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摘要： 在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响,证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明在36h分别添加0.5g/L的上述三种氨基酸,发酵液pH和铵离子浓度存在着显著差异,而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍。添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快,达到1.0g/(L.h),胞内丙酮酸积累,丙酮酸羧化酶活性增加20%～95%,柠檬酸合成酶活性降低41%,发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象,最终效价比对照高出45.3%,而总异戊酰组分则降低了23%,其他酰化组分降低了39.6%;添加Ile以后菌体糖耗速率降至对照的30%～40%,柠檬酸合成酶活性降低了47%,发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象。最终效价为对照的85%,而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126%、50%、296%。添加Leu对初级代谢影响不大,异戊酸在胞外积累,随后被重新吸收利用,最终异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III组分分别提高了41%和50%。同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了41.9%,效价和对照基本一致。
关键词: 必特螺旋霉素 ；缬氨酸 ；亮氨酸 ；异亮氨酸 ；有机酸 ；铵离子
被引量
13
摘要： 综合消泡剂的物理消泡效果及其对发酵过程参数的影响2个主要方面,考察4类(共13种)消泡剂对必特螺旋霉素发酵的影响。首先从4类消泡剂中筛选出7种物理效果好的消泡剂,再通过考察这7种消泡剂对必特螺旋霉素生物合成的影响,最后筛选到了消泡、抑泡效果好,并对发酵有显著促进作用的#12消泡剂。在此基础上研究这种消泡剂对发酵过程参数的影响,并优化它的添加浓度,最终使发酵单位提高34.5%。
关键词: 必特螺旋霉素 ；消泡剂筛选 ；物理特性 ；生理代谢
被引量
5
摘要： 在必特螺旋霉素基因工程链霉菌WSJ～1—195发酵生产必特螺旋霉素的摇瓶实验中，发酵36h时向合成培养基中添加0．5g／L的缬氨酸对必特螺旋霉素效价和组分的影响最为显著。实验结果表明：添加缬氨酸后，菌体在发酵48～60h糖耗加快，达到1g／（L·h），发酵液中丙酸和丁酸浓度先增后降，而发酵液中丙酮酸在胞内积累，丙酮酸羧化酶活性在48h和60h时分别增加20％和95％。由于糖耗加快，更多碳流可以通过甲基丙二酰CoA转羧基酶途径（MCT途径）将缬氨酸分解生成的丙酰CoA和丁酰CoA转化为内酯环合成所需要的直接三碳前体，最终效价比对照高出45．3％。添加缬氨酸后，由于大环合成增多，侧链前体的供应无法满足内酯环增加的需求，导致酰化组分含量总体下降，其中总异戊酰组分降低23％，乙酰螺旋霉素Ⅲ降低30．8％，丙酰螺旋霉素Ⅱ降低33％，丙酰螺旋霉素Ⅲ降低48．8％。同时缬氨酸代谢生成的丁酸也有可能会影响异戊酰基转移酶的活性。
关键词: 必特螺旋霉素 ；缬氨酸 ；丙酮酸羧化酶 ；甲基丙二酰CoA
被引量
6
摘要： 为了进一步提高多组分必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量,本文通过外源添加浓度为0.5 g/L的异戊酸使异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量分别比对照提高了38.32%和31%。通过测定必特螺旋霉素发酵过程中糖耗、有机酸、亮氨酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、己糖激酶等中间代谢产物的相关数据,探讨了异戊酸调控必特螺旋霉素组分和效价的机理。
