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摘要： 目的探讨Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2和TLR4在糖尿病大鼠肾脏巨噬细胞的表达水平及tacrolimus对其的调节作用。方法将40只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、tacrolimus(0.5、1.0 mg.kg-1)给药组,通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型,4周后测大鼠血糖、相对肾质量、尿白蛋白排泄率(UAER),应用免疫组化单染及双染方法检测肾组织ED-1+细胞、NF-κB-p-p65+细胞及ED-1+TLR2+细胞、ED-1+TLR4+细胞的表达。结果 ta-crolimus 1.0 mg.kg-1给药组大鼠相对肾质量明显低于模型组(P<0.05),tacrolimus(0.5、1.0 mg.kg-1)给药组大鼠UAER较模型组明显减少(P<0.05或P<0.01)。免疫组化显示:模型组大鼠肾组织ED-1+、ED-1+TLR2+、ED-1+TLR4+及NF-κB-p-p65+细胞数明显高于对照组(P<0.01),tacrolimus 0.5与1.0 mg.kg-1给药组ED-1+细胞数与模型组比较无差异,而ED-1+TLR2+、ED-1+TLR4+及NF-κB-p-p65+细胞数则明显低于模型组(P<0.05)。结论糖尿病大鼠肾脏巨噬细胞TLR2和TLR4的过度表达与巨噬细胞的活化及由此引发的炎症反应有关,tacrolimus可通过直接或间接作用下调肾脏巨噬细胞TLR2与TLR4表达,从而抑制与TLR-NF-κB信号转导及调控途径有关的炎症反应。
关键词: 糖尿病肾病 ；巨噬细胞 ；tacrolimus ；Toll样受体2 ；Toll样受体4 ；NF-κB
被引量
6
摘要： 背景与目的糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管的严重并发症之一，目前已逐渐成为导致终末期肾病的主要原因。DN的发病机制至今并不十分清楚，近年来炎症学说倍受关注，并认为由巨噬细胞所介导的炎症反应是导致DN持续发展的关键因素。然而处于静息或非活化状态的巨噬细胞并无损伤作用，只有被激活的巨噬细胞才能有效发挥其炎症效应。Toll样受体家族（TLRs）正是参与免疫炎症反应的一个关键因素，且认为是介导免疫和炎症反应的主体。Tacrolimus（FK506）作为一种新型的免疫抑制剂，临床主要用于器官移植、风湿免疫性疾病和难治性肾病等。我们先前的研究表明Tacrolimus可通过抑制钙神经蛋白（Calcineurin，CaN）及骨桥蛋白（0stepontin，OPN）等途径对糖尿病肾脏产生保护作用；进一步研究后发现Tacrolimus可抑制糖尿病肾脏巨噬细胞的激活，但具体机制不明。本研究将以巨噬细胞作为治疗靶点来探讨Tacrolimus对糖尿病肾脏内巨噬细胞Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）2和TLR4表达的调节作用。
方法采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导大鼠糖尿病模型，随机分为对照组（C）、模型组（Diabetes mellitus,DM）、Tacrolimus0.5mg·kg-1d-1给药组及Tacrolimus1.0mg·kg-1d-1给药组。Tacrolimus按0.5,1.0mg·kg-1d-1灌胃，正常组和模型组每日给予等量溶剂。4周后检测大鼠一般指标，包括血糖、体重、相对肾重（肾重/体重）(Relative weight of kidney，RKW)、尿白蛋白排泄率（Urinary albuminexcretion rate，UAER）等变化，并应用免疫组化单染及双染技术检测各组大鼠肾组织巨噬细胞浸润（单核/巨噬细胞表面特异性标志抗原ED-1+细胞），TLR2,TLR4,核转录因子-κB（NF-κB-p-p65）表达情况。
结果1.各组大鼠生化指标变化与对照组相比，模型组大鼠表现为血糖升高、体重下降、相对肾重增加，Tacrolimus各给药组没有防止大鼠血糖升高及体重下降。Tacrolimus0.5mg·kg-1d-1给药组大鼠相对肾重较模型组有所下降，但未达统计学意义，Tacrolimus1.0mg·kg-1d-1给药组大鼠相对肾重则明显低于模型组（P<0.05）。模型组大鼠UAER明显高于对照组（P<0.01），Tacrolimus给药4周组大鼠UAER水平明显低于模型组（P<0.05，0.01）。2.各组大鼠肾组织巨噬细胞浸润与NF-κB-p-p65表达情况，肾脏巨噬细胞TLR2,TLR4表达情况模型组大鼠肾组织浸润巨噬细胞数、NF-κB-p-p65+及TLR2+,TLR4+的巨噬细胞数明显高于对照组（P<0.01）。Tacrolimus0.5与1.0mg·kg-1d-1给药组大鼠肾组织浸润巨噬细胞数与模型组比较无明显差异，而NF-κB-p-p65+细胞数及TLR2+,TLR4+的巨噬细胞数则明显低于模型组（P<0.05）。
结论糖尿病大鼠肾脏巨噬细胞TLR2和TLR4的过度表达与巨噬细胞的活化及由此引发的炎症反应有关，Tacrolimus可通过直接或间接作用下调肾脏巨噬细胞TLR2与TLR4表达，从而抑制与TLR-NF-κB信号转导及调控途径有关的炎症反应。
关键词: 糖尿病肾病 ；巨噬细胞 ；Tacrolimus Toll样受体 ；NF-κB
摘要： 目的观察冬凌草甲素(oridonin,Ori)对2型糖尿病大鼠肾脏Toll样受体4(TLR-4)介导免疫炎症信号通路的影响,探讨其对糖尿病肾病的干预作用及可能机制。方法体内实验:选用8周龄、体重180-220g雄性SD大鼠32只,按随机数字表法分为正常对照组(NC组)、正常对照+Ori组(NCO组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+Ori组(DMO组),每组8只。体外实验:高糖(HG)培养大鼠肾小球系膜细胞,以TLR-4抑制剂TAK-242及Ori进行干预。NCO组和DMO组大鼠腹腔注射Ori10mg·kg^-1·d^-1,干预8周。检测各组大鼠生化指标,僀?镜下观察肾组织病理学改变。免疫组化检测肾组织TLR-4和巨噬细胞(CD68阳性细胞)表达;免疫荧光分析肾组织CD4^+、CD8^+T细胞表达;ELISA法检测肾组织和细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β水平;Westernblot法检测肾组织和细胞TLR-4、核因子-κappaB(NF-κB)蛋白表达。各组间比较采用单因素方差分析。结果(1)与NC组相比,DM组大鼠肾小球和肾小管间质CD68阳性细胞明显浸润(t=11.56、13.69,均P<0.05);与DM组相比,DMO组CD68阳性细胞表达减少(1.87±0.25比2.93±0.31、0.27±0.04比0.65±0.07,t=8.58、15.54,均P<0.05)。(2)与NC组相比,DM组大鼠肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高(分别为t=11.01-19.79,均P<0.05),而DMO组大鼠肾组织TNF-α、IL-6、IL-1β的水平较DM组显著减少(分别为t=11.72-17.18,均P<0.05)。(3)与DM组相比,DMO组大鼠肾组织TLR-4蛋白表达明显被抑制(0.28±0.06比0.55±0.12,t=7.89,P<0.05);与HG组(0.79±0.12)相比,高糖状态下给予Ori和TAK-242干预后细胞TLR-4蛋白表达明显减少(分别为0.49±0.05、0.42±0.10,t=9.13、9.63,均P<0.05)。(4)与DM组相比,DMO组肾组织p65蛋白表达水平明显降低(t=5.90,P<0.05)。与HG组相比,高糖状态下给予Ori和TAK-242干预后,细胞p65和IκBα磷酸化水平均显著减少(均P<0.05)。结论Ori可能通过抑制TLR-4/NF-κB介导的炎症信号,减少炎症细胞浸润和炎症因子表达,从而减轻糖尿病肾脏损害。
关键词: 糖尿病肾病 ；炎症 ；Toll样受体4 ；NF-κB ；冬凌草甲素
被引量
7
摘要： 目的探讨芍药苷(PF)通过Toll样受体2(TLR2)对糖尿病小鼠的肾脏保护作用。方法选用C57BL/6J及TLR2基因敲除(TLR2^(-/-))雄性小鼠,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导为糖尿病模型,分为模型组、PF干预[25、50、100mg/(kg·d)]组、TLR2^(-/-)模型组,另选取C57BL/6J及TLR2^(-/-)小鼠作为对照组(n=12)。实验12周末收集各组小鼠的血、尿及肾组织标本,测定血糖、体重、肾重以及24 h尿白蛋白排泄率(UAER);光镜下观察各组小鼠肾组织病理学改变;采用免疫组化检测肾组织中巨噬细胞(CD68阳性细胞)、TLR2、核因子κB p65(NF-κB p65)的表达;RT-PCR检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单细胞趋化因子-1(MCP-1)、白细胞介素1β(IL-1β)的mRNA的表达;Western blot检测肾组织TLR2、转接信号髓分化因子88(My D88)、磷酸化白介素受体相关激酶-1(p-IRAK-1)、诱生型一氧化氮合酶(i NOS)、NF-κB p-p65、NF-κB p65蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠血糖、肾重/体重、UAER升高,系膜扩张指数和肾小管间质损伤指数评分明显增加,免疫组化CD68、TLR2及NF-κB p65表达明显升高,炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1 mRNA表达及TLR2、My D88、p-IRAK-1、NF-κB pp65、NF-κB p65、i NOS的蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,PF干预组及TLR2^(-/-)模型组小鼠肾重/体重、UAER明显下降(P<0.01),但对血糖无影响(P>0.05),肾组织病理改变及巨噬细胞浸润程度减轻,炎症因子水平降低,TLR2及其下游信号通路蛋白的表达下降(P<0.05,P<0.01)。结论 PF通过抑制炎症反应发挥肾脏保护作用可能与下调TLR2信号通路有关。
关键词: 糖尿病肾病 ；芍药苷 ；TLR2 ；炎症
被引量
14
摘要： 目的观察利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾组织Toll样受体(TLR) 4/髓样细胞分化因子(MyD) 88信号转导通路中炎症因子的影响。方法健康SD雄性大鼠68只,随机分为正常对照组、模型组、利拉鲁肽组、二甲双胍组,每组17只。采用高脂高糖饮食饲养联合腹腔注射少量链脲佐菌素(STZ)法制备大鼠糖尿病肾病模型。利拉鲁肽组按0. 12 mg·kg^(-1)·d^(-1)的剂量皮下注射给药,二甲双胍组按140 mg·kg^(-1)·d^(-1)的剂量灌胃给药,正常对照组及模型组均给予等量溶媒,实验期间各组大鼠均无降糖干预,饲养8 w。检测尿蛋白、尿糖及血生化,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾组织形态学改变,免疫组化检测TLR4/MyD88蛋白表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠肾组织核因子(NB)-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-6含量。结果与正常对照组相比,模型组、利拉鲁肽组、二甲双胍组24 h尿蛋白含量、24 h尿糖、血肌酐、尿素氮及血糖水平明显升高,TLR4/MyD88蛋白表达明显增多,NB-κB、TNF-α、IL-6含量明显上升(均P<0. 05)。与模型组相比,利拉鲁肽组、二甲双胍组24 h尿蛋白含量、24 h尿糖、血肌酐、尿素氮及血糖明显下降,TLR4/MyD88蛋白表达明显降低(P<0. 05),NB-κB、TNF-α、IL-6表达明显下降(P<0. 05)。结论利拉鲁肽能对糖尿病大鼠肾脏产生保护,其机制可能与其通过调控TLR4/MyD88信号通路抑制炎症因子NB-κB、TNF-α、IL-6的表达有关。
关键词: 利拉鲁肽 ；糖尿病肾病 ；TLR4/MyD88转导通路
被引量
11
摘要： 目的:探讨霉酚酸酯对糖尿病肾病大鼠肾脏Toll样受体-4(TLR4)及白细胞介素-18(IL-18)表达的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为对照组(n=12)、模型组(n=11)、治疗组(n=11),后2组制作糖尿病肾病模型。治疗组每天给予霉酚酸酯15 mg/kg灌胃,余2组给予溶媒灌胃。于12周末采用HE染色、PAS染色观察肾脏病理改变,免疫组化、Western blot检测肾组织TLR4、IL-18蛋白的表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠肾小球体积增大,基底膜增厚,炎症细胞浸润明显,而治疗组较模型组有所改善。3组大鼠肾组织TLR4、IL-18蛋白的表达差异有统计学意义,其中模型组大鼠肾组织TLR4、IL-18蛋白的表达均高于对照组(P<0.05),治疗组上述2指标较模型组下降(P<0.05)。结论:霉酚酸酯可能通过下调肾脏TLR4、IL-18蛋白的表达对糖尿病肾病大鼠的肾脏起保护作用。
关键词: 糖尿病肾病 ；霉酚酸酯 ；TLR4 ；IL-18 ；大鼠
被引量
6
