瘤 ；药代动力学 ；高效液相色谱
摘要： 降香（DALBERGIAE ODORIFERAE LIGNUM）为豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T.Chen树干和根的干燥心材,具有化瘀止血,理气止痛的功效,现代研究表明降香主要含有挥发油和黄酮类成分,具有舒张血管、增加冠脉流量、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌等作用。交趾黄檀（Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness）是降香檀同属植物,俗称“大红酸枝”,主要分布于柬埔寨、老挝、泰国、越南等东南亚国家[2],目前在我国云南、广西、福建、海南等地已有大面积人工种植[3-6]。在泰国地区交趾黄檀心材常作为传统药材使用,临床上主要用于治疗血瘀和癌症。文献研究表明交趾黄檀心材主要含有黄酮类成分。交趾黄檀心材与降香外观十分相似,常被掺伪在降香药材中。新黄酮类成分是黄檀属植物的一类特征性成分,具有抗骨质疏松、抗雄性激素、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化等多种生物活性。阔叶黄檀酚是降香和交趾黄檀心材中共有的新黄酮类成分,在交趾黄檀心材中含量较高,且课题组前期研究表明其对大鼠急性心肌缺血和H9c2细胞缺氧复氧所致损伤均具有较好的保护作用。本论文基于“亲缘关系—化学成分—药理活性”植物亲缘学说理论,采用HPLC、GC-MS和LC-MS现代技术方法对降香和交趾黄檀心材中的化学成分进行比较研究,利用分子对接方法对降香和交趾黄檀心材中新黄酮类成分与心血管疾病密切相关的氧化应激相关酶—COX-2酶和i NOS酶进行虚拟筛选研究,基于分子对接虚拟筛选和课题组前期药理药效研究结果,对降香和交趾黄檀心材中共有新黄酮类成分阔叶黄檀酚进行大鼠体内的药代动力学及代谢组学研究,论文主要研究成果如下:一、降香和交趾黄檀心材的化学成分比较研究1. 阔叶黄檀酚等8种成分的HPLC法含量测定:建立了降香和交趾黄檀心材中阔叶黄檀酚等8种成分的HPLC测定方法,发现降香和交趾黄檀心材中阔叶黄檀酚等8种成分的含量差异较大,18批降香中甘草素、木犀草素、柚皮素、异甘草素、刺芒柄花素、黄檀素、阔叶黄檀酚和生松素的百分含量依次为:0.1341%～0.4952%、0.0282%～0.1670%、0.0163%～0.5913%、0.0535%～0.1880%、0.1424%～0.6401%、0.0680%～0.5907%、0.0032%～1.9807%、0.0096%～0.7402%;交趾黄檀心材中检测到阔叶黄檀酚等5种成分,阔叶黄檀酚的百分含量0.4736%～2.3815%。HPLC指纹图谱和相似度分析表明:18批降香之间差异性较大,仅有11批降香的相似度值在0.5以上;5批交趾黄檀心材的相似度均在0.85以上,差异性较小。PCA和PLS-DA分析结果表明:18批降香可建立较好的PLS-DA分析模型,可用于降香药材质量评价研究。2. 降香和交趾黄檀心材中挥发性成分的GC-MS比较分析:建立了降香和交趾黄檀心材顶空进样、苯醇抽提物和挥发油的GC-MS分析方法,交趾黄檀心材中挥发性成分与降香中挥发性成分相差巨大,降香中挥发性成分主要为反式橙花叔醇、7-（2,6-dimethyl-hepta-1,5-dienyl）-3,8,8-trimethyl-bicyclo[4.2.0]oct-2-ene和dihydro-3-（2-methyl-2-propenyl）-2,5-furandione,含有红没药烯、（±）α-红没药醇、金合欢烯和金合欢醇等成分;交趾黄檀心材顶空气质和苯醇抽提物分析含量最高的分别为3-pyridinemethanol,[1R-（1R*,4Z,9S*）]-bicyclo[7.2.0]undec-4-ene和methyl 4'-methoxy-4,5-methylenedioxybiphenyl-2-carboxylate。3. 降香和交趾黄檀心材甲醇提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析:建立了降香对照药材和交趾黄檀心材甲醇提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析的方法,从降香对照药材中鉴定出83个化学成分,包括6个黄酮、12个二氢黄酮、18个异黄酮、13个二氢异黄酮、10个新黄酮类、4个查尔酮类、9个异黄烷类、2个紫檀烷类、3个苯并呋喃类和6个其他类成分;从交趾黄檀心材中鉴定出101个化学成分,包括8个黄酮、14个二氢黄酮、23个异黄酮、11个二氢异黄酮、15个新黄酮类、7个查尔酮类、2个鱼藤酮类、5个异黄烷类、3个紫檀烷类、4个苯并呋喃类、3个苯丙素类、2个苯乙烯类和4个其他类成分,其中确定具体结构的已知成分85个。降香和交趾黄檀心材的甲醇提取物中共有相同成分54个,主要为异黄酮、黄酮和新黄酮类成分。