关键词: 异戊酸 ；必特螺旋霉素 ；效价 ；发酵
被引量
3
摘要： 蜱是重要的病原媒介,可传播多种病原体而导致疾病,对人类健康、畜牧业生产和野生动物危害极大。除病原体外,蜱体内还存在多种微生物,如共生菌、共栖菌和机会菌,可参与宿主营养代谢、免疫防御、生殖发育和抵抗逆境等重要生理过程,与病原体的定殖和传播关系密切。目前有关蜱体内细菌与宿主间的互作研究主要集中在少数几种内共生菌,对蜱细菌群落结构与功能及其在宿主生殖发育过程中的作用机制等尚不明确。长角血蜱Haemaphysalis longicornis在我国分布广泛,可传播新布尼亚病毒、淮阳山病毒、螺旋体、泰勒虫、巴贝斯虫、埃立克体和立克次氏体等病原体,严重危害人畜健康。本研究以长角血蜱为对象,应用定量PCR、高通量测序等分子生物学技术,结合细菌共现性网络分析和群落构建零模型,系统分析长角血蜱体内细菌群落结构与功能、细菌的互作关系和群落构建过程;同时通过多组学联合分析,在转录和翻译水平明确细菌群落变化对雌蜱生殖发育的影响,揭示细菌群落在长角血蜱生殖发育过程中的动态变化及作用机制。主要研究结果如下:1、长角血蜱成蜱体内变形菌门Proteobacteria为优势细菌,雌蜱饱血后其相对丰度显著增加。在属水平,短杆菌属Brevibacterium、柯克氏菌属Coxiella、假单胞菌属Pseudomonas等占比较大,雌蜱饱血后Coxiella相对丰度显著增加。雌蜱在吸血前后细菌α多样性差异不显著,饥饿雄蜱细菌α多样性显著高于饥饿雌蜱和饱血雌蜱。细菌宏基因组中存在主要B族维生素与必需氨基酸合成基因。VB2、VB3、VB5、VB6、VB9与2种辅酶FAD（FMN）与NAD+/NADP+合成通路完整。7种必需氨基酸（Lys、Try、Phe、Thr、Ile、Leu、Val）与1种条件必需氨基酸（Tyr）合成通路完整。饥饿成蜱体内Pseudomonas相对丰度最大,其基因组中合成VB与必需氨基酸基因种数最多,其次为红球菌属Rhodococcus和Brevibacterium、窄食单胞菌属Stenotrophomon,Coxiella基因组VB3合成通路完整,其参与多种VB与必需氨基酸合成。这些营养通路组成在雌雄蜱间差异不显著,但基因数量方面雌蜱大于雄蜱。2、四环素处理可影响全蜱和组织内细菌群落组成及互作关系。四环素处理第2天和第4天（T2与T4）,蜱体内Proteobacteria相对丰度增加极显著,Firmicutes极显著降低。Coxiella相对丰度极显著增加,Pseudomonas极显著降低。对照组和实验组α多样性指数差异不显著,β多样性差异显著。中肠细菌丰富度显著降低,少数相对丰度较低的细菌在四环素处理后变化差异显著,优势菌雷尔氏菌属Ralstonia变化不显著;卵巢细菌群落组成处理前后差异不显著;马氏管和唾液腺细菌群落组成及变化趋势相似,对照组和实验组分别以放线菌门Actinobacteriota和Proteobacteria为优势菌门,处理后红球菌属Rhodococcus和贪噬菌属Variovorax等相对丰度极显著降低。唾液腺α多样性在处理后显著增加,其它组织细菌多样性差异不显著。3、经抗生素处理,长角血蜱体内菌群联系更复杂,协同关系增强,在四环素处理48 h内即对蜱消化系统、生殖系统和排泄系统产生明显负效应。卵巢、唾液腺、马氏管菌群结构复杂性增加,卵巢细菌间拮抗效应显著增强,唾液腺和马氏管协同效应显著增强,中肠细菌结构趋于简单,拮抗效应显著增强。长角血蜱体内细菌群落构建过程以随机性过程为主,四环素处理后漂变过程显著增强。卵巢和中肠细菌群落构建过程发生较大改变,中肠细菌随机性过程极显著增强,卵巢确定性过程极显著增强。四环素处理刺激Coxiella增殖,卵巢内Coxiella及总细菌密度显著增加,但全蜱和马氏管细菌密度变化差异不显著。4、细菌群落结构改变可导致雌蜱体色变黑、行为不活跃,卵巢、中肠发育受阻,卵母细胞发育滞后,唾液腺细胞程序性凋亡受到抑制;长角血蜱生殖效率显著降低,卵出现凹陷、干瘪、颜色变深等异常现象,幼蜱孵化率显著降低。5、细菌群落变化显著影响饱血雌蜱基因表达水平,与卵黄发生直接相关的卵黄原蛋白基因（Vg）和卵黄原蛋白受体基因（Vg R）基因显著上调或下调。