摘要： 目的观察糖肾灌肠方联合缬沙坦对2型糖尿病肾病的疗效及对大鼠肾脏组织Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)表达的影响。方法选取无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级8周龄SD雌性大鼠60只,适应性喂养7 d后,随机选取10只作为空白对照组,其余50只进行右侧肾脏摘取手术,构建2型糖尿病肾病大鼠模型。造模过程中死亡10只,造模成功的40只大鼠随机分为模型组、糖肾灌肠方干预组(糖肾灌肠方0.13 mL/10 g)、缬沙坦干预组(缬沙坦0.12 mg/10 g,)、缬沙坦+糖肾灌肠方干预组(糖肾灌肠方0.13 mL/10 g联合缬沙坦0.12 mg/10 g),每天1次,连续灌肠4周。观察5组大鼠空腹血糖水平,肾组织形态学改变情况,尿蛋白、尿素氮(Urea nitrogen,BUN)及肌酐(Creatinine,Cr)水平,肾湿质量及肾脏肥大指数,TLR2、TLR4信使核糖核酸(Messenger RNA,mRNA)及蛋白表达情况。结果与空白对照组比较,各造模组血糖和尿蛋白含量均显著升高(P<0.05);与模型组比较,糖肾灌肠、缬沙坦干预组与缬沙坦+糖肾灌肠方干预组的血糖降低但差异无统计学意义(P>0.05),糖肾灌肠方干预组、缬沙坦片干预组及缬沙坦+糖肾灌肠方干预组的尿蛋白含量下降(P<0.05),且缬沙坦+糖肾灌肠方干预组的尿蛋白含量显著下降(P<0.05)。与空白对照组比,模型组肾组织病变显著,如肾小管扩张、纤维化、炎性细胞浸润及坏死细胞脱落;与模型组比较,糖肾灌肠干预方组和缬沙坦片干预组的大鼠肾小管扩张程度、炎性细胞浸润及坏死细胞脱落情况有所减轻,缬沙坦+糖肾灌肠方干预组的大鼠肾小管基本无扩张,仅有少量炎性细胞浸润及坏死细胞脱落,肾脏结构更接近空白对照组。与空白对照组比较,模型组的血清Cr含量、粪便Cr含量、血清BUN含量、血/粪BUN比值、肾湿重、肾肥大指数、TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白及TLR4蛋白表达均显著升高(P<0.05);与模型组比较,糖肾灌肠方干预组、缬沙坦干预组及缬沙坦+糖肾灌肠方干预组以上指标均下降(P<0.05),且缬沙坦+糖肾灌肠方干预组的降幅最大。结论糖肾灌肠方联合缬沙坦治疗2型糖尿病肾病效果更佳,并能抑制大鼠肾脏组织TLR2、TLR4表达,因此值得在临床上推广应用。
关键词: 糖肾灌肠方 ；缬沙坦 ；糖尿病肾病 ；炎症因子
被引量
1
摘要： 目的探讨糖尿病大鼠肾脏中Toll样受体4(TLR4)的表达及与巨噬细胞浸润的关系。方法 STZ注射制备糖尿病大鼠模型。用免疫组织化学法检测大鼠肾脏巨噬细胞的浸润及TLR4的表达。用Western blot及RT-PCR方法检测大鼠肾脏TLR4蛋白及mRNA的表达。结果成模后,TLR4在肾小管的表达增加。DM组大鼠2、4、8周TLR4/β-actin表达高于NC组。DM组2、4、8周TLR4/GAPDH mRNA表达均高于NC组。DM组4、8周肾间质巨噬细胞浸润数均高于NC组。结论在糖尿病大鼠肾脏中,TLR4表达上调,与炎症浸润相关。
关键词: Toll样受体4 ；糖尿病 ；大鼠
被引量
3
摘要： 目的探讨白芍总苷对糖尿病大鼠肾组织巨噬细胞Toll样受体2与4表达的影响。方法建立链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型，将大鼠随机分对照组、模型组、白芍总苷给药组（50，100，200mg／kg／d灌胃）。8周后选用免疫组化单染及双染方法检验大鼠。肾组织巨噬细胞Toll样受体2、Toll样受体4以及核因子-kB-p-p65的表达。结果白芍总苷给药组（50，100，200mg／kg）鼠肾重／体质量以及尿蛋白水平明显低于模型组。白芍总苷给药组（50mg／kg）大鼠肾小球平均容量明显低于模型组，白芍总苷给药组（100与200mg／kg）平均容量与肾小管-间质损伤指数均明显低于模型组。模型组肾组织ED-1’细胞数明显高于对照组，白芍总苷给药组（50，100，200mg／kg）ED-1’细胞数较模型组明显下降，模型组。肾组织ED-1’Toll样受体2’、ED-1’Toll样受体4’以及核因子-kB-p-p65’细胞表达明显高于对照组，白芍总苷给药组（50，100，200mg／kg）肾组织中ED-1’Toll样受体2’、ED-I’Toll样受体4‘以及核因子-kBp-p65’细胞明显低于模型组。结论白芍总苷对于减少糖尿病大鼠早期肾脏损害有明显作用，其中与抑制糖尿病大鼠肾组织巨噬细胞Toll样受体2与4表达可能部分相关。
关键词: 巨噬细胞 ；大鼠 ；糖尿病
被引量
3
摘要： 目的探讨他克莫司对糖尿病大鼠肾组织巨噬细胞浸润及Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法将30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组及治疗组，每组均为10只，后2组制作糖尿病模型，治疗组每天给予他克莫司0．5mg／kg灌胃，余2组给予溶媒灌胃。8周后检测大鼠部分生化指标并采用免疫组化法检测肾组织内巨噬细胞表面抗原ED-1及TLR4的表达。结果与对照组比较，模型组及治疗组大鼠尿白蛋白排泄率（Urinary albumin excretion rate,UAER）明显升高（P〈0．05），而治疗组较模型组有所改善（P〈0．05）；模型组大鼠肾组织ED-1＋及ED-1＋、TLR4＋的巨噬细胞细胞数均高于对照组（P〈0．05），治疗组ED-1＋的巨噬细胞数较模型组无统计学差异，而ED-1＋、TLR4＋的巨噬细胞数较模型组下降（P〈0．05）。结论他克莫司可减轻糖尿病大鼠的肾损害，其机制可能与下调肾脏巨噬细胞TLR4的表达有关。
关键词: 糖尿病肾病 ；他克莫司 ；巨噬细胞 ；TLR4
摘要： 目的探讨Toll样受体2激动剂对糖尿病小鼠肾损害的影响。方法链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立小鼠糖尿病模型。将糖尿病小鼠分成两组,糖尿病对照组(DM组)和Toll样受体2激动剂干预组(干预组)。用免疫组化方法检测小鼠肾脏巨噬细胞的表达。比较干预组与糖尿病对照组小鼠的血清肌酐、尿素氮、尿白蛋白排泄率以及肾脏巨噬细胞的表达。结果干预组血清肌酐、尿素氮水平以及肾脏巨噬细胞的表达均较DM组增加(P<0.01),伴随蛋白尿的加重。病理学观察结果发现:在DM组,可以看到肾小球体积增大,肾小球囊腔缩小,系膜区增宽,基底膜增厚,以及肾小管肥大。在干预组,上述变化更为显著。结论 Toll样受体2激动剂加重了糖尿病小鼠蛋白尿、肾小球硬化、肾小管损伤、炎症细胞浸润,证实Toll样受体2激动剂可加重糖尿病小鼠肾损害。
关键词: 小鼠 ；糖尿病 ；肾损害 ；Toll样受体2激动剂
被引量
2
摘要： 2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）的发病率和死亡率居世界前十,常伴有心脑血管疾病、失明、截肢等并发症而导致残疾,在全球范围内构成了严重的健康和经济挑战[1]。据中国一项调查资料显示,2013年我国成年人糖尿病标化患病率高达10.9%,其中T2DM比例达到90%以上[2]。另外一项在全球范围内的研究估计,在2013年中国有0.984亿的成年人患糖尿病,到2035年将达到1.427亿人,中国已成为糖尿病患者人数最多的国家[3]。因此,迫切需要制定控制疾病发生发展的方法。免疫系统与全身代谢的双向作用多年来已被公认,免疫失衡-代谢负荷在T2DM的胰岛素抵抗（Iusulin resistance,IR）和胰岛β细胞损伤中的作用也逐渐得到重视[4,5],免疫代谢是目前癌症、糖尿病和肥胖等多种疾病的一种新的治疗靶点。此外,一项重要的研究明确了炎症信号通路与糖代谢的关系,T2DM作为一种慢性炎症性疾病得到广泛认可[6]。T2DM是先天免疫系统普遍激活的结果,其中也存在着细胞因子介导的慢性炎症[7,8]。因此可以看出,免疫系统和炎症机制都参与了T2DM的发生和发展。大量证据表明内源性阿片肽和阿片结合位点在包括人类在内的多种动物的内分泌腺体胰腺中均有表达[9,10],内源性阿片肽通过与阿片受体结合来发挥作用,提示这些肽也可能在胰腺的分泌调节中发挥作用,从而影响糖代谢。蛋氨酸脑啡肽（Methionine enkephalin,MENK）是一种由五个氨基酸tyr-ala-ala-pheo-met组成的内源性阿片肽,由前脑啡肽衍生而来。已有研究表明MENK是免疫和神经内分泌系统之间的重要中介,通过与阿片类受体delta（d-,DOR）,kappa（k-,KOR）和mu（m-,MOR）结合来调节先天和适应性免疫[11]。MENK是一种免疫调节因子,可调控树突状细胞、巨噬细胞和CD4+T淋巴细胞,以及活化和调节上皮细胞及间充质细胞[12-16]。自身免疫性慢性炎性疾病的发生发展近年来被认为是因为激活了自身反应性CD4+T辅助细胞（T helper cell,Th）[17,18]。目前已知幼稚Th0细胞在细胞因子的影响下可以分化为特定的Th细胞亚群,如Th1、Th2、Th17、Th22和Treg等[19]。Th1细胞可以产生促炎细胞因子,如IFN-γ、TNF-a、IL-2等,支持细胞免疫,促进炎症反应、细胞毒性反应和迟发性超敏反应。Th2细胞可以分泌抗炎细胞因子,如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等,支持体液免疫,下调Th1细胞支持的炎症反应[20-22],Th1/Th2细胞比例平衡对维持机体免疫稳态具有重要意义。最近的研究表明胰岛间充质细胞来源的IL-33在胰岛中能够协调免疫与代谢之间的相互作用,当处于糖尿病环境（葡萄糖、IL-1β和棕榈酸刺激）时胰岛间充质细胞产生IL-33明显加强[23]。II型固有淋巴样细胞（Group II innate lymphoid cells,ILC2s）是连接先天性免疫与适应性免疫应答间的细胞,其作为二者间的桥梁被认为是第一个激活Th2型细胞免疫反应的细胞,能够强化机体免疫反应,延缓适应性免疫应答的启动[24]。研究还发现IL-33在胰岛内的反应细胞为ILC2s,IL-33可以与ILC2s表面的ST2结合诱导Th2反应、促进胰岛素分泌[23],这样就把胰岛细胞中的免疫和代谢协调起来。IL-33/ST2通路可以防止不适当的、特异性的Th1极化反应,并诱导IL-4和IL-13的产生,由此维持Th2细胞的极化状态。而ILC2s除了产生IL-4和IL-13外还可以分泌MENK,体外实验发现IL-33可以刺激ILC2s使MENK分泌增多[24]。Toll样受体（TLR）信号通路通过髓样分化因子88（MyD88）和TNF受体相关因子（TRAF）起作用,激活核转录因子-κB（NF-κB）p65,促进细胞因子分泌和炎症反应[25],而有研究表明ST2可能是Toll样受体（TLR）信号传导的一个强有力的负调控因子,ST2在树突状细胞的表达上调可增加对促炎、刺激诱导成熟的耐受性[26]。所以MENK可能通过上述途径调节糖代谢,然而到目前为止关于MENK对糖尿病的影响研究很少。目的:研究MENK对T2DM大鼠血糖和胰岛素分泌的影响及高糖高脂诱导损伤的大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的作用;进一步探讨MENK的可能作用机制,研究MENK是否通过与阿片受体结合发挥调节免疫作用,并检测MENK对相关免疫学指标Th1和Th2的影响,分析MENK通过影响IL33/ST2通路发挥调节炎症信号通路的作用,从而阐明MENK对T2DM作用的分子机制,为T2DM的治疗提供新的思路和理论依据。本研究分如下三部分进行:第一部分:2型糖尿病与炎症及免疫异常关系的研究。第二部分:蛋氨酸脑啡肽对2型糖尿病炎症及免疫异常干预效应的研究。第三部分:IL-33/ST2通路在蛋氨酸脑啡肽调节2型糖尿病炎症及免疫异常中作用的研究。研究方法:1、高糖高脂饮食喂养联合小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射法建立T2DM大鼠模型;2、正常大鼠及T2DM大鼠再随机分为对照组,MENK处理组及MENK+纳曲酮（NTX）处理组;3、记录大鼠体重,血糖仪测定大鼠尾静脉血糖;4、苏木素-伊红（HE）染色大鼠胰腺组织研究病理变化;5、免疫组织化学（IHC）染色法研究胰腺组织内三种阿片受体表达部位及表达含量;6、高糖高脂培养诱导大鼠INS-1细胞的体外β细胞损伤模型,并将细胞分组培养于加入MENK及NTX的培养基中;7、葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验评估高糖高脂培养对INS-1细胞的功能损伤;8、酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠血清及INS-1细胞培养上清液中胰岛素、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-2、IL-5和IL-10含量;9、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time RT-PCR）检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR三种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的基因表达量;10、Western blot方法检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR三种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的蛋白表达量。结果:1、MENK对大鼠的作用1.1高糖高脂喂养联合小剂量STZ腹腔注射可成功建立T2DM大鼠模型,T2DM大鼠的血糖升高达到模型标准,多尿、多饮、多食及体重下降的典型糖尿病症状明显,血清胰岛素水平较正常组下降;应用不同剂量MENK腹腔注射均能降低T2DM大鼠的血糖水平,增加血清胰岛素水平,同时可改善T2DM引起的体重下降,差异具有统计学意义。1.2 MENK对大鼠胰腺组织形态学的影响:胰腺组织HE染色结果发现,正常大鼠胰腺中可以观察到成团的胰岛β细胞,β细胞的大小一致,核染色质清晰,具有清晰的细胞质边界和清晰的结缔组织。与正常大鼠相比,T2DM大鼠胰岛β细胞分布稀疏且不均匀,数量减少,形态不一,细胞质的界限模糊;MENK处理后的T2DM大鼠的胰岛β细胞数量明显增加,边缘较圆,细胞质稍不均匀,核仁清晰,细胞排列均匀,MENK干预可改善胰腺组织形态,维持其正常功能。1.3阿片受体在大鼠胰腺中的表达:通过IHC染色看出阿片受体DOR、MOR和KOR均在胰腺组织内表达,其中KOR的表达含量很低。结合IHC染色、real-time RT-PCR及Western blot的结果,T2DM大鼠胰腺阿片受体含量较正常大鼠减少,MENK可增加T2DM大鼠阿片受体表达,差异有统计学意义。1.4 T2DM大鼠胰腺内IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量均较正常大鼠增加;MENK干预减少了T2DM大鼠胰腺内上述分子的表达量。1.5 T2DM大鼠血清中存在明显的Th1/Th2细胞因子平衡紊乱,表现为Th1型细胞因子TNF-a及IL-2升高,而Th2型细胞因子IL-5及IL-10降低;MENK可通过降低血清中TNF-a及IL-2含量及增加IL-5及IL-10的含量来调节Th1/Th2细胞因子的平衡。2、MENK对大鼠INS-1胰岛β细胞瘤细胞的作用2.1高糖高脂培养INS-1细胞后形成明显的糖脂毒性,细胞数量减少,胰岛素分泌量下降;MENK共培养后能够增加细胞数量、改善细胞形态、增加胰岛素分泌量。GSIS实验同样证实MENK可以改善糖脂毒性造成的INS-1细胞胰岛素储备分泌障碍。2.2 MENK可增加高糖高脂培养的INS-1细胞中阿片类受体的表达水平;下调IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量;MENK可明显调节INS-1细胞分泌的Th1/Th2细胞因子的平衡;以上结果与体内实验结果趋势相符。结论:MENK可通过与阿片类受体结合进而调节免疫反应和抑制炎症反应,达到降低血糖、刺激胰岛分泌胰岛素的作用,MENK可能作为一种治疗T2DM的新方法及辅助其他降糖治疗的手段发挥临床应用潜力。