二、新黄酮类成分对COX-2和i NOS酶抑制活性的虚拟筛选研究利用分子对接方法对降香和交趾黄檀心材中新黄酮类成分与心血管疾病密切相关的氧化应激酶—COX-2酶和i NOS酶进行了虚拟筛选研究,发现在14个新黄酮类成分中latifolin与i NOS酶的3个活性位点分子对接得分均较高,与活性位点d的得分最高,与活性位点c对接仅有5-O-methyllatifolin比latifolin得分高,与活性位点e对接仅有4'-hydroxy-4-methoxydalbergione和4,5-dimethoxy-2-hydroxydalbergiquinol比latifolin得分高;黄檀酚类新黄酮成分与COX-2酶活性位点a分子对接得分高低依次为:3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol>2-h ydroxy-4,5-dimethoxydalbergiquinol>5-O-methyllatifolin>latifolin>dalbergipheno l>mimosifoliol,A环5-OCH3和B环上的-OH可能对COX-2酶活性位点a的分子对接影响很大,而与活性位点b分子对接得分依次为:mimosifoliol>dalbergi phenol>latifolin>2-hydroxy-4,5-dimethoxydalbergiquinol>3'-hydroxy-2,4,5-trimet hoxydalbergiquinol>5-O-methyllatifolin,几乎与活性位点a的得分顺序相反。三、新黄酮类成分阔叶黄檀酚在大鼠体内的药代动力学研究1. 阔叶黄檀酚在大鼠体内的吸收研究:阔叶黄檀酚在大鼠体内血药浓度具有显著性性别差异,体内药动学过程符合二室模型,在大鼠体内的血药浓度达峰时间较快,达到最大血药浓度时间为30～40min,T1/2为30～40min,高、中、低三个剂量组Cmax分别为9.276±1.791、3.06±0.568和1.897±0.400mg/L,Tmax分别为40.5±12.778、47.0±7.483和28.5±7.806min;T1/2分别为43.248±11.159、30.361±4.992和31.227±7.696min;药时曲线存在二次吸收峰情况,具有明显的雌、雄性别差异,雌性大鼠体内血药浓度明显高于雄性大鼠,且具有显著性统计学差异。2. 阔叶黄檀酚在大鼠体内的分布研究:阔叶黄檀酚在大鼠体内心、肝、脾、肺、肾、脑等组织均有分布,但分布存在一定差异。雌性大鼠灌胃给阔叶黄檀酚后,在0.5、1和2h三个时间点小肠和胃部阔叶黄檀酚的浓度远高于其他组织器官,而4h时各组织中阔叶黄檀酚的含量依次为:脑>脂肪>小肠>心脏>肝脏>脾脏>肺>肾>肌肉>胃;雄性大鼠灌胃给阔叶黄檀酚后,在0.5、1和2h三个时间点小肠和胃部阔叶黄檀酚的浓度也普遍高于其他组织器官,但在1和2h两个时间点小肠组织的药物浓度下降较快。3. 阔叶黄檀酚在大鼠体内的代谢研究:阔叶黄檀酚在大鼠体内血浆、尿液、粪便样品中的代谢产物各有差异,不同生物样品中均检测到Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物,同时检测到与原型药物的质谱信息相同的成分,推测可能是原型药物进入体内后发生结构异构变化,产生右旋构型成分;不同生物样品中Ⅱ相代谢主要发生甲基化、硫酸酯化和乙酰化等,Ⅰ相代谢主要发生氧化、还原、去甲基化等,Ⅰ相代谢产物中存在较多的酸、酮、成醇类成分,可能与阔叶黄檀酚结构中双键发生氧化还原有关。文献研究表明,大鼠体内的CYP450酶存在明显的雌雄性别差异,雌性大鼠CYP450酶含量较雄性大鼠低10%～30%,这可能是导致阔叶黄檀酚在大鼠体内代谢呈现性别差异的主要原因。4. 阔叶黄檀酚在大鼠体内的排泄研究:阔叶黄檀酚在大鼠体内尿液中尿排速率和平均累积排泄量存在显著性性别差异,雄性大鼠的尿排速率比雌性的尿排速率明显快,且平均累积排泄量明显多;但阔叶黄檀酚在雌、雄组大鼠尿液中平均累积排泄率分别为1.21%和1.43%,无统计学差异。阔叶黄檀酚在雌、雄组大鼠粪便中平均累积排泄率分别为17.80%和14.79%,雌、雄大鼠的平均累计排泄率具有一定差异,却无显著性统计学意义;但雌性大鼠从粪便中的排泄量大于雄性大鼠的排泄量。阔叶黄檀酚在大鼠胆汁中的平均累积排泄率为1.0940±1.0277%,个体间差异较大;雌、雄大鼠胆汁中的原型平均累积排泄率分别为0.2284±0.1111%、1.9596±0.7756%,具有显著性差异;而雌、雄组大鼠胆汁中阔叶黄檀酚的平均累积排泄量和平均排泄速率虽存在一定差异,但无明显统计学差异。阔叶黄檀酚在大鼠体内存在尿液、粪便和胆汁排泄三种情况,但主要通过粪便排泄,且粪便的原型排泄率较高,在10%以上。阔叶黄檀酚在大鼠体内血药浓度存在的显著性雌雄性别差异,可能与其在雌、雄大鼠体内不同排泄速率有关。四、新黄酮类成分阔叶黄檀酚在大鼠体内的代谢组学初探采用代谢组学方法研究阔叶黄檀酚在大鼠体内的血浆、尿液、粪便和胆汁样品,发现阔叶黄檀酚在大鼠体内的血浆、尿液、粪便和胆汁样品均存在雌、雄性别差异,正/负离子模式下均检测到不同数量的差异性代谢物,代谢通路分析发现阔叶黄檀可能对大鼠体内的甾类激素生物合成和初级胆汁酸生物合成两条通路具有明显影响。阔叶黄檀酚对甾类激素生物合成通路的影响可能就是导致其在大鼠体内的药代动力学规律具有显著性雌雄性别差异的原因。
关键词: 降香 ；交趾黄檀 ；阔叶黄檀酚 ；药代动力学 ；代谢组学 ；虚拟筛选
被引量
6
摘要： 本文主要研究了以下几个部分： 第一部分: 目的:本课题组前期对商陆根乙醇提取物的乙酸乙酯层进行对结核分枝杆菌的体外抑菌活性研究，结果显示其在3 mg·mL-1浓度下具有较好的抗结核分枝杆菌作用。因此，本课题组对商陆根进行研究，通过对其进行系统的提取分离，期望得到较好抗结核分枝杆菌活性的单体化合物。 方法:采用硅胶常压层析、葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)层析、RP-18反相硅胶层析、重结晶等多种分离技术，对商陆根乙酸乙酯部分进行提取分离。 结果:从商陆根乙醇提取物乙酸乙酯萃取段分离得到13个化合物。分别为:α-菠甾醇、棕榈酸、豆甾-7，22-二烯-3-O-β-D-葡萄糖苷、2-羟基商陆酸、商陆皂苷辛、Allantion、商陆皂苷乙、6-rmethoxy-7-hydroxy favone、化合物SL-05、化合物SL-10。