中肠、脂肪体和卵巢三种组织差异表达基因与KEGG显著富集通路转录调控均以下调为主,随时间推移,细菌群落变化对蜱产生的负效应逐渐增强。显著表达上调基因主要参与细胞过程、遗传信息加工和物质代谢等过程,与细胞凋亡、吞噬体和转录翻译相关的基因上调可揭示一种细胞毒性作用模式。显著表达下调基因主要参与物质代谢和细胞过程,包括N-聚糖生物合成、氨基酸代谢、溶酶体、ECM受体相互作用、激素合成和黏着斑激酶等通路,表明细菌群落变化影响长角血蜱氨基酸代谢、脂类合成和蛋白分解等途径。6、细菌群落变化显著影响长角血蜱代谢过程。四环素处理第2天到第4天差异代谢物种类增加,蜱体内代谢过程变得更复杂。KEGG分析结果显示,第2天125种差异代谢物富集通路以下调为主,主要参与物质代谢,其中烟酸和烟酰胺代谢、醚脂代谢和甘油磷脂代谢通路显著富集。第4天差异代谢物富集通路以上调为主,主要参与物质代谢,其中甘油磷脂代谢通路富集差异极显著。下调通路主要参与物质代谢,其中烟酸和烟酰胺代谢、半乳糖代谢和醚脂代谢通路显著富集。7、多组学联合分析表明,高剂量四环素（150μg/蜱）影响饱血雌蜱关键细菌相对丰度与代谢水平,差异富集通路变化以氨基酸代谢下调为主,进而影响脂质代谢、糖代谢和转录翻译等多种信号通路。四环素注射剂量范围在100μg/蜱,通过VB回补发现饱血雌蜱生殖状况得到一定程度改善。四环素处理对雌蜱生殖发育的影响可能来自于细菌群落和蜱宿主基因水平的共同调控。以上研究结果有助于深入了解长角血蜱体内细菌群落的结构与功能,及其在生殖过程中的作用,进一步阐明细菌群落与蜱宿主生殖发育互作的分子调控机制,为寻找蜱类防控新靶标提供理论依据,具有重要的科学意义和潜在应用价值。
关键词: 长角血蜱 ；四环素 ；生殖异常 ；细菌群落 ；16S rRNA高通量测序 ；转录组学 ；代谢组学
被引量
3
摘要： 氮素是影响作物产量和品质的主要营养元素之一,也是目前肥料补充中最主要的养分,合理施用氮肥对改善土壤质量和保障果实品质有重要作用。为追求产量和经济效益最大化,草莓（Fragaria×ananassa Duch.）栽培中长期大量施用无机肥。虽然无机肥养分浓度高,释放速度快,植物可以直接吸收,短期内可以提高草莓产量,但其营养结构单一,肥效时间短,长期施用会破坏土壤养分平衡,抑制微生物活动,降低土壤质量,最终造成草莓产量和品质下降。有机肥养分全面,有机质含量高,微生物群落多样,肥效时间长,但其养分释放慢,单独施用并不能在短期内改善土壤环境和提供草莓生长所需养分而实现增产提质。氮素有机替代施肥模式中,无机肥的速效养分能满足草莓早期的养分需求,有机肥的有机质和缓释效应可为草莓提供持续全面的养分供给,实现增产提质,是草莓有机农业生产的现实需求,也是一种可持续的土壤管理模式。因此揭示氮素有机替代如何从土壤质量和根系环境方面促进果实品质提升具有重要意义,然而目前有关氮素有机替代对草莓栽培土壤质量改良、根系环境改善和果实品质提升机理罕见报导。 本论文研究以栽培草莓‘圣诞红’为试验材料,开展温室小区试验,共设置5个处理组:control（不施肥）,100%N（无机全氮肥-常规氮肥量）,70%N（常规氮肥减量30%）,GW+70%N（常规氮肥减量30%+园林废弃物肥）,VC+70%N（常规氮肥减量30%+蚯蚓肥）,从土壤质量-根系环境-果实品质三方面,综合研究氮素有机替代对土壤质量提升、根系环境改善和草莓品质提高的生物学机理,为氮素有机替代改善土壤质量和提高草莓品质提供理论依据,也为保持草莓最佳品质和土壤健康可持续管理提供解决方案。本论文主要获得以下研究结果: （1）氮素有机替代显著提高了草莓栽培中土壤有机质（TOM）和速效钾（AK）等土壤养分,增加了微生物量氮（MBN）、可溶性有机氮（DON）和可溶性有机碳（DOC）等土壤氮碳库,激活了土壤蔗糖酶（SC）、1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、β-1,4-葡萄糖苷酶（BG）和过氧化物酶（POD）活性。同时,氮素有机替代改变了土壤微生物多样性和丰富度,以及土壤微生物群落组成,且提高了土壤中细菌放线菌门（Actinobacteriota）、真菌子囊菌门（Ascomycota）和被孢菌门（Mortierellomycota）相对丰度。 