关键词: 2型糖尿病 ；蛋氨酸脑啡肽 ；阿片受体 ；胰岛素分泌
被引量
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摘要： 研究背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）作为急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）常见并发症,与ACS预后密切相关,且两者互为因果,形成恶性循环。早期识别AKI,并对高危人群予以早期干预,具有重要的临床意义。目前,临床上仍然以血肌酐（serum creatine,Scr）和尿量作为诊断AKI的主要依据。但Scr变化并不能实时反映肾脏功能,Scr变化晚于肾小球滤过率（glomerular filtration rate,GFR）的变化,同样的,尿量则更容易受到多种因素影响,如容量状态、药物等非肾脏因素。因此,在AKI诊断中,Scr以及尿量水平是一种延迟的、不可靠的指标,在临床上我们需要新的早期标志物早期识别AKI高危患者,及时给予相应处理,改善患者预后。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL）及钙卫蛋白是目前两种新型AKI早期诊断生物标志物。研究表明,血清NGAL水平可以预测高危ACS患者冠状动脉造影后血液透析的发生率,同时也是脓毒症患者、重症监护患者或急症患者AKI的诊断和预后良好生物标志物。NGAL在不同组织类型中以非常低的恒定水平表达,在发生急性肾损伤后,NGAL表达明显上调,后随肾功能改善,血浆NGAL水平明显下降;AKI患者病情越严重,其血浆NGAL水平越高,并且血浆中NGAL水平随肾功能改善逐步下降。血浆钙卫蛋白是危重外科手术患者AKI的良好生物标志物。在重症监护室脓毒症患者中,血浆钙卫蛋白在脓毒症AKI患者中的表达明显高于非AKI患者,血浆钙卫蛋白可以早期预测脓毒症AKI的发生。体外循环的心脏手术后7天内发生AKI的患者术后即刻钙卫蛋白水平显著升高,心脏手术后即刻血浆钙卫蛋白水平可预测AKI的发生,且与年龄无关,血浆钙卫蛋白是与心脏手术相关的AKI的早期标志物。虽然既往研究显示NGAL及钙卫蛋白是脓毒症、危重症及心脏术后等疾病相关AKI早期诊断的良好生物标志物,但ACS相关AKI（ACS-AKI）相较于脓毒症、危重症及心脏术后AKI的发病机制不同,NGAL及钙卫蛋白能否作为ACS-AKI的早期生物标志物尚不明确。本研究的主要目的是评估NGAL及钙卫蛋白在ACS-AKI早期诊断中的作用以及血浆NGAL和钙卫蛋白两者联合应用在早期诊断ACS-AKI中的价值。研究目的（1）筛选ACS-AKI的危险因素,分析其与血浆钙卫蛋白、NGAL的相关性;（2）血浆钙卫蛋白、NGAL单一指标应用在ACS-AKI早期诊断中的价值;（3）血浆钙卫蛋白、NGAL两指标联合应用在ACS-AKI早期诊断中的价值。研究对象与方法前瞻性纳入烟台毓璜顶医院心内科收治的172例ACS患者,其中男性110例（64%）,女性62例（36%）,该研究通过了烟台毓璜顶医院伦理委员会审查和批准。纳入标准:年龄超过18岁,符合ACS的诊断,并出现症状后48小时内入院。排除标准:需要慢性腹膜或血液透析治疗的慢性肾脏疾病、肾移植、炎症性肠病、恶性肿瘤、感染、肝脏、甲状腺疾病、肺部疾病、自身免疫疾病及正接受抗炎药物治疗患者。所有纳入的患者在入院时和入院后每天检测Scr水平。AKI诊断根据急性肾损伤网络（Acute kidney injury network,AKIN）标准确定,定义为Scr突然（48小时内）升高≥0.3 mg/dL,Scr百分比升高大于或等于50%（比基线增加1.5倍）,或需要肾替代治疗。根据AKI诊断将患者分为AKI组和非AKI组。收集的临床资料包括:（1）入院时的年龄、性别、ACS类型、血压等基本信息;（2）高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、蛋白尿病史及既往用药史;（3）入院时实验室资料及辅助检查,如B型钠尿肽（Brain Natriuretic Peptide,BNP）、白细胞（White blood cell counts,WBC）、血红蛋白（Hemoglobin,Hb）、肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB）、肌钙蛋白I（Cardiac troponin I,cTnI）、乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase,LDH）、低密度脂蛋白胆固醇（Low Density Lipoprotein cholesterol,LDL）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、Scr由医院中心实验室检测。彩色多普勒超声心动图进行心脏结构及功能评估并测定左心室射血分数（Ejection Fraction,EF）。在入院时（6小时内）尽快获得用于钙卫蛋白和NGAL检测的血液样本,并在-80℃下保存用于批量分析。使用酶联免疫吸附测定试剂盒（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）进行血浆钙卫蛋白和血浆NGAL的测定,操作方法及步骤严格按照说明书的要求进行。进行生物标志物分析的研究人员对AKI诊断是不知情的。结果1.患者的一般临床特点及AKI的患病率研究共纳入172例ACS患者（158例在住院期间进行了血管造影或经皮冠状动脉介入治疗）,其中包括72例急性ST段抬高型心肌梗死（Acute ST segment elevated myocardial infarction,STEMI）患者、35例急性非ST段抬高型心肌梗死（Non-ST segment elevation myocardial infarction,NSTEMI）患者和65例不稳定性心绞痛（Unstable angina,UA）患者。共有23例患者（STEMI,N=16;NSTEMI N=6;UA,N=1）诊断为AKI。本研究中AKI的患病率为13.4%。大多数AKI患者为1期肾损伤（87%）且住院期间没有患者需要透析。2.AKI组和非AKI组间一般临床特点无显著性差异在本研究中,AKI组与非AKI组在年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症、既往用药、蛋白尿、入院时CK-MB、肌钙蛋白I、BNP以及住院期间是否行血管造影或经皮冠状动脉介入治疗等方面无显著差异（P>0.05）。3.与非AKI组相比,AKI组中STEMI占比更高与非AKI组相比,AKI组中STEMI患者占比更高（69.6%vs 37.6%,P=0.006）,而UA的占比更低（4.3%vs 42.9%,P<0.001）。以上结果说明,相较于NSTEMI和UA患者,STEMI患者更容易发生AKI。4.与非AKI组相比,AKI组GRACE风险分层更高与非AKI组相比,AKI组的GRACE评分均值更高（144.25±28.54 vs 115.47±34.93,P=0.027）,同样,AKI组中GRACE高危风险分层的占比也更高（56.5%vs 20.1%,P<0.001）。以上结果说明,相较于低风险分层患者,高风险分层ACS患者更容易发生AKI。5.与非AKI组相比,AKI组入院肾功能更差与非AKI组相比,AKI组的入院时Scr更高（106.50±18.14 vs 72.07± 13.59 μmol/L,P<0.001）,入院时eGFR较低（54.84±14.02 vs 88.65±18.68 mL/min,P<0.001）,提示既往肾功能受损患者发生AKI的风险更高。6.AKI组相较于非AKI组有更高的炎症水平与非AKI组相比,AKI组的LDH（960.56±943.36 vs 475.24±438.23 U/L,P=0.014）、WBC（11.98±3.89 vs 8.74±3.97 ×109/L,P= 0.041）均有明显升高,提示AKI组相较于非AKI组有更高的炎症水平。7.与非AKI组相比,AKI组的心功能更差与非AKI组相比,AKI组的EF更低（53.57±11.07%vs.62.27±5.92%,P=0.003）,提示AKI组的心功能更差。8.与非AKI组相比,AKI组血浆钙卫蛋白、NGAL均明显升高AKI组与非AKI组血浆钙卫蛋白、NGAL的比较结果显示,与非AKI组相比,AKI组血浆钙卫蛋白（5942.26±1955.88 ng/mL vs.3210.29±1833.60 ng/mL,P<0.001）和血浆NGAL（164.91 ±43.63 ng/mL vs.122.48±27.33 ng/mL,P<0.001）更高。9.ACS-AKI的决定因素单因素分析显示,GRACE评分高危危险分层、钙卫蛋白、血浆NGAL、入院eGFR、STEMI与AKI相关。同时,多元logistic回归分析显示血浆钙卫蛋白（OR=1.001;P=0.007）和血浆NGAL（OR=1.040;P=0.002）的水平与AKI独立相关。GRACE评分危险分层和STEMI也是AKI的独立危险因素。10.血浆钙卫蛋白和NGAL可以作为ACS-AKI的早期诊断生物标志物血浆钙卫蛋白、NGAL、入院Scr对于AKI识别的受试者工作特征曲线下面积以及钙卫蛋白、NGAL联合应用对于AKI识别的曲线下面积结果显示,钙卫蛋白和NGAL两种血浆生物标志物对AKI均具有显著的早期识别能力（钙卫蛋白曲线下面积0.864,P<0.001;NGAL曲线下面积0.850,P<0.001）,且两者均优于Scr（曲线下面积0.778,P<0.001）。钙卫蛋白的敏感性为88.9%,特异性为76.8%,截断值为4506.62 ng/mL;NGAL的敏感性为77.8%,特异性为80.4%,截断值为135.69 ng/mL。11.血浆钙卫蛋白和NGAL联合应用可以提高对ACS-AKI的早期诊断能力钙卫蛋白与NGAL联合应用的曲线下面积为0.898（P<0.001）,高于钙卫蛋白的曲线下面积0.864以及NGAL的曲线下面积0.850,提示钙卫蛋白与NGAL联合应用相对于钙卫蛋白或者NGAL单指标具有更好的早期发现AKI的能力。血浆钙卫蛋白联合NGAL的阳性预测值和阴性预测值分别为0.44和0.98。结论本研究表明,血浆钙卫蛋白和NGAL可以作为ACS-AKI的早期诊断生物标志物,两者联合应用相较于单一指标可以更好的早期识别AKI。研究背景急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）是急性心血管疾病的常见类型,严重危害人类健康。急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是ACS的常见并发症之一,ACS相关AKI（acute coronary syndrome associated acute kidney injury,ACS-AKI）的发生率约为12.0%37.0%。肾功能的恶化可使心功能障碍进一步恶化并产生恶性循环,增加治疗成本,严重影响患者预后。深入研究ACS-AKI的发病机制,有针对性的探索其早期诊断方法,探索优化的预防和治疗措施,具有重要的临床意义。目前,钙卫蛋白是AKI早期检测、鉴别诊断和预后评估的生物标志物之一。既往研究及我们的前期研究均发现钙卫蛋白与ACS-AKI有关,钙卫蛋白作为ACS-AKI早期识别生物标志物优于肌酐、尿素氮等传统指标。但钙卫蛋白参与调控ACS-AKI的机制尚不清楚。钙卫蛋白是S100蛋白家族成员S100A8与S100A9的异二聚体,是一种固有免疫系统的激活剂,主要表达在中性粒细胞、单核细胞和早期分化的巨噬细胞等细胞表面,己证实可诱导细胞骨架重组、趋化和细胞因子表达。肾损伤时,肾小管上皮细胞可以释放钙卫蛋白到细胞外作为损伤相关模式分子,结合到细胞表面受体包括toll样受体4以及高级糖基化终产物受体,从而激活免疫效应细胞,参与中性粒细胞的招募、炎性因子及黏附分子的诱导生成等病理生理过程,促进了肾损伤的发展。近有研究显示钙卫蛋白在缺血再灌注大鼠肾脏损伤中可以促进肾脏组织炎性细胞浸润,继而诱导炎性分子表达,从而造成肾小管上皮细胞的损伤。钙卫蛋白参与调节巨噬细胞介导的AKI,其不仅通过凋亡通路,同时可以直接诱导内皮细胞间连接的丧失触发细胞死亡,
关键词: 钙卫蛋白 ；NGAL ；急性冠脉综合征 ；急性肾损伤 ；钙卫蛋白 ；急性冠脉综合征 ；急性肾损伤 ；CD36