其中化合物SL-05和SL-10经鉴定为新化合物，除此之外，Allantion、6-methoxy-7-hydroxy favone为首次从商陆根中分离。 结论：通过UV、MS、1D和2D-NMR等现代波谱数据方法，测定了其中10个化合物的结构。 第二部分: 目的:本课题组通过前期的工作发现了汉防己乙素具有一种全新的抗肿瘤作用机制:诱导肝癌细胞自噬性死亡。基于对上述抗肿瘤新作用机制的深入研究，本课题组前期合成了一系列苯基异喹啉类生物碱衍生物，发现其中化合物ZG-06和化合物ZG-10能明显的抑制肝癌细胞生长，有进一步研究的价值。因此，本课题组希望对ZG-06和ZG-10做一个成药性评价前的药代动力学研究。 方法:采用Agilent1100型高效液相色谱仪，色谱柱为Phenomenex C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）;流动相为乙腈:0.1％三乙胺（磷酸调pH=8.0）=65∶53;检测波长230 nm;柱温30℃;流速1.0 mL·min-1;以汉防己甲素为内标物，作为同时测定大鼠血浆中ZG-06和ZG-10含量的HPLC方法。大鼠灌胃给药后分别在10'、15'、30'、60'、90'、2h、4h、6h、9h、12h、24 h对大鼠眼眶取血。处理样品后，采用药动学软件DAS3.2.6进行统计分析，进行血药浓度的测定和药动学参数的计算。 结果:大鼠血浆中的内源物质对药物的测定没有影响。ZG-10在0.1-20μgmL-1范围内浓度与峰面积的线性关系良好(r=0.9995)，定量下限为0.1μg·mL-1，ZG-10低、中、高浓度的相对回收率(％)分别为:88.67±2.60、96.55±1.00、101.49±0.58。ZG-06在0.13-20μg·mL-1范围内浓度与峰面积的线性关系良好(r=0.9955)，定量下限为0.13μg·mL-1，ZG-06低、中、高浓度的相对回收率(％)分别为:97.66±7.81、101.86±1.88、98.78±6.59。SD大鼠单剂量口服化合物ZG-06(40mg·kg1)后，化合物ZG-06在SD大鼠体内的药代动力学参数Cmax、t1/2MRT、AUC0-τ、AUC0-∞分别为:2.121±0.602mg.L-1，4.675±0.587 h，9.04±0.37 h,26.708±5.962 mg/L*h，27.491±5.897mg/L*h。 结论:采用非房室模型方法进行数据分析，参数符合药物动力学变化趋势。此方法准确简便，可用于ZG-06和ZG-10在大鼠血浆中的含量测定和药代动力学研究。
关键词: 商陆根 ；化学成分 ；抗肿瘤活性 ；药物代谢动力学
摘要： 牡丹皮(Moutan Cortex)又名丹皮、粉丹皮、木芍药、条丹皮、洛阳花,为毛莨科芍药属植物牡丹(Paeonia SuffruticosaAndrews)的干燥根皮。味苦,辛:性微寒;归心、肝、肾经。具有清热凉血、活血化瘀之功效;主要用于治疗热入营血,温毒发斑,吐血衄血,夜热早凉,无汗骨蒸,经闭痛经,痈肿疮毒,跌扑伤痛。本论文对牡丹皮的70%乙醇提取物进行研究,利用溶剂分布萃取法和各种色谱手段从中分离得到64个化合物,并根据理化常数及光谱数据分析([α]、UV、IR、1D-NMR、2D-NMR、MS等)鉴定了其结构,新化合物1～12解析为:paeoniflorin B()、oxypaeoniflorin sulfonate(2)、4-O-甲基氧化芍药苷(4-O-methyloxypaeoniflorin,3)、oxypaeonidanin(4)、9-O-butyloxypaeonidanin(5)、9-O-butylpaeonidanin(6)、4-O-butyloxypaeoniflorin(7)、9-epi-oxypaeonidanin(8)、4-O-methylgalloyloxypaeoniflorin(9)、paeoniflorin A(10)、mudanoside C(11)、(E)-icosyl 3-(2,4,5-trihydroxyphenyl)acrylate(12);已知化合物测定为:芍药苷(paeoniflorin,13)、paeonidanin(14)、4-O-甲基芍药苷(4-O-methylpaeoniflorin,15)、苯甲酿芍药苷(benzoylpaeoniflorin,16)、mudanpiosideE(17)、氧化芍药苷(oxypaeoniflorin,18)、苯甲酿氧芍药苷(benzoyloxypaeoniflorin,19)、牡丹皮苷D(mudanpiosideD,20)、牡丹皮苷C(mudanpiosideC,21)、8-0-去苯甲酰基芍药苷(8-O-debenzoylpaeoniflorin,22)、没食子酰氧芍药苷(galloyloxypaeoniflorin,23)、没食子酰芍药苷(galloylpaeoniflorin,24)、牡丹皮苷B(moudanpioside B,25)、牡丹皮苷F(moudanpioside F,26)、4-0-丁基芍药苷(4-O-butylpaeoniflorin,27)、paeoniflorigenone(28)、paeonidanin