在细菌门水平,全氮（TN）、全钾（TK）、硝态氮（NO3--N）、速效磷（AP）、AK、TOM、过氧化氢酶（CAT）和NAG均与放线菌门（Actinobacteriota）呈正相关,与酸杆菌门（Acidobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）呈负相关,同时这些土壤指标与氮素有机替代处理呈正相关,与70%N和control处理呈负相关;在真菌门水平,土壤TN、TP、NO3--N、AP、AK、TOM、脲酶（UR）、CAT、BG和NAG与担子菌门（Basidiomycota）和被孢菌门（Mortierellomycota）呈正相关;同时与氮素有机替代处理呈正相关,与control处理呈负相关。GW+70%N处理下土壤中相对优势真菌为Basidiobolus＿ranarum和Mortierella＿alpina,VC+70%N处理中Escherichia＿coil是土壤中相对优势细菌,Podospora＿immersa是相对优势真菌。 （2）氮素有机替代后草莓根系具有较低根冠比和良好形态特征,根系更加发达,同时根系活力和谷氨酸脱氢酶（GOGAT）活性提高,从而促进了草莓根系生长。草莓根系中,氮素有机替代后生长素（IAA）和其相关衍生物吲哚乙酸-缬氨酸甲酯（IAA-Val-Me）、吲哚-3-乙酸甲酯（MEIAA）、和吲哚-3-甲酸（ICA）水平上升,但色氨酸（TRP）和吲哚（Indole）含量下降,IAA信号转导途径中的3个Auxin/Indoleacetic acid（AUX/IAA）和4个auxin responsive GH3 gene family（GH3）基因表达下调,1个Small auxin upregulated RNA（SAUR）基因表达上调;细胞分裂素（CTK）相关衍生物玉米素核苷（2Me Sc ZR）、双氢玉米素-7-糖苷（DHZ7G）、N6-异戊烯腺嘌呤（IP）、异戊烯腺嘌呤核苷（IPR）、顺式玉米核苷-O-糖苷（c ZROG）、异戊烯腺嘌呤-7-葡糖苷（i P7G）、N-6-异戊烯基-腺苷5'-单磷酸酯（i PRMP）、反式玉米素（t Z）、反式-玉米素-9-β-葡萄糖苷（t ZOG）、玉米素核苷（t ZR）和双氢玉米素核苷（DHZR）水平上升,CTK生物合成相关基因Phosphate-isopentenyltran ferase（IPT）基因和3个Cytokinin oxidase/dehydrogenase（CKX）基因表达上调,CTK信号转导途径中大量Type B Arabidopsis response regulator（B-ARR）基因表达上调;茉莉酸（JA）和其相关衍生物茉莉酸-缬氨酸（JA-Val）、12-氧-植物-二烯酸（OPDA）、氧化戊烯基环戊烷丁酸（OPC-4）、茉莉酸甲酯（MEJA）和茉莉酸-异亮氨酸（JA-ILE）水平上升,JA生物合成通路中关键基因Lipoxygenase（LOX2S）、hydroperoxide lyase（HPL1）和hydroperoxide dehydratase（AOS）基因表达上调,JA信号转导通路中Myelocyto-Motosis2（MYC2）基因表达上调,Jasmonate zim（JAZ）基因表达下调;水杨酸（SA）和水杨酸-2-O-β-葡萄糖苷（SAG）含量均升高,SA生物合成途径中的aspartate aminotransferase,cytoplasmic（GOT1）和Phenylalanine ammonia-lyase（PAL）基因在VC+70%N时显著上调表达,SA信号转导通路中的TGACG-Binding factor（TGA）基因和pathogenesis-related protein 1（PR-1）基因表达上调;脱落酸（ABA）和脱落醛（ABA-ald）水平提高,ABA信号转导途径中大量Pyrabactin resistance/PYR-like（PYR）基因表达上调,而protein phosphatase 2C（PP2C）基因表达下调。