摘要： 研究背景及目的:糖尿病已经成为全球重大公共卫生问题,全球约4.5亿人患有糖尿病,在我国18岁以上人群中发病率高达10.8%,其中90%以上为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）。T2DM发病率高,并发症多,远期危害大,治疗经济负担重,是亟需深入研究的重大慢性疾病。外科手术治疗是治疗肥胖合并T2DM的有效手段,其确切的疗效让人看到根治T2DM的希望。Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Y gastric bypass,RYGB）是代谢手术的主流标准术式之一,其抗T2DM作用较其他术式更持久且不易复发反弹。但由于RYGB术创伤较大、术后腹泻、严重营养不良等并发症较常见、改变人体正常肠道解剖不利于术后胃肠疾病管理等不利因素,目前还难以在体重正常的T2DM患者中合理开展。但RYGB术后即时的缓解T2DM效果证实其存在独立于限制能量摄入所导致体重下降之外的抗T2DM机制。明确这些机制将有助于RYGB治疗T2DM效果的药物转化。但RYGB缓解T2DM的机制十分复杂,目前尚未完全明确。脂肪组织是发生胰岛素抵抗的主要部位,在T2DM发生发展中具有重要作用。脂肪组织分为储能的白色脂肪组织（White adipose tissue,WAT）及高效耗能的棕色脂肪组织（Brown adipose tissue,BAT）,两者之间在一定条件下能发生表型的转化。其中,WAT向BAT的转化称为脂肪组织的棕色化。近年来发现,脂肪组织的棕色化能有效增加葡萄糖的摄取与消耗,提高机体胰岛素敏感性,有望成为治疗肥胖及T2DM的新靶点。有研究发现RYGB具有促进脂肪组织棕色化的作用,脂肪组织棕色化有可能是RYGB缓解T2DM的重要机制之一,但其具体机制尚未完全明确。而脂肪组织棕色化与脂肪组织的炎症状态有关,RYGB术后肠道菌群的改变能降低肠源性细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的入血,降低LPS诱导炎症水平。但RYGB术后是否能通过下调LPS介导脂肪组织棕色化尚未完全阐明。综上所述,本研究拟通过肥胖T2DM大鼠模型明确RYGB术后LPS改变及其诱导炎症水平与脂肪组织棕色化之间的关系,进一步通过细胞实验探讨其具体机制,为RYGB缓解T2DM的机制及脂肪组织棕色化治疗肥胖及T2DM提供新的理论依据。第一部分RYGB对肥胖T2DM大鼠炎症水平及脂肪组织棕色化的影响目的:探讨RYGB对肥胖T2DM大鼠血清LPS、炎症因子水平、脂肪组织巨噬细胞浸润及棕色化的影响。方法:根据实验目的对正常SD大鼠及链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导肥胖T2DM大鼠分为正常对照组（Control,CON,n=6）、RYGB手术组（RYGB surgery,n=6）、假手术组（Sham surgery,Sham,n=6）及体重匹配组（Weight matched,WM,n=6）。检测术后4周各组间静脉血空腹血糖,血清胰岛素、LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10浓度差异,免疫组化染色评估各组脂肪组织巨噬细胞浸润情况,并通过实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative PCR,q PCR）及蛋白免疫印迹（Western blot,WB）测定各组脂肪组织中棕色化标志分子解偶联蛋白1（Uncoupling protein 1,UCP1）的表达差异。结果:RYGB组术后空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数（Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）、LPS、及TNF-α水平较Sham组（P<0.01）及WM组（P<0.05）明显降低。RYGB组IL-10水平显著高于Sham组（P=0.042）及WM组（P=0.034）。RYGB组BAT及WAT中CD68+巨噬细胞浸润数目较Sham组及WM组显著减少（BAT:P<0.01;WAT:P<0.05）,其中i NOS+M1型巨噬细胞数目明显减少（BAT:P<0.01;WAT:P<0.01）,而CD206+M2型巨噬细胞数目明显增多（BAT:P<0.05;WAT:P<0.01）。RYGB组较Sham组及WM组显著上调BAT及WAT中UCP1 m RNA表达（BAT:P<0.01;WAT:P<0.01）及蛋白表达（BAT:P<0.05;WAT:P<0.01）。UCP1表达与血清LPS水平显著负相关（m RNA:BAT,r=-0.561,P<0.001、WAT,r=-0.761,P=0.004;蛋白:BAT,r=-0.709,P<0.001、WAT,r=-0.614,P=0.001）。结论:RYGB能缓解肥胖T2DM大鼠炎症水平,下调血清LPS及TNF-α浓度,上调血清IL-10浓度,并能抑制脂肪组织以M1型巨噬细胞浸润为主的炎症背景,促进脂肪组织棕色化。脂肪组织棕色化水平与血清LPS浓度负相关。第二部分LPS在RYGB促进肥胖T2DM大鼠脂肪组织棕色化中的作用目的:验证LPS下降在RYGB术后缓解炎症水平及促进脂肪组织棕色化中的作用。方法:对正常SD大鼠及RYGB术后STZ肥胖T2DM大鼠分别给予腹腔连续注射LPS（150μg/kg/天×8周）及等量生理盐水,共分为四组:正常大鼠+生理盐水对照组（Normal Control,NC,n=5）、正常大鼠+LPS干预组（Normal+LPS,NL,n=5）、手术大鼠+生理盐水对照组（Surgery Control,SC,n=5）及手术大鼠+LPS组（Surgery+LPS,SL,n=5）。检测8周后各组空腹血糖,血清胰岛素、炎症因子浓度,脂肪组织巨噬细胞浸润情况及脂肪组织中UCP1的表达情况。结果:NL组给予LPS干预8周内,除第7周空腹血糖低于NC组外（P=0.048）,其余时间点间均无显著差异。SL组给予LPS干预后空腹血糖逐渐升高,LPS注射第5、7、8周空腹血糖显著高于SC组（5w:P=0.025;7w:P=0.017;8w:P=0.044）。第8周NL组HOMA-IR、血清胰岛素、IL-1β及TNF-α显著高于NC组（P<0.05）;SL组HOMA-IR、血清胰岛素、IL-1β及TNF-α明显高于SC组（P<0.05）;而SL组IL-10显著低于SC组（P=0.019）。LPS显著增加NL组及SL组BAT及WAT中CD68+巨噬细胞数目（NL vs.NC,P<0.01;SL vs.SC,P<0.01）,其中i NOS+M1型巨噬细胞数目明显增多（NL vs.NC,P<0.05;SL vs.SC,P<0.01）,SL组中CD206+M2型巨噬细胞数目明显减少（BAT:SL vs.SC,P=0.019;WAT:SL vs.SC,P=0.015）。LPS显著下调NL组及SL组BAT及WAT中UCP1 m RNA表达（NL vs.NC,P<0.05;SL vs.SC,P<0.05）及蛋白表达（NL vs.NC,P<0.05;SL vs.SC,P<0.01）。结论:LPS能升高RYGB术后肥胖T2DM大鼠的炎症水平,促进脂肪组织巨噬细胞炎性浸润并抑制棕色化,明显抑制RYGB对炎症及脂肪组织棕色化的作用。LPS可能是介导RYGB缓解炎症并促进脂肪组织棕色化的关键机制分子。第三部分LPS及M1、M2型极化巨噬细胞对脂肪细胞棕色化的作用及机制目的:探讨LPS及M1、M2型极化巨噬细胞对脂肪细胞棕色化的作用及机制。方法:分离原代大鼠皮下脂肪血管基质细胞,成脂诱导成脂肪细胞。通过LPS刺激由去甲肾上腺素及三碘甲状腺氨酸诱导的棕色样脂肪细胞。q-PCR及WB检测LPS刺激组（LPS,n=4）及PBS对照组（CON,n=4）的UCP1及Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）炎症相关分子表达差异。分离培养大鼠骨髓巨噬细胞,并诱导成M1、M2型极化巨噬细胞,分别与棕色化诱导原代脂肪细胞共培养后,检测单独脂肪细胞培养对照组（CON,n=4）,M1型巨噬细胞共培养组（M1,n=4）及M2型巨噬细胞共培养组（M2,n=4）的UCP1及血管细胞粘附分子1（Vascular Cell Adhesion Molecule1,VCAM1）表达情况。结果:LPS组TLR2、TLR4及TNF-αm RNA表达较CON组显著上调（TLR2:12.19±2.43倍,P=0.019;TLR4:8.07±1.72倍,P=0.026;TNF-α:31.78±6.05倍,P=0.015）,但对UCP1表达无影响（m RNA:P=0.702;蛋白:P=0.366）。巨噬细胞与脂肪细胞非接触共培养模式下CON组、M1组及M2组在UCP1 m RNA及蛋白表达水平上未见统计学差异（m RNA:P=0.222;蛋白:P=0.741）。巨噬细胞与脂肪细胞直接接触共培养模式下M1组UCP1 m RNA表达显著下调为CON组0.18±0.01倍（P<0.001）,且较M2组显著降低（P=0.020）。M1组UCP1蛋白表达下调为CON组0.50±0.06倍（P=0.004）,且M2组UCP1蛋白表达显著高于M1组（P=0.006）。接触共培养模式下M1组VCAM1 m RNA表达上调为CON组的8.83±0.94倍（P=0.004）,并显著高于M2组（P=0.007）。M1型巨噬细胞共培养下脂肪细胞VCAM1 m RNA表达与UCP1 m RNA表达显著负相关（r=-0.909,P=0.002）。结论:LPS能显著激活脂肪细胞TLR-TNF-α炎症信号通路,但对脂肪细胞棕色化未见明显作用。LPS诱导的M1型巨噬细胞可通过直接接触方式抑制脂肪细胞棕色化,而VCAM1的上调可能是介导M1巨噬细胞抑制脂肪细胞棕色化的重要机制之一。
关键词: Roux-en-Y胃旁路术 ；脂多糖 ；2型糖尿病 ；棕色化 ；巨噬细胞
被引量
2
摘要： 前言:随着经济发展和生活方式改变,糖尿病发病风险也不断增加,且对民众的健康产生严重威胁。糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)是一种常见的糖尿病并发症,其发病机制主要与糖代谢异常、肾脏血流动力学改变、免疫炎症因素、遗传因素、氧化应激等有关。大量的研究表明在糖尿病众多发病机制当中,昼夜节律紊乱是不容忽视病因之一。昼夜节律为一种生物体中的自然现象,其主要是基于生物钟进行调节,使机体适应自然环境的变化。相关研究发现生物钟与太阳光周期变化、物质代谢存在一定同步性。血糖在物质和能量代谢过程中发挥着重要作用,相关实验研究发现血糖水平和生物钟基因表达关系密切,生物钟基因异常对胰岛素分泌量和节律性都会产生影响,因而生物钟节律紊乱成为了糖尿病的主要影响因素之一。相关实验研究表明对DM小鼠而言,其生物钟节律紊乱情况下,血糖水平明显提高,且肾重系数、血肌酐指标都有所增加,由此可推断出生物钟节律紊乱会导致血糖增加,和DKD发生率增加有关。Toll样受体(TLRs)为一种膜受体,和免疫调节功能密切相关,其可以通过特定分子模式引发炎性反应,在免疫系统激活中作用很重要。在高血糖、高血脂的刺激下足细胞和肾小球系膜细胞的Toll样受体被激活,进而促进了细胞因子、趋化因子的表达与释放,从而导致炎症和纤维化,形成糖尿病肾病的病理改变。研究人员发现TLRs的表达与昼夜节律有一定的关系,并且在高表达Bmal1和Clock基因的日本medaka胚胎细胞(OLHdr R-e3)中检测到TLR9表达增加。此外,在依赖TLR9的脓毒症小鼠模型中,发现疾病的严重程度取决于脓毒症诱导的时间,这与TLR9表达和功能的日常变化一致。在分离的巨噬细胞中,LPS通过TLR4诱导昼夜节律的相移,并抑制核心昼夜节律基因Bmal1的峰值表达。褪黑素(MT)是一种具有抗氧化及抗炎作用的吲哚类激素,它由大脑松果体分泌。既往研究表明褪黑素具有肾脏保护作用,该作用主要是通过抑制肾脏的炎症反应得以实现,但其在DKD中的疗效和作用机制尚需进一步研究。方法:第一部分:不同浓度褪黑素干预高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞48小时。Western blot检测各组总蛋白中CLOCK、BMAL1、DEC1、TLR2、My D88、NF-κB的蛋白表达。Western blot检测各组总蛋白中TGFβ1、CollagenⅣ及FN的蛋白表达。实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR)测定各组细胞中TGFβ1、CollagenⅣ及FN的m RNA的表达情况;ELISA试剂盒检测各组细胞培养上清中炎症因子IL-1β和IL-6的分泌。第二部分:SPF级雄性小鼠适应性喂养一周后,将8周龄的2型糖尿病db/db小鼠随机分成:db/m组、db/db组和db/db+MT组。各组小鼠置于12h-12h明暗交替的环境饲养,早7AM开灯,记为ZT0时,晚7PM时关灯,记为ZT12时。db/db+MT组每天(ZT12-次日ZT0)给予褪黑素加入饮用水中(首先将褪黑素溶于无水乙醇中,再加入适量生理盐水加以稀释,配制成褪黑素浓度为0.2%的生理盐水溶液),同时给予db/m组和db/db组小鼠相同时间内饮用含有等量乙醇的生理盐水溶液,db/m组、db/db组和db/db+MT组三组小鼠均给予普通饲料。喂养至20周龄。每周对小鼠体重称量一次,每月检测一次血糖,且采集其尿液,并通过酶联免疫法检测尿白蛋白和尿NGAL相关的指标,并确定出尿白蛋白/尿肌酐比率。对20周龄小鼠麻醉后通过摘眼球取血,心脏灌流后留取肾组织。对采集的血样进行处理后通过酶联免疫法检测血肌酐和尿素氮。对制备的组织切片进行HE、PAS和Masson染色。CLOCK、BMAL1、DEC1、TLR2、NF-κB的表达水平基于免疫组化方法进行检测。通过Western blot方法测定肾组织CLOCK、BMAL1、DEC1、TLR2、My D88、NF-κB、TGFβ1、CollagenⅣ及FN的蛋白表达。实时定量PCR法检测肾组织TGFβ1、CollagenⅣ及FN m RNA的表达。ELISA试剂盒检测各组肾组织匀浆IL-1β、IL-6的表达情况。第三部分:染色质免疫沉淀(Ch IP)结合PCR技术鉴定体内条件下转录因子CLOCK和DEC1与TLR2启动子特异序列的结合情况。应用双荧光素酶报告技术检测转录因子CLOCK和DEC1对TLR2启动子转录活性的影响。使用脂质体转染DEC1si RNA,实时定量PCR法验证转染效率,Western Blot检测各组细胞DEC1、TLR2、My D88、NF-κB的蛋白表达水平。结果:第一部分:HG组大鼠肾小球系膜细胞生物钟基因CLOCK、BMAL1表达水平较NG组明显降低(P<0.05),DEC1表达水平较NG组显著增加(P<0.05);HG组大鼠系膜细胞内TLR2、My D88、NF-κB、TGFβ1、CollagenⅣ及FN的表达和NG组相比明显增加,细胞培养上清液中IL-1β、IL-6的水平增加。褪黑素有效升高高糖刺激的系膜细胞内CLOCK、BMAL1表达水平,降低DEC1表达水平,减少TLR2、My D88、NF-κB的产生。褪黑素可下调高糖引起的细胞因子TGF-β1的高表达,同时还可抑制细胞外基质Ⅳ型胶原和FN的产生,降低细胞培养上清液中IL-1β、IL-6的水平。第二部分:褪黑素降低db/db小鼠尿ACR和尿NGAL,改善肾脏病理改变,减少系膜基质增生等肾脏病理结构改变,明显降低db/db小鼠体重和血糖。褪黑素可以上调2型糖尿病db/db小鼠肾组织内时钟基因CLOCK、BMAL1表达水平,降低DEC1表达水平,下调TLR2/My D88/NF-κB通路,减轻肾组织内炎性状态,减少Ⅳ型胶原和FN的产生,发挥肾脏保护作用。第三部分:染色质免疫沉淀(CHIP)结果显示,CLOCK和DEC1均可与TLR2启动子结合。双荧光素酶检测结果显示,转录因子DEC1可显著上调p GL3-TLR2-wt的荧光素酶表达水平,而转录因子CLOCK对于野生型TLR2启动子和突变型TLR2启动子的转录活性都没有明显的影响。脂质体转染DEC1 si RNA实验中,四组细胞干预处理48h后,与HG组相比,HG+DEC1-si RNA组的DEC1 m RNA的表达显著下调(P<0.01)。与HG组相比,HG+DEC1-si RNA组和HG+MT组DEC1、TLR2、My D88和NF-κB蛋白表达量显著下调(P<0.05)。HG组与HG+si NC组以上指标之间的差异无统计学意义。结论:第一部分:大鼠肾小球系膜细胞在高糖状态下出现时钟基因表达异常,TLR2/My D88/NF-κB信号通路被激活,IL-1β、IL-6等炎症因子的分泌增多,TGFβ1信号通路表达上调,从而导致大鼠肾小球系膜细胞的细胞外基质CollagenⅣ和FN分泌增加,褪黑素干预可有效调节时钟基因,对上述信号通路有一定抑制作用,降低了大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质的分泌。第二部分:褪黑素能降低db/db小鼠尿ACR和尿NGAL,改善肾脏病理改变,减少系膜基质增生,减轻db/db小鼠的体重和血糖水平。褪黑素可能通过调节2型糖尿病db/db小鼠肾组织时钟基因,下调TLR2/My D88/NF-κB信号通路,从而抑制TGFβ1信号通路的激活,减轻肾组织内炎性状态和纤维化,发挥肾脏保护作用。第三部分:转录因子DEC1可能通过与TLR2启动子结合并激活其转录,上调TLR2/My D88/NF-κB信号通路,从而激活TGFβ1信号通路的激活,导致肾脏炎症状态和纤维化,引起肾脏损伤。