A(29)、4-O-甲基苯甲酰芍药苷(4-O-methylbenzoylpaeoniflorin,30)、丹皮酚原苷(paeonolide,31)、丹皮酚苷(paeonoside,32)、mudanosideB(33)、suffruticosideD(34)、suffruticosideA(35)、suffruticosideB(36)、3-O-β-D-glucopyranosyl-4-methoxyacetophenone(37)、丹皮酚(paeonol,38)、1-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethanone(39)、2,3-dihydroxy-4-methoxyacetophenone(40)、丹皮酚新苷(apiopaeonoside,41)、iriflophenone 2-O-β-D-glucopyranoside(42)、cadina-4,1 1-dien-14-oic acid(43)、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-galloylglucose,44)、1,3,4-三没食子酰葡萄糖(1,3,4-trigalloylglucose,45)、1,2,3,4-四没食子酰葡萄糖(1,2,3,4-tetragalloylglucose,46)、(-)-儿茶素((-)-catechin,47)、齐墩果酸(oleanolicacid,48)、尿啼啶(uridine,49)、α-乙基-阿拉伯糖(α-L-arabinopyranosideethyl,50)、β-谷甾醇(3-sitosterol,51)、富马酸单乙酯(mono-ethyl fumarate,52)、富马酸二丁酿(dibutyl fumarate,53)、香草酸(vanillic acide,54)、马来酸单甲酯(mono-methyl maleate,55)、邻苯二甲酸二丁酿(phthalic acid dibutyl ester,56)、没食子酸(gallic acid,57)、没食子酸甲酯(methyl gallate,58)、没食子酸乙酯(ethyl gallate,59)、没食子酸丁酯(butyl gallate,60)、棕榈酸甲酯(methyl palmitate,61)、十五烷酸(pentadecanoic acid,62)、对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,63)、苯甲酸(benzoic acid,64)。其中12个(化合物1-12)为新化合物,9个(化合物37,42,43,47,49,50,52,53,55)为首次从该属植物中分离得到。上述研究结果丰富了牡丹皮化学成分的结构类型,同时为进一步的生物活性研究奠定了物质基础。一氧化氮(NO)是在生物体内由L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成的一种无机小分子自由基,是一种生物体内重要的信使分子和神经递质,参与调节机体的许多生理或病理过程,如血管舒张,非特异性宿主防御反应,局部缺血再灌损伤,慢性或急性炎症反应等。研究证实在一些类型的细胞如巨噬细胞,上皮细胞,和平滑肌细胞中通过应答一些前炎症因子如白介素-lβ(IL-1β),肿瘤坏死因子(TNF-α)和脂多糖(LPS)等的刺激可以刺激其中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达而导致过量产生NO。论文采用Griess法考察了其中58个化合物抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7NO的释放活性,结果表明有13 个化合物(1,10,19,21,24,26,28,30,35,55,58,59,60)表现出比阳性药物更强的抑制活性。另外,11个化合物(4,22,32,33,36,37,39,43,51,53,62)表现出不同程度的抑制活性。这些化合物对NO的抑制作用初步阐明了牡丹皮发挥抗炎活性的药效物质。丹皮酚为牡丹皮中主要活性成分之一,2010版《中华人民共和国药典》(一部)规定其含量不得少于1.2%,近年来研究表明丹皮酚具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用。文献调研发现,丹皮酚生物利用度较低,仅有少数文献报道丹皮酚在大鼠体内的代谢转化情况,在人体内代谢研究报道更是少之又少,前期本课题组从受试者口服丹皮酚片后收集的尿液中分离得到5个代谢产物,resacetophenone(M1),resacetophenone-2-O-sulfate(M2),2-hydroxy-4-methoxyacetophenone-5-O-sulfate(M3),2-hydroxy-4-methoxyacetophenone-5-O-glucopyranuronoside(M4),2-hydroxyacetophenone-4-O-glucopyranuronoside(M5),并采用UPLC/Q-TOF-MS2技术,初步分析和鉴定了丹皮酚在人尿液,大鼠尿液、血浆和胆汁中的代谢产物。本论文在其工作基础上进行补充和完善,系统分析了丹皮酚在生物体内的代谢情况;并对前期得到的代谢产物M1-M5,后期得到的M6(2,5-dihydroxy-4-methoxyacetophenone)和化学合成得到的 M10(2,4,5-trihydroxyacetophenone)进行抑制LPS激活巨噬细胞释放NO的活性和清除DPPH和·OH自由基的活性测试,活性结果表明M6,M10活性较强,丹皮酚、M1、M3、M5也有一定程度的清除.OH活性。本论文初步建立了快速、灵敏的UPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中丹皮酚及其代谢产物M1,M2,M4-M6的浓度,研究了大鼠灌胃丹皮酚的吸收动力学特征。实验结果显示,丹皮酚和代谢产物分别在50～4000 ng/mL,12.5～1000 ng/mL范围内线性关系良好,丹皮酚和各代谢产物在体内的血药浓度和排泄速率各不同,且代谢产物的血药浓度与给药剂量相关。这些结果为进一步研究丹皮酚在体内的代谢情况提供了重要信息,同时,也为临床合理用药和系统的药代动力学研究提供参考。