赤霉素（GA）相关衍生物赤霉素3（GA3）含量下降,GA生物合成相关的ent-kaurenoic acid monooxygenase（KAO）和大部分gibberellin-44dioxygenase（GA20ox）基因表达下调,GA信号转导途径中DELLA基因大部分表达上调。乙烯（ETH）合成前体1-氨基环丙烷羧酸（ACC）含量下降,ETH信号通路中serine/threonine-protein kinase（CTR1）基因大部分表达上调。 （3）氮素有机替代显著提高草莓植株的茎粗、叶面积、冠径和生物量,也促进草莓叶片、根系和果实中氮磷钾的吸收,提高草莓果实产量。同时氮素有机替代提高草莓果实糖酸比、抗坏血酸和营养元素磷（P）、钾（K）、铁（Fe）和锌（Zn）含量,降低了苹果酸含量。构建了4个响应施肥的草莓品质相关的分子调控网络,其中子网络Sub N-1调控氨基酸代谢,子网络Sub N-2调控苯丙类代谢,子网络Sub N-3和Sub N-4调控碳水化合物代谢,子网络中草莓果实品质相关的碳水化合物代谢、氨基酸代谢和苯丙类代谢为主的中心代谢途径中代谢物积累和基因表达在不同施肥处理下被重新编程,这影响了草莓果实中碳代谢和氮代谢间的代谢物流动。通路图发现氮素有机替代后促进了草莓果实中果糖-6-磷酸（F-6-P）、果糖-1,6-二磷酸（F-1,6-BP）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、葡萄糖-1,6-二磷酸（F-1,6-BP）、海藻糖-6-磷酸（T-6-P）和赤藓糖-4-磷酸（E-4-P）等糖和糖衍生物的积累,苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、亮氨酸（Ile）和异亮氨酸（Leu）、组氨酸（His）、谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）水平提高,并增加了酚酸和类黄酮物质的积累。 本论文综合研究草莓栽培中,氮素有机替代后土壤质量提高、根系环境改善和果实品质提升机理,为氮素有机替代调节土壤质量、根系环境和果实品质提供理论依据,也为保持草莓最佳品质和维持土壤质量可持续管理提供解决方案。
关键词: 草莓 ；氮素有机替代 ；土壤质量 ；根系环境 ；果实品质
摘要： 抗生素是目前用于治疗或对抗病原体的关键化合物,然而,由于滥用等因素,导致耐药性问题日益严峻,因此需要寻找高效、低毒、安全的替代品。抗菌肽因其独特的抗菌机制和安全性成为研究热点。表面活性素是其中一类具有抗菌活性的脂肽,具有良好抗菌性及潜在的临床应用前景,然而,当前对表面活性素抗菌作用研究主要集中在表面活性素混合物或C14和C15-表面活性素上,而对其他表面活性素同系物的抗菌活性、抗菌机制以及前体物支链氨基酸对其合成的调控机制仍缺乏研究。本研究以课题组在北部湾红树林中筛选到的一株具有良好抗菌性代谢产物的YA215菌株为出发菌,旨在分析其表面活性素的抗菌活性和机制及支链氨基酸对其合成的调控机制,以期为新型抗菌化合物的发现提供新的思路和技术支持。本论文主要研究内容和结果如下:
（1）对YA215菌株进行鉴定和基因组功能解析,以了解该菌株的基因组特征、功能及代谢潜力。YA215菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,其基因组大小为3976514 bp,GC含量为46.56%,编码3809个DNA序列,含有27个rRNA、86个tRNA和79个sRNA。功能注释分析发现编码基因主要涉及127个碳水化合物酶、41条代谢途径和氨基酸转运、代谢、转录和碳水化合物转运等生物学过程。anti SMASH分析发现了13个次级代谢产物合成基因簇,其中非核糖体肽类基因数量占总预测次级代谢产物基因数的29.15%,且大多为脂肽类化合物。
（2）Bacillus velezensis YA215脂肽的抗菌活性追踪及其关键抗菌化合物的鉴定与性质分析。研究发现,B.velezensis YA215脂肽粗提物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌表现出广谱抑菌性。通过分析其脂肽粗提物,鉴定出表面活性素、伊枯草菌素和丰原素三大类化合物,其中纯化得到C12-surfactin,其在0-60℃和p H 2.0-10.0范围内抗菌性稳定,耐受蛋白酶水解,并具有较低的溶血活性,其抗菌效果优于乳酸链球菌素,稍弱于硫酸庆大霉素。