关键词: 糖尿病肾病 ；时钟基因 ；褪黑素 ；TLR2/MyD88/NF-κB信号通路 ；系膜细胞
摘要： 局灶节段性肾小球硬化(Focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是儿童和成人肾病综合征(Nephrotic syndrome,NS)常见的病理表型,是导致终末期肾病(End Stage renal disease,ESRD)的主要病因之一。足细胞是一种高度分化的上皮细胞,与肾小球内皮细胞以及GBM共同构成肾小球的滤过屏障。足细胞损伤是FSGS的主要特征,因此,寻找有效治疗和改善足细胞损伤的靶点对于FSGS的治疗具有重要的临床意义。PRRs包括表达在膜上的C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CLR)和Toll样受体(Toll-like receptor,TLR);表达在胞质的 NOD 样受体(NOD-like receptor,NLR)、RIG-I样受体(RIG-I-likereceptor,RLR)和多种DNA感应分子等。在肾脏疾病发病过程中,肾脏细胞及免疫细胞中的模式识别受体可被激活并启动主要的天然免疫通路,如NF-κB和NLRP3炎症小体,并触发多种炎症介质的分泌,导致不可逆的组织损伤和功能紊乱。例如TLR4、TLR5、NOD2等可通过调控足细胞炎症反应影响肾脏疾病的发病进程。然而CLRs在肾脏疾病足细胞损伤中的作用仍不清楚。TLRs和CLRs是两类主要的模式识别受体,研究表明TLRs信号传导的关键中间体TRAF6和TAK1也是CLRs抗真菌免疫反应中下游信号通路的关键成分。基于TLRs在肾脏疾病中的重要作用,我们猜测CLRs也在肾脏疾病中也发挥重要作用。通过前期的基因芯片数据分析,我们聚焦于 CLEC14A(C-type lectin family 14A)的研究。CLEC14A 是 CLR 超家族14亚家族中的一员。近期研究发现,在胚胎发育过程中CLEC14A特异性地表达于血管内皮细胞,参与调控VEGF信号通路并促进肿瘤的血管生成。另有研究表明CLEC14A可通过负调控VEGFR-2抑制缺血造成的神经元炎症反应并提高血脑屏障的完整性。由于炎症反应以及VEGFR-2信号通路都参与了肾脏疾病的发生发展过程,提示CLEC14A可能与肾脏疾病进展的关键调控通路有关。目前虽然针对于PRRs中的Toll样受体与NOD样受体在肾脏及足细胞损伤中的作用取得了一定研究进展,但是关于CLRs在肾脏疾病中的功能方面的研究非常少,尚未有关于CLRs在足细胞的生物学功能方面的报道。因此,本课题重点关注CLEC14A在足细胞损伤中的功能,揭示了其在调控足细胞骨架结构、炎症反应及粘附等方面中的作用。我们首次发现CLEC14A在阿霉素诱导的FSGS小鼠肾脏中表达降低。与此一致,在多种足细胞病患者肾活检标本中CLEC14A的表达也降低。进一步实验发现,敲除CLEC14A明显加重阿霉素诱导的FSGS小鼠的足细胞损伤和蛋白尿生成,并伴随炎症细胞浸润及炎症反应增加。在机制上,我们首次发现CLEC14A可与HMGB1(high mobility group box-1 protein)结合并抑制其分泌,进而抑制HMGB1介导的炎症反应,EGR1(early growth response protein 1)通路的激活等。本研究进一步充实了对CLEC14A生物学功能的新认识,并为FSGS的防治提供了新的靶点和思路,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究目的(1)明确CLEC14A在阿霉素肾病中的表达变化。(2)揭示CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用。(3)探讨CLEC14A在足细胞损伤中的作用机制,为探索阿霉素肾病及其他足细胞病的治疗策略提供新的思路。研究方法第一部分:明确CLEC14A在阿霉素肾病中的表达变化1.1 检测临床病人肾组织标本中CLEC14A的表达变化(1)收集伴有蛋白尿的肾小球疾病包括FSGS、微小病变肾病(minimal change disease,MCD)、糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)及膜性肾病(membranous nephropathy,MN)患者的肾穿刺活检标本的病理切片。(2)免疫组化(immuohistochemical,IHC)检测CLEC14A在肾脏中的分布和表达变化。1.2 阿霉素肾病动物模型中CLEC14A表达变化(1)构建阿霉素肾病动物模型:对8周龄小鼠尾静脉注射阿霉素(Adriamycin,ADR),注射剂量为20mg/kg,5周后留取肾脏标本。(2)琼脂糖凝胶实验检测CLEC14A在小鼠各组织中的表达情况。(3)检测肾脏中CLEC14A的表达与定位情况:①Western blot检测肾皮质中CLEC14A的蛋白表达水平。②用免疫磁珠法分离肾小球,RT-qPCR检测肾小球中CLEC14A的mRNA水平。③IHC检测CLEC14A在肾小球中的分布和表达变化。④CLEC14A和足细胞标记蛋白Synaptopodin免疫荧光双标,激光共聚焦技术观察肾小球中CLEC14A的细胞定位和表达变化。1.3 体外模拟阿霉素肾病条件检测各种肾脏实质细胞中CLEC14A的表达变化(1)Western blot检测CLEC14A在肾脏实质细胞中表达情况。(2)分别给予0.4νg/mL的ADR处理肾小球足细胞(human podocyte,HPC)、内皮细胞(glomerular endothelial cell,GENC)、系膜细胞(mesangial cell,MC),Western blot 检测CLEC14A的表达变化。第二部分:揭示CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用2.1 构建CLEC14A敲除小鼠的阿霉素肾病动物模型(1)提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型。(2)动物模型构建:构建ADR诱导的Clec14a-/-小鼠阿霉素肾病模型,注射剂量为20mg/kg。(3)验证CLEC14A在肾脏中的敲除效率:①实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测Clec14a-/-及WT 小 鼠肾脏皮质中 CLEC14A 的 mRNA 水平变化。②免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测CLEC14A在肾脏中的表达变化。2.2 揭示CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用2.2.1 检测敲除CLEC14A对阿霉素素肾病足细胞损伤及蛋白尿的影响(1)检测尿白蛋白/肌酐比(urinary albumin creatinine ratio,UACR)。(2)检测血肌酐(serum creatinine,Scr)。(3)过碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain,PAS)检测肾小球形态变化和硬化程度。(4)应用透射电镜(transmissionelectronmicroscopy,TEM)观察足突数量、足突融合、肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)厚度等。(5)IF检测肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白Podocin和Nephrin的表达变化。2.2.2检测敲除CLEC14A对阿霉素肾病肾脏炎症反应的影响(1)RT-qPCR 检测肾脏皮质中 IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α 的 mRNA 水平变化。(2)IF检测巨噬细胞标志物CD68和中性粒细胞标志物Ly6B的表达变化。2.3 体内过表达CLEC14A验证其在肾脏疾病中的作用2.3.1 CLEC14A过表达小鼠模型的构建(1)对8周龄小鼠进行肾脏实质注射携带Clec14a基因的慢病毒载体(pGLV3-Clec14a)或对照慢病毒载体(pGLV3-1null,1×105IU/μl),1天后尾静脉注射阿霉素,造模5周后留取肾脏标本。(2)验证CLEC14A在肾脏中的过表达效率:Western blot检测pGLV3-Clec14a组及pGLV3-null组小鼠肾脏皮质中CLEC14A的蛋白水平。2.3.2检测体内过表达CLEC14A对阿霉素肾病足细胞损伤、蛋白尿、肾脏炎症反应的影响(1)检测UACR和Scr水平。(2)PAS检测肾小球形态变化和硬化程度。(3)TEM观察足突数量、足突融合、GBM厚度等。(4)IF检测足细胞损伤后肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达变化。(5)RT-qPCR检测肾脏皮质中的IL-1β、MCP-1、TNF-α的表达变化。2.4 检测CLEC14A基因过表达对阿霉素诱导的体外培养的足细胞损伤的影响(1)使用携带pCMV6-Clec14a质粒的重组腺病毒载体及其对照载体(pCMV6-null)转染体外培养的足细胞,Western blot验证CLEC14A过表达效率。(2)采用阿霉素(0.4μg/mL)刺激足细胞24h,RT-qPCR检测炎症因子的表达变化。(3)用Casepase3活性检测试剂盒检测足细胞凋亡情况。(4)流式细胞术检测足细胞死亡情况。(5)Western blot 检测足细胞损伤因子 uPAR(urokinase-type plasminogen activor receptor)的表达变化。(6)RT-qPCR检测足细胞损伤因子uPAR的mRNA水平变化。(7)细胞IF检测足细胞中β3整合素的活性。(8)Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Podocin和Nephrin的表达变化。(9)F-actin荧光染色后,激光共聚焦显微镜观察足细胞骨架重排。第三部分:探讨CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用机制3.1检测足细胞内CLEC14A与HMGB1的相互作用研究表明CLEC14A同家族分子血栓调节蛋白与HMGB1结合并抑制其下游炎症反应,我们检测了 CLEC14A与HMGB1的结合情况以及ADR刺激条件下HMGB1的表达和分布情况。(1)用阿霉素(0.4μg/mL)刺激足细胞24h,Western blot检测HMGB1的表达变化。(2)用阿霉素(0.4μg/mL)刺激足细胞24h,细胞IF检测HMGB1的表达和分布变化。(3)足细胞过表达CLEC14A,用阿霉素(0.4μg/mL)刺激足细胞24h,丽春红染色结合Western blot检测HMGB1的分泌变化。(4)免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测过表达CLEC14A对阿霉素处理的足细胞中CLEC14A与HMGB1的结合水平的影响。3.2 检测CLEC14A对HMGB1下游信号通路的影响3.2.1 检测CLEC14A对HMGB1介导的炎症反应的影响(1)用携带Clec14a过表达质粒的腺病毒载体转染足细胞过表达CLEC14A,再用重组蛋白rHMGB1刺激足细胞,Western blot检测足细胞中p65的表达及转位。(2)足细胞过表达CLEC14A后,用重组蛋白rHMGB1刺激足细胞,RT-qPCR检测足细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平变化。3.2.2 利用基因芯片技术分析CLEC14A下游信号通路基因芯片用于分析组间差异表达基因,检测CLEC14A基因过表达对阿霉素诱导的足细胞内下游基因的影响。3.2.3 检测足细胞内CLEC14A对HMGB1/EGR1通路的调控(1)用携带Clec14a过表达质粒的腺病毒载体转染足细胞过表达CLEC14A,Western blot检测阿霉素处理的足细胞中EGR1的表达变化。(2)足细胞转染HMGB1的小干扰RNA后沉默HMGB1,Western blot检测HMGB1的沉默效率。(3)足细胞转染HMGB1的小干扰RNA后沉默HMGB1,Western blot检测阿霉素处理的足细胞中EGR1的表达变化。(4)用携带Clec14a过表达质粒的腺病毒载体转染足细胞过表达CLEC14A,再用重组蛋白rHMGB1刺激足细胞,Western blot检测足细胞中EGR1的表达变化。3.3 验证EGR1是否介导CLEC14A缺失导致的足细胞损伤3.3.1 检测基因沉默EGR1对CLEC14A缺失导致的足细胞损伤的影响(1)足细胞转染CLEC14A的小干扰RNA后沉默CLEC14A,