关键词: 牡丹皮 ；化学成分 ；结构鉴定 ；丹皮酚 ；UPLC/Q-TOF-MS/MS ；初步药代动力学 ；DPPH ；·OH ；NO
被引量
6
摘要： 菊科旋覆花属植物在全世界约有100余种，我国有20余种和多种变种。该属植物中的特征性成分为倍半萜内酯类化合物。本属多种植物常供药用,如该属植物旋覆花干燥地上成分金沸草（Inulae Herba）具有降气、消痰、止水等功效。近年来，对倍半萜内酯类化合物的药理活性研究表明，该类化合物主要具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用。此外，还有一些倍半萜内酯类化合物具有抗氧化、抗糖尿病等作用。有文献对旋覆花属植物的指纹图谱进行了研究，但对其中倍半萜内酯类化合物的含量测定未有报道。因此，本课题采用HPLC-UV法同时测定了旋覆花属植物中5种倍半萜内酯的含量，并将该方法应用于不同产地、不同种的14个批次旋覆花属植物中这5种成分的含量测定，为其的质量评价提供可靠的依据。在此基础上，我们对2010版《中国药典》金沸草药材质量标准进行了修订，增加了“含量测定”项，制定了限度。
从金沸草中提取得到的三种倍半萜内酯1-acetoxy-6α-hydroxyeriolanolide（1-乙酰氧基大花旋覆花内酯）,1β-hydroxyalantolactone（1β-羟基-土木香内酯）和ivangustin结构类似，具有抗炎抗菌等活性。到目前为止，未有文献对这三种化合物的体内药动学行为进行过研究。本课题采用LC-MS/MS液质联用的方法同时对大鼠血浆中的该三种倍半萜内酯类化合物进行含量测定，对这三种化合物的体内药动学进行了研究。为该倍半萜内酯类化合物的临床应用以及进一步的研究奠定了基础，提供了理论与实验依据。
1. HPLC法同时测定旋覆花属植物中5种倍半萜内酯类成分的含量目的建立同时测定旋覆花属植物中5种倍半萜内酯含量的方法，为其的质量评价提供依据。
方法采用HPLC-UV法。色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），A相的含量随时间变化为30%40%（0～20min）、40%55%（20～25min）、55%65%（25～40min）、55%95%（40～45min）、95%95%（45～55min）；流速1.2ml/min，检测波长205nm，柱温25℃。结果5种倍半萜内酯1-acetoxy-6α-hydroxyeriolanolide（1-乙酰氧基大花旋覆花内酯）、1β-hydroxyalantolactone（1β-羟基-土木香内酯）、 Ivangustin、 JaponiconeA及Inulanolide A，在55min内基线分离，其质量浓度分别在13.4～402μg/ml、6.53～196μg/ml、6.85～206μg/ml、10.4～312μg/ml、6.65～200μg/ml内与峰面积呈良好的线性关系，R2分别为0.9998、0.9998、0.9999、0.9998、0.9997。平均加样回收率分别为99.0％、97.6％、99.3％、97.9％、100.8%, RSD分别为1.0％、0.68％、2.1％、0.97％、1.9%。
结论该方法可用于旋覆花属植物中5种倍半萜内酯的含量测定；不同种旋覆花属植物倍半萜内酯含量有显著差异。
2.金沸草药材的质量标准修订
目的本实验建立了HPLC-UV法测定1-acetoxy-6α-hydroxyeriolanolide（1-乙酰氧基大花旋覆花内酯）的含量，修订2010版中国药典金沸草药材质量标准。
方法采用HPLC-UV法。色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相为乙腈（A）-水（B）， A相的含量随时间变化为30%38%（0～16min）；流速1.2ml/min，检测波长205nm，柱温30℃。
结果1-acetoxy-6α-hydroxyeriolanolide（1-乙酰氧基大花旋覆花内酯）的质量浓度在0.0615～2.460μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，R2为1.0000。平均加样回收率为96.8％, RSD为2.86％。
结论该方法可用于金沸草药材的质量控制，完善了金沸草药材的质量标准。
3.三种倍半萜内酯化合物在大鼠体内的药动学研究
目的本试验研究旨在建立同时测定三种倍半萜内酯口服以及静脉注射后在大鼠血浆中的药物浓度,并计算它们的绝对生物利用度，为非临床药代动力学研究提供测定方法。
方法采用LC-MS-MS液质联用的方法。色谱柱：TOSOH TSKgel ODS column （15cm×4.6mm,3μm）；等度洗脱，流动相为甲醇:水（0.3%甲酸）比例为80:20（v/v），流速为0.6ml/min；柱温为30℃；6.2min内即完成这三种化合物的色谱分离分析。本实验采取甲醇沉淀蛋白的方法提取生物样品中的待测物以及内标地西泮。质谱离子源为电喷雾离子化源（ESI），检测方式为正离子检测，扫描方式采用多级反应监测（MRM）。三种倍半萜内酯的母子离子对分别为1-acetoxy-6α-hydroxyeriolanolide m/z为309.1/185.0,1β-hydroxy-alantolactone和ivangustin的m/z为249.0/231.1，内标化合物地西泮的m/z为285.0/193.0。