（3）研究C12-表面活性素对大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）的抗菌机制,评估其在乳制品中的抗菌效果。研究发现C12-表面活性素对E.coli和S.aureus的最低抑菌浓度依次为7.5μg/mL和1.87μg/mL,最低杀菌浓度依次为30μg/mL和7.5μg/mL。其通过降低病原菌细胞的代谢活性、增加活性氧产生、破坏细胞膜的通透性和完整性、靶向与肽聚糖和DNA合成相关的酶和破坏DNA结构等机制发挥抗菌作用。C12-表面活性素添加到牛奶中25℃贮藏72 h,与空白对比其中E.coli和S.aureus的浓度分别由8.5降至5.1 log CFU/mL和8.1降至5.0 log CFU/mL。
（4）探讨发酵底物中添加支链氨基酸（Leu、Ile和Val）对B.velezensis YA215的脂肽表面活性素分泌及抗菌活性的影响。研究表明,支链氨基酸的添加显著增强了脂肽粗提物对E.coli和S.aureus的抑菌效果,其中添加Val时表现最为显著。支链氨基酸的添加导致表面活性素脂肪酸链组成明显改变,特别是添加Val时,iso C14和iso C16β-羟基脂肪酸的比例分别由13.3%和4.216%增加到23.803%和8.31%;同时,肽链中7号位的氨基酸组成也发生显著变化,尤其是Val的添加导致C14[Val 7]和C16[Val 7]表面活性素的比例分别增加了3.29和30.88倍。这些结果推测可能与表面活性素抗菌活性的增强有关。
（5）通过转录组测序分析支链氨基酸（Leu、Ile和Val）对B.velezensis YA215合成表面活性素的调控机制。结果显示氨基酸的添加影响了表面活性素产量,调节了大量基因的差异表达。功能分析结果表明,在与空白对照组相比,添加Val组中差异基因主要富集于核糖体和生物素代谢通路,而添加Leu和Ile组则主要富集于非核糖体肽结构通路。此外,发现各组中具有最大差异倍数的基因主要涉及到氨基酸代谢、脂肪酸代谢、TCA循环、转录调控因子等多个功能模块。特别值得注意的是,在菌株中表达差异倍数较大且属于高表达的基因（如gap A、abr B、phr A、fab I、sec Y等）,可能在表面活性素合成途径中发挥着重要作用。进一步分析发现支链氨基酸的添加可能主要影响YA215菌株中fab G的表达,进而影响表面活性素的合成。
本课题首次从贝莱斯芽孢杆菌的代谢产物中分离并纯化出具有广谱优异抗菌活性的C12-表面活性素,揭示了支链氨基酸对表面活性素调控机制。本研究不仅为新型抗菌剂的开发提供了重要的理论和实验依据,还为深入理解支链氨基酸对表面活性素生物合成的调控机制提供了关键线索。
关键词: 贝莱斯芽孢杆菌 ；表面活性素 ；抗菌机制 ；支链氨基酸 ；调控机制 ；转录组分析 ；基因组分析
被引量
1
摘要： 小麦(Triticum aestivum L.)是全球重要的粮食作物之一,为人类提供营养和能量,其产量在保障粮食安全方面发挥重要的作用。然而,随着土地资源紧缺、气候变化和人口增长等挑战日益严重,当前小麦产量已经不能满足人类的需求。根系是作物营养和水分吸收的重要器官,也是新一轮绿色革命研究的关键,因地制宜调整根系,有利于提高作物产量和优化作物品质。生长素是一类重要的植物激素,参与调控植物生长发育等众多生物学过程,尤其在调控根系生长、侧根发育等过程中发挥着不可替代的作用。因此,本研究利用转录组测序方法对两种不同浓度生长素处理后的中国春小麦根系进行转录组差异分析,然后对转录组数据进行GO和KEGG通路富集分析、加权基因共表达网络分析,全面揭示了小麦根系生长素响应基因的表达、相互关系以及调控网络,为克隆关键生长素响应基因进而改良小麦根系提供基因资源。此外,我们以筛选到的b ZIP转录因子为出发点,首先在小麦基因组中筛选出所有可能的b ZIP转录因子,然后与拟南芥和水稻等b ZIP转录因子构建系统进化树并进行亚家族分析,通过分析生长素响应TabZIPs的基因保守基序和基因结构,推测不同亚家族的生长素响应TabZIPs在调控小麦生长发育中的潜在功能,最后挑选其中一个对两种浓度生长素均响应且表达下调的TabZIP6D＿147基因,利用转基因方法在植物体内对该基因的功能进行验证。