关键词: 足细胞损伤 ；阿霉素肾病 ；CLEC14A ；HMGB1 ；EGR1 ；uPAR
摘要： 背景心力衰竭（heart failue HF）,已经成为全球瞩目的公共卫生问题,影响着世界上大约1%-2%的人口,它严重威胁患者健康,使患者劳动能力和生活质量下降,并因此耗费巨大医疗资源,给家庭和社会带来沉重负担。而心室重构（ventricular remodeling）是引起心力衰竭发生的关键环节,贯穿整个心力衰竭的发展。心室重塑是指各种损伤使心脏结构与功能发生变化,是机体的一种适应性反应,具体包括心室重量、大小和形状的改变,微观上涉及心肌细胞、细胞外基质以及两者之间比例的改变,原发性心肌细胞受损、血流动力学负荷等诸多因素都能影响这一过程.细胞凋亡是造成心室重构的一个重要危险因素,基本病理机制如下:细胞凋亡（apoptosis）是指为了机体整体稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达及调控等的作用。研究发现,在心肌的破坏形式中存在凋亡。既往的临床研究发现[1],代谢紊乱和神经体液失调均可导致心肌细胞肥大、增生、凋亡、心肌间质纤维化。心肌细胞凋亡造成心室肌细胞不断减少,减少的细胞数目被胶原纤维等细胞外基质替代,导致心肌收缩单元不断减少,最终逐步发展为心力衰竭。引起细胞凋亡的因素很多,其中,脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,是凋亡反应中最强烈的刺激因素之一;LPS,又称内毒素,是革兰阴性菌菌外壁的一种成分,是心肌细胞凋亡过程中一个重要的炎症因子来源。LPS释放进入血液后与脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide binding protein,LBP）结合成复合物,识别结合单核细胞或巨噬细胞表面高亲和力的受体CD14,激活Toll样受体（TLR4）,导致NF-IL6、AP-1、CREB及NF-κB等核因子的活化,启动TNF-α、IL-1及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）等炎性因子基因的转录,导致大量炎性因子的产生,引发机体的炎症反应,造成心肌细胞的凋亡。心室重塑的具体机制十分复杂[2],除如前所述的心肌细胞间质纤维化、心肌细胞凋亡外,主要机制还有4个方面:（1）代谢障碍致代谢性重构（metabolic remodelling）:例如糖尿病性心肌病,血糖异常造成心肌细胞钠钙交换受抑制,而肌浆网Ca2+泵正常,逐渐使Ca2+聚集在肌浆网,进而引起心脏顺应性下降,随之发生心室重构。（2）肾素一血管紧张素系统（rennin—an giotensin system,RAS）被激活:心排血量降低导致肾血流量减低,RAAS激活,心肌收缩力增强、周围血管收缩维持血压,促进醛固酮分泌等,同时激活心脏和血管重塑,加重心肌损伤和心功能恶化程度。（3）心脏自主神经病变:心力衰竭病人代偿性交感神经兴奋,去甲肾上腺素（NE）水平升高,作用于心肌β1肾上腺能受体,增强心肌收缩力并提高心率,从而提高心排血量。周围血管收缩,心脏后负荷增加及心率增快的因素,均可使心肌耗氧量增加,此外NE还对心肌细胞有直接毒性作用,促使心肌细胞凋亡,参与心室重构过程。（4）心肌微血管病变:心肌微血管病变主要指微循环障碍、微血管瘤和微血管基膜增厚,这些因素导致心肌细胞缺血缺氧,引起局灶性细胞凋亡、坏死和心肌间纤维瘢痕灶,导致心室重塑。简言之,在心室重构的演化过程中,多种因素参与心肌细胞增生、肥大和凋亡、心肌间质纤维增生,而细胞凋亡在心室重构晚期发挥着不可或缺的角色,极大的促进心室重构的发生及发展,因此抑制细胞凋亡可有效的逆转心室重构的进展[1],但目前临床尚无特异性抑制心肌细胞凋亡的靶向药物,因此寻找有效的逆转心室重构的靶向药物显得尤为重要。从中药有效成分中寻找新药是现代药理学研究的热点,很多中药及有效成分具有降低血脂、抗氧自由基及抗细胞凋亡等血管内皮细胞保护作用的功能。其中山奈酚（Kaempfer01）又名山奈素,化学名为3,5,7.三羟基.2.（4.羟基苯基）.4H.1.苯并吡喃4.酮,属于黄酮醇类化合物,主要存在于姜科植物山柰的根茎,也可见于各种水果、蔬菜中。有研究结果[3-4]提示其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、保护内皮细胞等作用,还有研究[4]结果提示山奈酚具有抗心肌细胞肥大及间质纤维化的作用。因此我们认为山奈酚在防治抗心肌细胞凋亡方面具有潜在价值,但其对心肌细胞凋亡的作用尚不明确,因此本研究就山奈酚对心肌细胞凋亡的作用做进一步的探讨。本实验将重点研究山奈酚对心肌细胞活力、心肌细胞凋亡的影响,并观察凋亡心肌细胞的凋亡蛋白表达及信号通路激活水平。目的本研究探讨山奈酚对大鼠心肌细胞凋亡的影响,并进一步研究这些影响的可能机制,为以后研发新药及临床用药提供参考。实验分组与方法实验分组:（1）空白对照组:具有培养基、H9c2细胞;（2）山奈酚组:H9c2细胞+山奈酚,具体亚组分组为:（1）山奈酚5umol/L;（2）山奈酚25umol/L;（3）山奈酚50umol/L;（3）LPS组:H9c2细胞+10mg/L的LPS;（4）共同作用组:H9c2细胞+山奈酚+LPS,具体亚组分组为:（1）LPS10mg/L+山奈酚5umol/L;（2）LPS10mg/L+山奈酚25umol/L;（3）LPS10mg/L+山奈酚50umol/L;实验方法:1细胞活性检测采用CCK-8毒性检测试剂盒来检测不同浓度山奈酚和/或LPS刺激条件下细胞的活力。首先将细胞接种到96孔板中,为提高实验准确性需保证每孔100μL,且密度约维持在2×10～5个/mL,然后置于温箱连续培养24h,再用无血清培养基替换原有培养基,进行18h的饥饿处置,最后采用不同浓度山奈酚和/或LPS处理12h后,并将96孔板中的培养基再次换为含有10μL CCK-8的无血清培养基100μL,并在恒温箱中继续孵育2-2.5h后,再将其置于酶标仪下（波长450 nm）分别检测每孔的OD值,实验重复3次。2细胞凋亡检测培养细胞在胰蛋白酶消化后调整密度为1×10～5个/mL,制作细胞爬行片,并进行饥饿培养18h,后加入不同浓度山奈酚和/或LPS处理细胞12 h,用PBS漂洗3次,再用1%多聚甲醛进行固定10 min,接着用乙醇/乙酸2∶1混合液在-20℃恒温下固定5 min,再次用PBS清洗3 min。加入平衡液室温下孵育10 s后滴加TdT酶工作液,37℃孵育1 h。加入工作液振荡15 s后孵育10 min,PBS洗3次,吸干液体,滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液,进行避光孵育约30 min,使用PBS再洗3次,在DAPI封片后,最后进行荧光显微镜下观察拍照。正常的细胞核可被染为蓝色,而凋亡的细胞核则被染为绿色,在每组中随机选择8个视野（×400）,记录凋亡细胞数,计算细胞凋亡率（凋亡细胞数÷细胞总数×100%）,并取其平均值,实验重复8次。3 Western blot检测H9c2细胞凋亡蛋白表达及信号通路激活水平在冰上进行裂解细胞10 min,然后将其置于1.5 mL离心管中,超声裂解仪5kHz进行10-15 s的裂解,4℃12000 g离心15 min,上清液移至离心管中,BCA定量检测蛋白浓度并加入相同质量的蛋白于200ml EP中进行高温变性。在每组样本混合均匀后取10μL进行10%SDS-PAGE凝胶电泳检,将GAPDH设置为检测的内在参考指标,然后依据各样本的光密度值逐个调整上样剂量,再次对调整后的上样剂量进行凝胶电泳检测,使各样本间GAPDH的光密度值无差异,紧接着对每组以校正后的上样剂量分别进行凝胶电泳检测,将蛋白以200mA、90 min的参数移到PVDF膜上,并使用一抗封闭液进行封闭12 h,其中一抗主要包括p-Iκbα、p-P65、c-Caspase 8、P65、c-Caspase 3、IκBα、c-Caspase 9,封闭12h后再使用TBST进行清洗3次,接着再将各自放入对应的加有二抗的稀释液中进行避光孵育1 h,其中二抗主要为山羊抗兔IgG抗体,孵育结束后再用TBST清洗3次,并将其放入Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪中来检测目的条带,同时应用Gel-Pro Application图像分析软件来分别检测各组蛋白的光密度值,以代替其蛋白表达水平,实验重复3次。4统计学分析采用SPSS23.0统计软件对试验数据进行分析。计量资料以—x±SD表示,不同组间凋亡蛋白表达及信号通路激活水平的比较采用单因素方差分析,组间两两均数比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.山奈酚对大鼠心肌H9c2细胞活性以及山奈酚对LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞活性的影响的影响:不同处理因素干预12h后,CCK8结果显示,与空白对照组相比,不同浓度山奈酚单独干预H9c2细胞对其活力无影响（P>0.05）;LPS干预细胞后引起细胞活性显著下降（P<0.05）,山奈酚（5、25、50μmol/L）与LPS同时干预H9c2细胞,则可呈现浓度依赖性的改善H9c2细胞活性,因此山奈酚能改善LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞活性的下降。2.山奈酚对LPS诱导下H9c2细胞凋亡的影响:细胞经过不同干预因素处理12h后,对照组凋亡率为6.7±0.9%;LPS刺激组可显著增加H9c2细胞中凋亡率（41.2±4.7%）;LPS+高剂量山奈酚组以50μmol/L山奈酚处理H9c2细胞12h后,则H9c2细胞中凋亡率降低为10.0±1.3%。这些结果提示山奈酚可以改善LPS诱发的细胞调亡,降低细胞的凋亡率。3.山奈酚对LPS诱导H9c2细胞凋亡蛋白的表达的影响WB结果提示,LPS（10 mg/L）干预大鼠心肌H9c2细胞12 h可显著提高c-Caspase3、c-Caspase8、c-Caspase9的蛋白表达水平,不同浓度山奈酚（5、25、50μmol/L）与LPS共同处理大鼠心肌H9c2细胞12h后,则可显著抑制上述3个凋亡蛋白的表达。4.山奈酚对LPS诱导H9c2细胞中TLR4/NF-κB通路的影响细胞经过不同干预因素处理后,WB结果显示,和LPS处理相比,不同浓度山奈酚（5、25、50μmol/L）与LPS（10 mg/L）协同刺激H9c2细胞可显著抑制LPS诱导的TLR4、Iκbα及P65信号通路的磷酸化水平,对总蛋白无影响（图4-表3）。结论1.不同浓度的山奈酚（5、25、50μmol/L）对大鼠心肌H9c2细胞无明显细胞毒性,且山奈酚可改善LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞活性的下降。2.山奈酚可以减轻LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞的凋亡。3.山奈酚可抑制LPS诱导的大鼠心肌H9c2细胞凋亡蛋白的表达。4.山奈酚可能通过TLR 4/NF-κB途径产生抗心肌细胞凋亡作用。
关键词: 山奈酚 ；心肌细胞 ；凋亡 ；脂多糖 ；大鼠
被引量
18
摘要： 背景和目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者较为常见的一种并发症,也是引起终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一。随着人们对糖尿病肾病的研究及认识,现在普遍认为糖尿病肾病是一种慢性炎症性疾病,长期微炎症状态使得肾脏肾小球及肾小管结构的改变,进而引发微量蛋白尿乃至大量蛋白尿。现在不少学者认为巨噬细胞在糖尿病肾病的发生发展中起到了重要作用。Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)是一种非受体型酪氨酸激酶,属于Tec激酶家族。近期研究表明,Btk是Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)等信号通路的重要的信号分子,参与并增强TLR信号转导并最终激活NF-κB和MAPKs信号通路,继而启动炎症反应。同时,Btk仅表达于除T淋巴细胞及组织浆细胞的髓系细胞,较TLR信号通路更有优势,本研究探讨Btk在糖尿病肾脏巨噬细胞激活及肾脏炎症中的作用及分子机制,为糖尿病肾病的治疗提供新的思路及措施。方法:第一部分:提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞,培养成熟后采用细胞流式技术对巨噬细胞进行鉴定。采用CCK-8法检测不同浓度的Btk抑制剂PCI-32765对巨噬细胞活性的影响,接着采用Western blot法检测在不同时间点和不同抑制剂浓度下p-Btk的相对表达量以优化实验条件。把巨噬细胞分为:低糖组(LG),抑制剂对照组(LG+PCI-32765),高糖组(HG),抑制剂组(HG+PCI-32765),刺激相应时间后收集细胞和上清,提取细胞m RNA及总蛋白。Transwell法观察巨噬细胞的趋化功能;ELISA法检测上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1浓度;实时定量PCR检测IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA表达水平;Western blot检测i NOS,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65,IκB,p-IκB等蛋白的表达;激光共聚焦法检测巨噬细胞的激活及NF-κB p65核转移。第二部分:选取Btk全髓系敲除小鼠及同背景野生型小鼠各14只作为研究对象,糖尿病组注射50mg/kg.d STZ连续5天,一周后检测各小鼠尾尖血糖,血糖≥16.7mmol/L则视为造模成功。该实验分为四组,分别为:野生型小鼠7只作为正常对照组(WT,n=7),糖尿病小鼠组(Diabetic,n=7),Btk敲基因小鼠组(Btk-/-,n=7)和Btk敲基因糖尿病小鼠组(Btk-/-diabetic,n=7)。12周后检测各小鼠体重、血糖、肾重,收集血、24小时尿及肾脏标本。酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠24小时尿蛋白排泄率;光镜观察小鼠肾脏病理变化;免疫组化方法检测IL-1β,MCP-1,激光共聚焦法检测CD68等;实时定量PCR检测IL-1β,MCP-1和TNF-α的表达;Western blot检测蛋白IL-1β,i NOS,TNF-α,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65的表达。