结果3种倍半萜内酯1-acetoxy-6α-hydroxyeriolanolid（e1-乙酰氧基大花旋覆花内酯）,1β-hydroxyalantolactone（1β-羟基-土木香内酯）和Ivangustin在6.2min内实现基线分离，其质量浓度分别在4-800ng/ml、8-500ng/ml、8-500ng/ml内线性良好。最低定量限（LLOQ）分别为4ng、8ng和8ng。这三种倍半萜内酯类成分口服给药的绝对生物利用度分别为18.70%、20.69%和21.39%。
结论通过验证，该方法简便、稳定、可行，适用于金沸草提取物中三种倍半萜内酯的药动力学研究。
关键词: 旋覆花属 ；高效液相色谱法 ；倍半萜内酯 ；含量测定 ；1-乙酰氧基大花旋覆花内酯 ；高效液相色谱法 ；含量测定 ；倍半萜内酯 ；含量测定 ；LC-MS-MS法 ；药代动力学 ；血浆
被引量
6
摘要： 贝壳杉烷型二萜是提取自绿色植物的天然产物，其基本化学结构为刚性骨架的四环二萜。植物中的贝壳杉烷类衍生物大多数具有较强的生理活性，可用做植物生长调节剂、抗菌剂、抗炎剂以及抗肿瘤细胞毒剂等。从凤尾蕨类植物半边旗(Pteris semipinnata L,简称PsL)中提取纯化的贝壳杉烷型二萜化合物lla-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸（简称5F），因具有不饱和环戊酮结构，抑制肿瘤细胞增殖的效果显著，成为抗肿瘤新药开发的热点。<br> 本文以岭南特有草药半边旗为原料，采用超临界萃取技术提取二萜类活性成分，采用柱层析技术分离纯化5F。针对该化合物难溶于水、在体内代谢快的特点，研究设计了半边旗5F微乳剂，以增加药物的溶解性、延长在体内的代谢时间，提高药物相对生物利用度，从而提高疗效。本课题利用MTT、Hoechst荧光染色、流式细胞技术等细胞生物学方法以及Western-blot等分子生物学方法和动物模型等药理实验对5F的抗肿瘤活性和体内代谢进行了研究。<br> 首先利用超临界萃取技术从草药半边旗中提取出抗癌活性二萜，并采用大孔树脂分离、硅胶柱色谱、重结晶等手段，分离纯化高纯度5F，运用光谱数据，鉴定化合物的结构。研究了超临界萃取中对产物收率和纯度的影响因素，包括夹带剂用量、萃取温度、压力、萃取时间、流体流率等，得到优化的超临界萃取工艺参数，萃取温度328.15 K，萃取压力30 MPa，二氧化碳流率160 kg/h，萃取时间4h，10％乙醇作为夹带剂。采用超临界萃取方法，5F的收率大约是常规溶剂提取方法的3倍，纯度则高9倍左右。超临界萃取产物经大孔树脂粗分离后，所得贝壳杉烷型二萜混合物经硅胶柱层析精制，采用薄板层析法确定层析的流动相为石油醚/丙酮/冰醋酸（7∶3∶0.05，V/V)混合溶剂。层析组分经两相重结晶分别得到两种高纯度贝壳杉烷型二萜4F和5F，质谱检测纯度分别为96％和94％。<br> 其次为提高化合物的生物利用度，研究制备了半边旗5F的微乳剂。采用水滴定法在室温下制备微乳，绘制拟三元相图，筛选出5F微乳的优化处方。半边旗5F微乳组成包括45％水，10％蓖麻油作为油相，15％ Cremorpher EL作为表面活性剂，30％的1，2-Propanediol和PEG-400(2∶1)混合物作为助表面活性剂，半边旗5F微乳的载药量达到20 mg/mL。透射电镜检测微乳粒径在50 nm以内，体外释放度略增。<br> 为研究半边旗提取物Ent-11 Q-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F)诱导的HepG2细胞凋亡及可能机制，通过MTT法检测细胞活性以研究HepG2细胞经不同浓度(5-80mg/L)5F处理24 h所导致的细胞毒作用，采用Hoechst/PI实验定性分析细胞凋亡，Western Blotting实验检测经5F处理的HepG2细胞线粒体内Bax水平，通过Western Blotting实验分析cyto c及AIF在胞浆内的水平。细胞活性分析证明，5F对HepG2细胞的细胞毒性随着5F浓度的提高而增强;HepG2经5F处理后，可观察到以细胞核凝聚为特征的凋亡细胞;经5F处理的HepG2细胞线粒体内Bax水平提高;经5F处理的HepG2细胞胞浆内cyto c及AIF水平增强。实验结果表明5F介导的细胞凋亡涉及线粒体依赖途径，并且5F可能对人类癌症细胞具有治疗价值，尤其是人肝癌(HCC)细胞。<br> 本文还研究5F微乳体内药代动力学及毒性作用。体内药代动力学研究表明5F微乳的相对生物利用度是普通混悬剂的616.15％。肝组织病理切片检查及血清标志物检测发现5F微乳剂无肝毒性。体内组织分布研究表明，肺组织的药物浓度4h后一直稳定在4.5μg·g-1左右，提示5F具有一定的肺靶向和缓释作用。<br> 以半边旗为原料，提取分离纯化了抗癌活性贝壳杉烷型二萜化合物5F，并对该化合物进行了体内外抗肿瘤活性研究以及微乳制剂研究，结果表明该化合物具有显著的抗肿瘤，值得开发为抗肿瘤尤其是肝癌用药。
关键词: 半边旗 ；贝壳杉烷型二萜 ；超临界萃取 ；分离纯化 ；抗肿瘤新药 ；活性成分