主要研究结果如下:1.转录组测序结果表明,两种不同浓度生长素处理中国春小麦根系后,共有8747个差异表达基因(DEGs)。其中1μM生长素处理下有634个DEGs,包括326个下调基因和308个上调基因;50μM生长素处理下有8451个DEGs,包括6118个下调基因和2333个上调基因。差异表达基因分析表明,1μM和50μM生长素处理下基因下调表达的趋势更为强烈,而且50μM生长素对小麦根系发育的调控模式更加精细和复杂。2.通过差异表达基因的GO富集分析,发现两种浓度生长素处理后具有类似的显著富集的GO,并且KEGG通路富集分析表明两种浓度生长素处理后显著富集的通路途径也类似,例如碳水化合物代谢、谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢和能量代谢相关途径,说明这两种浓度生长素处理可能在调控小麦根系发育存在相似的分子机制。此外,1μM生长素的抑制作用主要体现在糖酵解和糖异生、铂耐药和缬氨酸(Val)、亮氨酸(leu)和异亮氨酸(Ile)的降解通路以及谷胱甘肽代谢通路的富集,而50μM生长素处理下碳代谢、苯丙烷类生物合成、谷胱甘肽代谢通路的富集突出高浓度生长素对小麦根系造成了胁迫影响。3.通过加权基因共表达网络分析,从三个关键模块中共筛选22个参与调控小麦根系发育的生长素响应核心基因,其中蛋白激酶相关基因可能作为调控中心基因响应外源生长素。其次,较高浓度的生长素激活了小麦根系多种解毒过程,包括参与I相解毒反应的多个细胞色素P450基因、参与Ⅱ相解毒反应的谷胱甘肽S-转移酶基因和UDP-糖基转移酶基因以及参与Ⅲ相解毒反应的重金属转运/解毒蛋白家族如寡肽转运蛋白基因(OPT)、多药物及有毒化合物外排转运蛋白家族基因(MATE)和铁转运蛋白基因(Ccc1)。此外,与光合作用和糖代谢相关基因以及b ZIP、Dof、AP2/ERF等转录因子也参与小麦根系发育,说明小麦可能以维持较低水平的根系生长发育来适应较高浓度生长素处理。4.应用生物信息学方法在小麦基因组中共鉴定到176个小麦TabZIP基因,系统进化树、基因保守基序和基因结构分析表明小麦TabZIPs基因可分为9个亚家族。同时转录组测序结果表明共有22个生长素响应TabZIPs,其中响应1μM生长素处理的有4个TabZIPs,且均为下调表达基因;响应50μM生长素处理的有21个TabZIPs,其中4个TabZIPs为上调表达基因,17个TabZIPs为下调表达基因;3个TabZIPs在两种浓度处理下均下调表达。这些生长素响应TabZIPs主要分布在亚家族1,4,5,6,7,8,9,而这些亚家族的TabZIPs已被证实参与赤霉素、光、糖以及脱落酸等信号通路,说明这些生长素响应TabZIPs可能具有多种生物学功能,进一步深入鉴定这些生长素响应TabZIPs基因功能,有助于全面解析小麦根系生长发育的分子网络。5.将对两种浓度生长素响应并且均下调表达的TabZIP6D＿147在拟南芥长根突变体hy5中过量表达,发现TabZIP6D147/hy5互补系的根系表型与野生型Ws的无明显差异,该结果进一步在植物体内证明小麦TabZIP6D＿147能抑制根的生长发育,在生长素信号通路中起到负调控的作用。
关键词: 小麦根系 ；转录组测序 ；加权基因共表达网络分析 ；TabZIPs ；TabZIP6D＿147 ；功能验证
被引量
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摘要： 铜是机体生长必需的微量元素。大量研究表明,高铜可改善仔猪的生产性能和饲料报酬,在养猪生产中曾广泛应用。但饲料中的铜利用率低,高铜添加导致的环境污染引起了高度的重视。长期饲喂高铜日粮不仅导致养殖环境铜累积,还可能导致猪的氧化应激、生长性能下降和组织铜蓄积以及潜在的食品安全风险。研究不同生长阶段猪的代谢、生理和肠道菌群对日粮铜水平和剂型的响应,在保障养殖生产效益的前提下,科学地降低铜的添加是当前重要的研究内容。