结果:第一部分:细胞流式结果显示F4/80和CD11b双阳性的细胞占细胞总数的94.5%,细胞的纯度及成熟度均符合实验要求;实验条件优化后选择高糖的浓度为25mmol/L,PCI-32765的干预浓度为10-6mmol/L;Transwell趋化实验结果显示高糖刺激的巨噬细胞趋化的数目明显高于低糖组(P<0.05),PCI-32765干预后细胞趋化数目较高糖组明显下降(P<0.05);实时定量PCR结果显示,高糖组细胞IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA水平较低糖组细胞明显上升(P<0.05),抑制剂组与高糖组相比,三者的m RNA水平明显下调(P<0.05);ELISA结果显示,高糖组细胞上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1浓度较低糖组明显升高(P<0.05),与高糖组相比,抑制剂组IL-1β,TNF-α和MCP-1浓度明显下降(P<0.05);Western blot结果显示,与低糖组相比,蛋白i NOS,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB相对表达量明显升高(P<0.05),抑制剂组与高糖组比,i NOS,p-Btk,p-ERK,p-NF-κB p65,p-IκB的表达明显下降(P<0.05),p-ERK,p-JNK的表达未见明显变化(P>0.05);激光共聚焦结果显示,高糖组巨噬细胞激活标志蛋白i NOS的表达和NF-κB p65核转移较低糖组明显升高,与高糖组相比,抑制剂组两者的表达则有所下降。第二部分:与WT组小鼠相比,糖尿病小鼠血糖、糖化血红蛋白、肾重/100g体重和24小时尿蛋白排泄率明显改变(P<0.05),与Diabetic组相比,Btk-/-diabetic组24小时尿蛋白排泄率明显降低(P<0.05),血糖、糖化血红蛋白和肾重/100g体重未发生明显改变;光镜下,Diabetic组小鼠较正常组小鼠肾脏肾小球体积增大,基底膜增厚,系膜细胞增殖,Btk-/-diabetic组小鼠较Diabetic组有所改善;实时定量PCR结果表明:Diabetic小鼠肾脏炎症因子较正常组表达明显升高(P<0.05),Btk缺失后小鼠肾脏炎症水平较糖尿病小鼠明显下降(P<0.05);免疫组化和激光共聚焦提示Diabetic小鼠肾脏巨噬细胞浸润明显增加,随着Btk敲除,肾脏巨噬细胞浸润明显减少;Western blot结果显示蛋白p-Btk,p-ERK,p-JNK,p-NF-κB p65,p-IκB在Diabetic组小鼠肾脏的表达较正常小鼠明显升高(P<0.05),较Diabetic组小鼠,Btk-/-diabetic小鼠肾脏中这些蛋白的表达明显下降。结论:1在高糖刺激下,骨髓来源巨噬细胞激活,细胞内p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB表达上调,炎症因子IL-1β,MCP-1,TNF-α表达增加;Btk敲除后抑制MAPK以及NF-κB信号通路激活,下调巨噬细胞炎症因子的表达。2在动物实验中,糖尿病小鼠肾脏p-Btk表达明显升高,24小时尿蛋白排泄率升高,肾小球出现肥大,基底膜增厚,外基质沉积等病理改变,除此之外肾脏炎症及巨噬细胞浸润激活增加,Btk敲除后该现象有所改善,提示Btk可能参与了糖尿病肾病的发生发展;3糖尿病小鼠肾组织,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB的表达明显上调,炎症因子IL-1β,TNF-α和MCP-1合成增加,Btk敲除后下调MAPK,NF-κB信号通路以及炎症因子的表达,提示Btk致糖尿病肾损伤发生的机制可能与MAPK以及NF-κB信号通路激活有关;
关键词: 糖尿病肾病 ；Btk ；MAPK ；NF-κB ；巨噬细胞 ；炎症
被引量
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摘要： 研究背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种严重临床病症,在急症病例中大约有1/5的病人会罹患这一疾病。在住院病人中急性肾损伤成为普遍而且危险的加速患者死亡的因素,它可以由药物毒性及脓毒症所引起。脓毒症合并AKI预示着一个可怕的临床情况,其相关的医院死亡率可高达70%。多年来,脓毒症引起的器官损伤和其他有害并发症被认为是由一种过度炎症反应诱发的细胞因子风暴所致,它因感染性病原体或生理性应激而触发。多个利用大鼠离体和在体实验研究表明,通过血虑广泛吸附减少炎性细胞因子可以防止肾和肝损伤,提高细菌清除率和平均动脉压,降低细胞凋亡和肾小管细胞损伤,并提高总体生存率。有大量研究聚焦于明确哪些是与常见脓毒症综合征相关的特异性细胞因子。尽管进行了大量研究,但脓毒症和AKI临床表现之间基本的病理生理机制关系还没有完全清楚。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外层成分,有研究证明它是导致脓毒症急性肾损伤的主要诱发因素。LPS诱导的脓毒症有多种炎性因子参与介导。在小鼠中LPS引起导致急性肾损伤的细胞炎性因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和白介素1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)在急性肾损伤的病理改变进程中扮演了重要角色。NF-κ B是一种高度表达的转录因子,常在细胞应激反应中被激活,诱导肿瘤坏死因子-α、IL-1、IL-6和IL-8的合成和释放。虽然从肾脏局部产生炎症因子对全身的细胞因子水平的总体贡献是未知的,但由核因子-κκB(nucler factor-κκB,NF-κκB)介导的信号转导过程确实可在分离的原代大鼠肾小管上皮细胞发生。Toll样受体-4(Toll-like receptors 4,TLR-4)在移植肾缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)的发病机制中起着重要作用。TLR-4不仅对外源微生物基序有反应,而且能识别应激和坏死细胞释放的相关分子,同时能识别内源性大分子的降解产物。在肾缺血再灌注损伤过程中,TLR-4的上调见于肾小管上皮细胞、血管内皮细胞,这是由内源性损伤相关分子模式(如高迁移率组合染色体蛋白1)的大量酶诱导的。TLR-4的激活促进炎症介质的释放,促进白细胞迁移和浸润,激活先天和获得性免疫系统,并增强肾纤维化,在临床上常常导致严重的不良后果,而抑制这些炎症因子可以减轻肾组织的损伤程度。有研究者对TLR-4基因敲除小鼠,移植能够表达TLR-4的异体肾的实验表明,相对于局部TLR-4整体的表达合成可能更为重要。NF-κ B直接抑制药物如methyl-2-acetamidoacrylate(一种丙酮酸乙酯类似物,丙酮酸乙酯和烟碱型乙酰胆碱)能降低小鼠血清细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10γ),改善已有感染症状AKI小鼠的临床特征,减轻肾功能损伤的程度。因此早期采取针对性抗炎治疗可以有效改善肾功能。NOD样受体蛋3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)隶属于模式识别受体PRR(patern recognition receptor,PRR)这一大类蛋白受体家族,它是其中一个亚家族的成员,接头蛋白可以与活化的Nod样受体蛋白产生相互作用,进而激活半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1),形成一种称为“炎症小体(inflammasome)”的蛋白复合物,作为免疫防御的第一步识别感染并启动病原体清除和组织修复过程。炎症小体是参与这些过程的最重要的复合物之一它通过ASC(包含一个分子衔接的凋亡相关微粒蛋白,apoptosis-associated speck-like protein containing,CARD)招募pro-caspase-1,然后将细胞因子前体pro-IL-1 β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β和IL-18。活化后的炎症小体还通过调节Gasdermin D(GSDMD)的N端区域在细胞膜中形成孔道,促进称为细胞焦亡的一种“炎性形式”的细胞死亡。存在于肾脏内的单核网状吞噬细胞可以为IL-1 β、IL-18产生以及NLRP3的合成提供必要的物质条件,有研究显示NLRP3基因敲除的小鼠与野生型小鼠相比,在慢性肾损伤时IL-1β、IL-18和Caspase-1蛋白的含量降低,肾小管的损伤减轻。多位学者的多项研究发现,在糖尿病相关肾损伤中NLRP3炎性小体及NF-κB的表达升高,NLRP3-Caspase-1-IL-1 β/IL-18这一通路在此现象中有重要作用。总之,TNF-α,IL-1β,IL-6,NLRP3,TLR-4等物质在急性肾损伤发生中扮演了重要的角色。传统中草药是研究开发新型药物的重要资源,在这一问题上众所周知的青蒿素、紫杉醇等的发现就是一强有力的证明。金丝桃苷是一种黄酮类化合物来源于杜鹃花科、卫矛科和藤黄科植物,它对哺乳动物表现有多种生物学效应,如抗炎作用便是其中之一,有报道它能抑制LPS导致的大鼠腹膜巨噬细胞的亚硝酸盐生成,也能抑制LβS导致的小鼠急性肝损伤,在Sahreen S等人的研究表明金丝桃苷通过抗氧化应激、抑制炎症因子生成保护CC14(carbon tetrachloride)诱导的急性肝损伤。金丝桃苷还被发现有对心脏缺血再灌注损伤的保护作用。Lee S等用金丝桃苷作为工具药研究了p44/p42 MAPK(丝裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)、p38 MAPK 和JNK(c-Jun氨基末端激酶,c-Jun N-terminal kinase)在大鼠腹腔巨噬细胞炎症反应中的作用发现,金丝桃苷可使p44/p42 MAPK、p38 MAPK和JNK表达抑制,进而降低 iNOS(Inhibitory nitric oxide synthase)表达,抑制NO合成,引起的结果是炎症反应的减轻。Kim SJ等在实验研究中发现金丝桃苷不但能够使NF-κ B的活化程度降低而且也可以减少I κ B-α的降解,从而说明金丝桃苷在机体的调节免疫调节活动中具有正面的作用。Hu J等实验发现中脑导水管周围灰质中的NR2B(N-methyl-D-aspartate Receptors 2B)和NMDA(N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate)受体可被金丝桃苷调节,由于这两个受体和炎症疼痛密切相关,而产生长时间消炎止痛效果。上述对NF-κκB、IL-1β、IL-18和Caspase-1等的研究,均侧重于肾缺血再灌注损伤的机理,而脓毒症所致的急性肾功能损伤也是临床遇到的难题之一,对于明确其发病机制,探索有效的防治方法也具有重要的临床意义。金丝桃苷具有肝脏、心脏等器官有保护作用,但其对LPS所致肾损伤是否也有保护作用尚不明确,因此在本实验中我们试图探究金丝桃苷对LPS所致脓毒症小鼠AKI是否也有保护效应,如果这种保护效应被证实,则进一步研究这种保护效应可能的机制。研究目的1研究金丝桃苷对LPS所致急性肾损伤小鼠TNF-α、IL-6和IL-1 β的影响。2研究金丝桃苷对LPS所致急性肾损伤小鼠血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐的影响。3研究金丝桃苷对LPS所致急性肾损伤小鼠TLR4,NF-κ B和NLRP3表达的影响。研究方法1动物分组选择60只BABL/c雄性小鼠,6-8周龄,由滨州医学院实验动物中心提供。动物的使用符合医学动物实验伦理学要求。小鼠急性肾损伤模型的制备方法,小鼠腹腔进行注射15mg/kg的脂多糖,注射脂多糖后24小时采集小鼠血液,处死小鼠后摘取肾脏组织。60只BABL/c小鼠随机分为5组,每组各12只。组1作为阴性对照,只进行和实验药物同容量的PBS(磷酸缓冲盐溶液,phosphate buffer saline)液注射。组2作为LPS组,腹腔注射15mg/kg的LPS 50 u1,组3、组4、组5作为金丝桃苷+LPS组,组3给予金丝桃苷25mg/kg和LPS50 ul,组4给予金丝桃苷50mg/kg和LPS50 ul,组5予金丝桃苷100mg/kg和LPS50 ul,金丝桃苷在给予LPS后1h应用。2肾组织HE染色肾组织取材后,用含10%福尔马林的PBS液固定。固定好的肾组织修剪成大小合适的方块包埋于石蜡中。石蜡切片后(切片厚度为5微米)用H-E染色法染色,最后将制备好的肾组织切片放置于显微镜下观察形态学的变化。3血尿素氮和肌酐测定各组小鼠用上述相应的药物进行处理24小时后,收集每只小鼠的血液。使用自动分析仪分析测量本实验采集血清尿素氮和肌酐水平。操作方法根据设备的说明书进行。4酶联免疫吸附试验来自不同组的肾组织在冰上用PBS匀浆,然后在4℃以12000转/分钟,离心40分钟。随后,收集上清液,测定肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-1β的表达。根据厂家说明书,采用ELISA试剂盒检测炎性细胞因子水平。5 Western blot分析用蛋白提取液进行肾组织匀浆,以1OOOOg离心10分钟,用BCA蛋白试剂盒对上清液蛋白质浓度进行测定。在10%SDS-PAGE上蛋白质分离并转移到聚偏氟乙烯膜上,用5%无脂干奶粉阻断后,在4℃时将膜与原抗体孵育24小时。TBS/Tween20洗涤三次后,在室温下用HRP结合的二次抗体对膜探测lh。最后,用ECL化学发光试剂盒((ECL-plus,Thermo Scientific,USA)对膜进行可视化标记处理。6统计学分析数据以均数±标准差来表示,用单因素方差分析(Dunnetts t-test)和双尾T检验进行统计学分析析。检验标准以P<0.05认为有统计学意义。结果1金丝桃苷对LPS导致的肾损伤病理形态学改变的影响为研究金丝桃苷的保护作用,我们用HE染色法检测对比正常肾组织和损伤肾组织的病理改变。对照组显示正常肾组织的形态学表现,在脂多糖组肾组织有严重的损伤表现,包括肾小管上皮细胞脱落,刷状缘微绒毛减少,肾单位的凋亡,而用金丝桃苷处理后无论肾小管上皮细胞脱落程度,还是刷状缘微绒毛减少的数量,以及肾单位的凋亡情况镜下观察均有明显改善。2金丝桃苷减轻AKI肾功能紊乱实验中以反映肾小球滤过损害程度经典可靠指标BUN和肌酐水平评估肾功能,和对照组相比,脂多糖组BUN和肌酐水平明显升高,而在用金丝桃苷处理后,这种由脂多糖导致的BUN和肌酐的升高可被金丝桃苷抑制,并且这种抑制有剂量依赖性(25,50,100 mg/kg)。3金丝桃苷抑制细胞因子的表达为研究金丝桃苷的抗炎效应,我们用ELISA法检测了炎性因子TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平。和对照组相比,脂多糖组TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平明显升高,而和脂多糖组相比较金丝桃苷处理组TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平又明显减低。4金丝桃苷抑制脂多糖诱导的TLR4的表达和NF-κ B的活化TLR4是脂多糖诱导的急性肾损伤的一个重要因素,为了研究金丝桃苷的抗炎机制,我们考察了金丝桃苷对TLR4信号通路的影响。本实验结果表明脂多糖可显著上调TLR4的表达及激活NF-κ B,而金丝桃苷能显著抑制TLR4的表达,并且,金丝桃苷处理可剂量依赖的抑制NF-κB和IKBα的磷酸化。5金丝桃苷抑制脂多糖诱导的NLRP3信号通路为进一步研究金丝桃苷的抗炎机制,我们对金丝桃苷对NLRP3信号通路的影响进行了研究。结果和对照组相比,脂多糖组NLRP3,caspase-1和ASC的表达明显升高。而和脂多糖组相比金丝桃苷处理组NLRP3,caspase-1和ASC的表达受到明显抑制。结论在本实验条件下可得如下结论:①金丝桃苷对LPS所致的急性肾损伤有保护作用;②金丝桃苷的保护作用可能是通过抑制LPS导致的TNF-α,IL-6和IL-1β的合成,并且抑制LPS导致的TLR4表达和NF-κB的活化;③另外,金丝桃苷处理可剂量依赖的抑制NLRP3信号通路。