摘要： 姜黄为姜科姜黄属(Curcuma)多年生草本植物姜黄Curcuma longa L．的干燥根茎，在亚洲的热带地区广为栽培。姜黄作为传统中药具有多种功效，同时作为食品添加剂，不仅具有着色的作用，而且兼顾医疗及保健的功能，因此在国际市场上享有很高声誉，是联合国粮食与农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)所规定的使用安全性很高的天然色素之一。姜黄味苦、辛、性温，归脾、肝经，具有破血行气、通经止痛之功效。印度传统医学认为其可以治疗胆病、厌食、鼻炎、咳嗽、糖尿病、肝病、风湿病和窦炎等。现代药理研究表明姜黄具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗HIV等多方面作用。姜黄的化学研究表明挥发油及姜黄素为其主要活性成分。但迄今为止，对姜黄的研究多集中于药理、姜黄素的提取分离工艺等方面，姜黄的化学成分研究除姜黄素外报道较少。本论文对姜黄进行了较系统的化学研究，利用现代色谱分离手段，从姜黄的80％乙醇提取物中分离得到37个化合物，通过各种谱学数据(UV、NMR、MS)分析鉴定了36个化合物，包括一个没药烷类衍生物：(bisabola 4′-methyl-4′,10′-diene-9′-one-3′-yl)-(bisabola 4″-methyl-1″,4″-dihydroxy-5″,10″-diene-9″-one-3″-yl)-methane(1)；四个异没药烷类化合物：isobisabolone A(2)、isobisabolone B(3)、isobisabolone C(4)、isobisabolone D(5)；九个没药烷类化合物：turmerone A(6)、turmerone B(7)、turmerone C(8)、turmerone D(9)、turmerone E(10)、turmeronol B(11)、bisabolone(12)、bisabolone-9-one(13)、turmeronol A(14)；九个二苯庚烷类化合物：(E)-1-(1,2-dihydro-6-hydroxyinden-3-ylidene)-4-(4-hydroxyphenyl)butan-2-one (15)，(4E,6E)-2,5-epoxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one(16)、(1S)-1,5-epoxy-1-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-4,6-heptadien-3-one(17)、(1S)-1,5-epoxy-1-(4-hydroxyphenyl)-7-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-4,6-heptadien-3-one(18)、(1E,4E,6E)-1-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one(19)、1,7-bis(4-hydroxyl-phenyl)-3-hydroxy-1,3-heptadien-5-one(20)、姜黄素(21)、去甲氧基姜黄素(22)、双去甲氧基姜黄素(23)；二个Calebin类衍生物：4″-(3″′-methoxy-4″′-hydroxyphenyl)-2″-oxo-3″-butenyl-3-(4′-hydroxylphenyl)-propenoate(24)、4″-(4″′-hydroxyphenyl)-2″-oxo-3″-butenyl-3-(3′-methoxy-4′-hydroxyphenyl)-propenoate(25)；一个二苯戊烷类化合物：1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-(4-羟基苯基)-(1E，4E)-戊二烯-3-酮(26)；九个酚酸类衍生物：4-羟基-3-甲氧基苯丙烯醛(27)、阿魏酸甲酯(28)、4-羟基苯丙烯酸甲酯(29)、4-羟基苯甲醛(30)、4-羟基苯丙烯酸(31)、甲酰阿魏酸(32)、4-羟基苯丙烯醛(33)、香兰素(34)、反式阿魏酸(35)及一个甾醇类化合物：谷甾醇(36)。其中，1为具有新骨架的化合物；2-4为首次发现的异没药烷型倍半萜类化合物，15为首次发现的具有苯并戊烷结构的二苯庚烷类化合物，16为首次发现的具有五元呋喃环结构的二苯庚烷类化合物结构，6-8，17-19和24为新化合物；5为新的人工产物；9和25为新的天然产物；13和27-31为首次从该属植物中分离得到的化合物。上述研究结果丰富了姜黄化学成分的结构类型，同时为进一步的生物活性研究奠定了物质基础。
姜黄素类成分包括姜黄素、去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素。近年来研究表明姜黄素类成分具有抗肿瘤、调节血脂、抗HIV和抗老年痴呆等多方面药理作用。然而，口服姜黄素类成分体内血药浓度和生物利用度较低，代谢研究亦发现其生物转化率高，因此，代谢产物研究对口服用药的姜黄素类成分显得格外重要。在姜黄素类三种主要成分中，姜黄素的代谢研究报道较多，而去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素的代谢截止目前仅发现一篇有关体外实验研究的报道。去甲氧基姜黄素与姜黄素母核结构相同，但两端苯环的取代模式不同，其体内代谢与体外以及姜黄素的体内体外代谢是否一致尚不明确，为此，我们开展了对去甲氧基姜黄素的体内代谢研究。
利用现代色谱分离手段，从大鼠灌胃去甲氧基姜黄素的尿液及粪便中共分离得到了9个去甲氧基姜黄素的一相代谢产物，通过波谱学等手段确定它们的结构。其中7个为首次发现的代谢产物，分别为：5-去羟基-六氢去甲氧基姜黄素A(M-1)，5-去羟基-六氢去甲氧基姜黄素B(M-2)，5-去羟基-八氢去甲氧基姜黄素A(M-3)and 5-去羟基-八氢去甲氧基姜黄素B(M-4)，5-O-甲基-六氢去甲氧基姜黄素A(M-7)，5-O-甲基-六氢去甲氧基姜黄素B(M-8)，和5-去羟基-二氢去甲氧基姜黄素B(M-9)，2个已知的代谢产物为六氢去甲氧基姜黄素A(M-5)和六氢去甲氧基姜黄素B(M-6)。代谢产物1-4为从粪便中分离得到，5-9为从尿液中分离得到。
与以往姜黄素类化合物的代谢研究相比，本研究首次发现了脱羟基及O-甲基化还原代谢产物，同时还发现了多对异构体的存在，这些结果是对姜黄素类化合物代谢研究的有益补充。该部分研究不仅明确了去甲氧基姜黄素在大鼠体内的一相代谢途径，为今后其人体内代谢研究以及药代动力学研究提供参考，而且为进一步阐明其口服后体内发挥药效的作用形式奠定基础。
关键词: 姜黄 ；倍半萜 ；二苯庚烷类 ；去甲氧基姜黄素 ；大鼠 ；代谢
被引量
3
摘要： 《中药莪术有效物质及饮片规范化研究》来源于国家科技部“十五”攻关《中医药现代化研究与产业化开发》子课题《莪术饮片工艺及质量标准规范化研究》部分研究内容。论文对临床常用中药蓬莪术Curcuma phaeocaulis Valeton的历史沿革、有效活性物质基础及饮片规范化炮制工艺、质量标准进行了较为系统深入的研究。
莪术具行气破血，消积止痛功效。临床用于治疗症瘕痞块，瘀血经闭，食积胀痛；早期宫颈癌等症。其主要成分有挥发油及姜黄素类成分。挥发油主要具抗肿瘤、抗菌、升高白细胞等作用，而莪术活血化瘀止痛有效物质仍不明确。莪术临床常以醋制品入药，醋制后增强活血化瘀止痛作用。
论文通过以二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate，ADP）、胶原（collagen，COL）诱导的家兔体外血小板聚集；“血瘀”模型大鼠的全血粘度、血浆粘度、大鼠红细胞压积、血沉及大鼠血小板聚集；小鼠抗凝血的实验研究，揭示莪术不同提取物均具一定的抗血小板聚集、抗凝血及调节血液流变性作用。其中以乙酸乙酯、氯仿提取物及姜黄素活性最强，氯仿及乙酸乙酯提取物中以姜黄素类成分为主，首次证实莪术中姜黄素类成分为其活血化瘀主要活性成分。
莪术不同提取物对小鼠二甲苯所致的耳廓肿胀及醋酸所致的毛细管通透性增加有明显的抑制作用。以莪术挥发油及正丁醇提取物活性较强。同时各提取物对小鼠醋酸所致的扭体反应及热板法作用，以莪术乙酸乙酯、氯仿及正丁醇提取物活性较强。各提取物中均含姜黄素类成分，显示莪术中挥发油及姜黄素类成分为其镇痛抗炎主要活性成分。
采用高效液相色谱法测定莪术中姜黄素血药浓度进行药代动力学研究。将各组药液不同时间采血后所测的血药浓度值在计算机上用3P87软件进行
分析，结果姜黄素的体内过程符合单室模型一级吸收，测得药代参数为Ka=0.53(h-1)，Ke=0.10 h-1），T(peak)=3.89(h)，t1/2ka=1.32(h)，t1/2ke=6.89(h)，A=170.12(ng/ml)。该结果阐明了姜黄素的吸收、代谢过程，对莪术的临床合理应用、提高疗效提供科学依据。
采用溶剂法、色谱分离法提取分离莪术中的化学成分,用核磁共振等法鉴定其结构。分离并鉴定了5个化合物：异莪术烯醇（isocurcumenol）、莪术烯醇（curcumenol）、菠甾醇(spinasterol)、姜黄素（curcumin）、β-胡罗卜苷（β-D-Glucopyranoside）。其中β-胡罗卜苷为首次从莪术中获得，菠甾醇为首次从姜黄属植物中获得。
采用气相色谱－质谱法对莪术挥发油进行化学成分的分析。共鉴定出18个化合物。1-(1,1-二甲基乙氧基)-2-甲基-苯（1-(1,1-dimethylethoxy)-2-mthyl- Benzene）、4-乙炔基-4-羟基-3,5,5-三甲基环已烯酮（4-ethynyl-4-hydroxy-3,5,5-trimethyl-Cyclohexen）、10-甲基乙烯基,3,7-环癸二烯酮（10-(1-methylethenyl-3,7-Cyclodecadien)、1,3,5-三异丙基苯（1,3,5-triethyl-Benzene）、2,3-二氢-苯骈呋喃（2,3-dihydro-Benzofuran）等12个组分为首次从莪术中鉴定。
采用分光光度法、高效液相色谱法检测莪术中总姜黄素及姜黄素的含量。
莪术水处理软化切制工艺研究以姜黄素、挥发油含量为指标选择润制时间、蒸制时间、切制规格3个因素，用L9（3）4正交设计表，采用单指标和多指标综合两种分析方法进行水处理工艺的优选。结果其最佳水处理工艺为：润制20min，蒸制30min切制规格为3mm的饮片。
莪术醋制工艺优选，以姜黄素、挥发油含量为指标，选择炒制温度、炒制时间、用醋量、润制时间4个因素，用L9（3）4正交设计表，采用方差分析法。得莪术最佳醋炙工艺参数为：加入20%醋拌匀，闷润20分钟后，130
℃炒制5分钟。
采用GC-MS法分析炮制对莪术挥发油的影响。结果显示炮制后各制品的挥发油含量及组分均产生较大变化。醋制过程中1-(1,1-二甲基乙氧基)-2-甲基-苯、γ-榄香烯、2,4,6-五甲基苯胺、1,3,5-三乙基苯等成分消失，产生2个新的组分：4-异丙基苯甲酸（4-methylethyl-Benzoic acid）、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-环己酮（2-methyl-5-(1-methylethenyl)- Cyclohexanone）。
通过比较生莪术、醋煮莪术、醋炙莪术中总姜黄素及姜黄素含量。结果显示莪术经醋制后总姜黄素类成分含量变化不大，而姜黄素产生不同程度下降，制品中以醋炙品含量为高。
实验显示莪术不同炮制品均具有抗血小板聚集、抗凝血及调节血液流变性作用，其中以醋炙品作用最强。研究显示醋制后能显著增强其镇痛抗炎作用。
上述研究结果为阐明莪术的有效物质基础及制定莪术饮片规范化工艺及质量标准提供了科学的理论依据
关键词: 莪术,挥发油,姜黄素,药代动力学,炮制,有效物质
被引量
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