关键词: 金丝桃苷 ；脂多糖 ；急性肾损伤 ；Toll样受体4 ；NLRP3
被引量
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摘要： 背景和目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的神经系统退行性疾病,影响全球3500万老年人健康。Aβ级联假说被认为是AD的核心病理机制。过去研究表明,Aβ在脑内过度产生和/或清除障碍间的失衡是AD发生的主要机制,且脑内产生Aβ可通过血脑屏障（BBB）进入体循环代谢。我们及同行在前期研究中发现,约有40%-60%脑内产生的Aβ是可以进入外周并被外周系统清除。但目前,外周系统清除Aβ的具体机制尚不清楚。前期研究证明,固有免疫细胞在清除Aβ中发挥重要的作用。其中,小胶质细胞是中枢神经系统中清除脑内Aβ的主要免疫细胞。血液单核细胞作为脑内小胶质细胞的外周对应细胞,被证实在神经保护、神经炎症调控以及Aβ清除功能等方面均较脑内小胶质细胞强。有研究表明,清除或者损坏外周单核吞噬细胞会加重AD小鼠脑内Aβ斑块沉积。以此为据,单核细胞可能在AD的Aβ外周清除中发挥至关重要的作用。近年来全基因组关联分析（GWAS）发现了一系列与AD相关的免疫风险基因突变,这些风险基因突变大多与小胶质细胞和单核细胞的功能及作用相关。以上证据提示外周单核细胞是Aβ外周清除的重要执行者,单核细胞Aβ清除功能障碍很可能参与AD的发生发展。但是,单核细胞Aβ清除功能在衰老和AD中如何变化,单核细胞Aβ清除功能在Aβ外周清除中的贡献大小均不清楚,而增强血液单核细胞的Aβ清除能力是否具有AD干预作用,值得深入研究。基于以上,本研究旨在探索血液单核细胞Aβ摄取功能在衰老和AD中的变化和机制,同时研究单核细胞Aβ摄取功能在Aβ外周清除中作用。根据研究结果进一步探索增强血液单核细胞Aβ摄取功能对AD的干预作用和机制。材料与方法1.分析血液单核细胞Aβ42摄取与血液Aβ水平的相关性本部分实验招募认知功能正常研究对象25例,应用Percoll非连续性密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）,将带FITC荧光标记的Aβ42与单个核细胞进行共同孵育,并应用流式细胞技术及成像流式技术筛选并检测单核细胞亚群(即CD14+CD16-、CD14+CD16+、CD14dimCD16+亚群)的Aβ42摄取功能。同时留取研究对象血浆,通过SIMOA法检测血液的Aβ水平,并应用偏相关分析单核细胞亚群Aβ摄取功能与血液Aβ水平的相关性。2.分析血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变我们于大坪医院健康体检中心纳入22-89岁的认知功能正常研究对象104例,应用Percoll非连续性密度梯度离心法提取PBMC,并应用流式细胞技术筛选并检测单核细胞亚群Aβ42摄取功能。同时应用斯皮尔曼相关分析单核细胞亚群Aβ摄取功能与年龄的相关性。此外,为探索单核细胞亚群Aβ摄取功能随年龄增长的变化轨迹,我们应用Fit spline/Lowess（cubic）spline模型将单核细胞总体、经典型和非经典型亚群的摄取功能与年龄进行曲线拟合。3.分析阿尔茨海默病患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变（1）分析AD患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变纳入AD患者（24例）及其年龄与性别匹配认知正常对照（cognitively normal control,CN,25例）,脑卒中患者（10例）及其年龄与性别匹配CN（10例）。AD患者及相应对照入组后给予神经心理学检测,包括简易智能状态检测（Minimum Mental State Examination,MMSE）,日常生活活动能力（Activities of Daily Living,ADL）、临床痴呆分级评定量表（Clinical Dementia Rating,CDR）和蒙特利尔认知评估（Montreal Cognitive Assessment,Mo CA）等。应用Percoll非连续性密度梯度离心法和流式细胞技术检测并比较AD和脑卒中患者与相应对照间单核细胞亚群Aβ42摄取功能。（2）分析AD患者单核细胞Aβ摄取相关受体及Aβ降解酶的表达水平为探索AD患者血液单核细胞Aβ摄取障碍的潜在机制,我们应用免疫磁珠技术筛选出CD14阳性的单核细胞,并采用流式细胞技术检测主要参与单核细胞介导Aβ胞内摄取的相关表面受体表达变化。同时,应用免疫印迹法检测参与Aβ胞内降解的主要溶酶体酶的表达变化。4.增强单核细胞Aβ代谢功能对AD的干预作用和机制研究（1）云芝多糖对人源单核细胞Aβ代谢功能的影响我们的前期研究结果表明AD患者介导单核细胞Aβ识别的表面受体TLR2表达降低,提示AD患者单核细胞Aβ摄取功能障碍可能与TLR2表达降低有关。故本部分实验应用新型TLR2受体激动剂云芝多糖与单核细胞共同孵育,应用免疫磁珠分离法、流式细胞技术检测云芝多糖对单核细胞对Aβ42摄取功能及该过程相关表面受体表达的影响。同时,应用荧光共聚焦、酶联免疫吸附法及免疫印迹法检测云芝多糖对单核细胞对Aβ胞内提呈和降解的影响。（2）云芝多糖对APP/PS1小鼠认知功能的影响将APP/PS1雌性转基因小鼠被随机分配至两组,分别为云芝多糖预防组和PBS对照组。从小鼠3月龄开始给予云芝多糖腹腔注射（n=8）,注射剂量PSK为2mg/只（相当于100mg/kg）,3次/周,持续6个月。性别年龄匹配的APP/PS1小鼠作为空白对照组（n=8）和性别年龄匹配同窝小鼠作为野生型对照组（n=8）,均腹腔注射等体积的生理盐水,3次/周,持续6个月。既定终点后,三组小鼠均进行Y迷宫、矿场和莫里斯水迷宫等行为学测试。（3）云芝多糖对APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的影响应用流式细胞和成像流式技术检测云芝多糖对小鼠血液单核细胞亚群比例及Aβ摄取功能的影响。对药物处理至9月龄小鼠进行取材。将小鼠大脑右半球进行固定和脱水后切片,用液氮冻存小鼠左半球用于生化分析。通过免疫组织化学染色和ELISA检测AD小鼠脑内及血液的Aβ负荷。（4）云芝多糖对APP/PS1小鼠AD相关病理的影响将小鼠大脑右半球进行固定和脱水后切片,用液氮冻存小鼠左半球用于生化分析。免疫组织化学,免疫荧光染色和ELISA方法分别应用于AD小鼠脑内神经炎症、神经元凋亡和Tau蛋白过度磷酸化等指标检测。结果1.血液单核细胞Aβ42摄取与血液Aβ水平的相关性本研究发现单核细胞三个亚群均具有Aβ42摄取功能。其中,中间型亚群CD14+CD16+的Aβ42摄取功能明显高于其它两个亚群。进一步检测单核细胞Aβ42摄取功能与血液Aβ水平相关性,发现单核细胞总体及CD14+CD16-和CD14dimCD16+亚群的Aβ42摄取功能与血液Aβ42水平呈负相关。此外,单核细胞总体及CD14+CD16-和CD14+CD16+亚群的Aβ42摄取功能与血液Aβ40呈负相关。2.血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变为检测血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变,我们于大坪医院健康体检中心纳入104例22-89岁的认知功能正常研究对象,且不同年龄段（20-45岁、46-65岁、>65岁）间性别比例无统计学差异。我们发现,血液单核细胞总体的Aβ42摄取功能随年龄增长而降低。其中,除CD14+CD16+亚群外,单核细胞CD14+CD16-亚群和CD14dimCD16+亚群的Aβ42摄取功能随年龄增长而下降。在应用Fit spline/Lowess（cubic）spline模型将单核细胞总体、经典型和非经典型亚群的摄取功能与年龄进行曲线拟合后发现,单核细胞总体、CD14+CD16-亚群Aβ42摄取功能在20-40岁阶段下降速度较快,40岁之后下降速度相对较缓。而CD14dimCD16+亚群Aβ42摄取功能在40-60岁阶段下降速度较快,60岁之后下降速度相对较缓。该结果提示,不同单核细胞亚群对Aβ42摄取功能随年龄增长的变化趋势并不相同,且该变化可能早于脑内Aβ病理改变。3.阿尔茨海默病患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变为探究单核细胞Aβ42摄取功能在AD中的改变及其特异性,我们招募24例AD患者、10例脑卒中患者以及其相应性别、年龄相匹配的认知功能正常对照者各25例和10例,并检测其单核细胞Aβ42摄取功能。AD、脑卒中患者在教育年限、APOEε4基因型、高血压、糖尿病、高血脂及相应用药史等方面与其相应对照组间无统计学差异。我们发现AD患者单核细胞总体及亚群Aβ42摄取功能较对照组均降低,脑卒中患者单核细胞Aβ摄取功能较对照组无统计学差异。为探索AD患者血液单核细胞Aβ摄取障碍的潜在机制,我们检测了介导单核细胞Aβ胞内摄取的相关表面受体,包括Toll样受体2（Toll-like receptor 2,TLR2）、抗髓细胞表达触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2）、CD36、CD33以及巨噬细胞清道夫受体1（macrophage scavenger receptor 1,MSR1）。我们发现这其中仅TLR2受体表达在AD中显著下降,而其它相关受体表达在AD和CN间无显著差异。同时,为探究AD中单核细胞摄取Aβ进入胞内后其后续的Aβ降解功能是否异常,我们还检测参与Aβ胞内降解的溶酶体酶的表达量,但均未在AD和CN间发现显著差异。4.增强单核细胞Aβ代谢功能对AD的干预作用和机制研究（1）云芝多糖对人源单核细胞Aβ代谢功能的影响我们的前期研究结果表明AD患者单核细胞TLR2表达降低,而TLR2可与CD14联结合所形成的复合物可介导单核细胞对Aβ的摄取,故AD患者单核细胞Aβ摄取功能障碍可能与TLR2表达降低有关。因此我们接下来探索了激活单核细胞TLR2是否可增强单核细胞Aβ摄取功能,以及是否可降低脑内AD病理并改善认知功能。从云芝栓菌中提取出的云芝多糖（polysaccharide krestin,PSK）可以刺激调节固有免疫途径,增强固有免疫细胞功能。而且,云芝多糖还是一种新型的Toll样受体2（Toll like receptor 2,TLR2）激动剂。因此,我们利用PSK激活单核细胞TLR2观察其对Aβ摄取的影响以及对AD的干预作用。采用流式细胞技术分析并计量单核细胞胞内FITC-Aβ42平均免疫荧光强度后发现,人单核细胞Aβ42胞内摄取随云芝多糖浓度（0-200μg/ml）升高出现先增加后降低的趋势,且100μg/ml为最佳干预浓度。进一步检测云芝多糖对单核细胞Aβ降解的影响,我们发现云芝多糖干预后单核细胞胞内Aβ42水平明显低于对照组,说明云芝多糖可促进单核细胞胞内Aβ42降解过程。通过检测介导人单核细胞Aβ摄取相关的主要表面受体发现,云芝多糖只显著升高单核细胞TLR2的表达。为进一步探究云芝多糖对单核细胞Aβ摄取功能的增强作用是否通过TLR2介导,我们在给予云芝多糖处理前加入TLR2拮抗剂,发现TLR2拮抗剂可几乎抵消云芝多糖对单核细胞Aβ摄取的增强作用。同时,通过计算EEA1+、Lamp1+和Lamp2+内Aβ+42的免疫活性区面积后发现,云芝多糖处理后单核细胞胞内溶酶体途径中有更多的Aβ42,说明云芝多糖能有效促进单核细胞胞内Aβ42的降解。（2）云芝多糖对APP/PS1小鼠认知功能的影响云芝多糖处理组的APP/SP1小鼠在Morris水迷宫中行为学表现均优于注射PBS对照组,表现为逃逸时间减少、穿越隐蔽平台的次数以及在目标象限探索时间显著增加。云芝多糖处理组APP/PS1小鼠在自发性交替实验中表现出更多的进臂总次数,在新臂探索实验中表现出更多的新臂探索次数。同时,云芝多糖处理组APP/SP1小鼠在矿场实验中探索距离也显著高于对照组。以上结果提示,云芝多糖能有效缓解AD小鼠认知功能障碍。（3）云芝多糖对APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的影响本实验发现,云芝多糖能够显著较少APP/PS1小鼠脑内的致密性Aβ斑块（刚果红染色）及总Aβ斑块（6E10免疫组化染色）的数量和面积。ELISA定量分析进一步证实,云芝多糖可显著降低APP/PS1小鼠脑组织提取物Aβ及血液Aβ42含量。以上实验结果提示云芝多糖能够减轻APP/PS1小鼠脑实质及血液Aβ42的水平。通过流式细胞技术比较不同处理组小鼠单核细胞亚群的比例和Aβ42摄取功能发现,
关键词: 阿尔茨海默病 ；衰老 ；Aβ摄取 ；单核细胞 ；云芝多糖 ；防治
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