因此,本文研究了在断奶和生长育肥阶段添加不同剂量硫酸铜对猪铜沉积、养分利用及育肥猪肉品质的影响,同时探究了降低铜添加水平对猪氧化应激和肠道菌群紊乱的缓解效果。此外,对甘氨酸铜替代硫酸铜的饲喂效果进行了研究。本文的主要研究结果如下:(1)试验一选择21日龄断奶仔猪48头,随机分为4组。分别饲喂添加不同水平硫酸铜(0、20、100和200 mg Cu/kg饲料)的日粮,并于试验开始后3周和6周屠宰取样。随着日粮铜水平增加,肝脏、肾脏和脑中铜的沉积增加(P<0.05)。试验3周后,随着日粮铜水平增加,血清MDA水平先降低后升高,GPX、CP和CAT活性先升高后降低(P<0.05)。日粮高水平的铜(200 mg Cu/kg饲料)显著影响回肠和盲肠微生物菌群的成分(P<0.05),显著增加肠道大肠杆菌耐氯霉素和环丙沙星的比率(P<0.05)。菌群丰度的改变可能与仔猪能量代谢、蛋白质代谢和氨基酸生物合成与代谢等代谢功能有关。(2)试验二选择21日龄断奶仔猪102头,随机分为6组。第一阶段分别饲喂添加不同水平硫酸铜(0、25、50、75、100和125 mg Cu/kg饲料)的日粮至25 kg左右,第二阶段所有试验猪饲喂含25 mg Cu/kg饲料的日粮至100 kg左右,并于试验开始后3周和试验结束屠宰取样。结果表明,3周后,生长性能无显著差异(P>0.05)。断奶仔猪肝脏、肾脏、盲肠内容物和粪便中铜水平随日粮铜水平增加而增加(P<0.05)。随着日粮铜水平增加,断奶仔猪十二指肠和空肠隐窝深度以及粗蛋白和能量表观消化率先增加后降低(P<0.05)。十二指肠和空肠隐窝深度以及粗蛋白和能量表观消化率与日粮铜水平呈现显著的二次曲线的关系(P<0.05)。二次曲线顶点处日粮铜水平分布范围为19.50-63.83mg/kg。随着日粮铜水平增加,育肥期背肌游离Phe、Thr、Met、Val和Leu水平以及股二头肌游离Phe、Val、Leu和Ile水平降低(P<0.05),背肌UFA相对含量和UFA/SFA比例以及股二头肌系水力先增加后降低(P<0.05)。因此,推荐断奶仔猪(体重不超过25 kg)适宜日粮铜水平范围为19.50-63.83 mg/kg。(3)试验三选择体重约25 kg的仔猪1200头,随机分为5组。分别饲喂添加不同水平硫酸铜(0、4、8、16和32 mg Cu/kg饲料)的日粮至110kg左右。随着日粮铜水平增加,粪便铜水平增加(P<0.05),血清ALP活性和胴体中骨的比率先增加后降低(P<0.05),背肌滴水损失先降低后增加(P<0.05)。8 mg Cu/kg日粮铜添加组血液Lym计数显著高于其他各组(P<0.05)。血清ALP活性和背肌滴水损失与日粮中铜水平呈现显著的二次曲线关系(P<0.05)。二次曲线顶点处日粮铜水平分布范围为15.74-20.00 mg/kg。因此,推荐生长育肥猪(25-110 kg)适宜日粮铜水平范围为15.74-20.00 mg/kg。(4)试验四选择21日龄断奶仔猪68头,随机分为4组。第一阶段分别饲喂添加硫酸铜(0、25、125 mg Cu/kg饲料)和甘氨酸铜(25 mg Cu/kg饲料)的日粮至25 kg左右,第二阶段所有试验猪饲喂含25 mg Cu/kg饲料的日粮至100 kg左右,并于试验开始后3周和试验结束屠宰取样。与25 mg Cu/kg日粮硫酸铜添加组比较,甘氨酸铜组断奶仔猪肝脏锰的沉积、空肠隐窝深度、粗蛋白和能量表观消化率以及盲肠微生物菌群的Shannon指数显著降低(P<0.05),血清P水平显著增加(P<0.05),盲肠内容物和粪便铜水平呈现降低的趋势(P>0.05)。与25 mg Cu/kg日粮硫酸铜添加组比较,甘氨酸铜添加组育肥期背肌游离Lys和Thr水平显著提高(P<0.05)。简言之,甘氨酸铜在替代无机铜的应用上并没有明显的优势。综上所述,日粮高水平铜添加不适合应用于养猪生产中,断奶仔猪和生长育肥猪适宜日粮铜水平范围分别为19.50-63.83 mg/kg和15.74-20.00 mg/kg,甘氨酸铜在替代无机铜的应用上并没有明显的优势。
关键词: 铜需要量 ；断奶仔猪 ；育肥猪 ；甘氨酸铜 ；肠道微生物
被引量
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摘要： 格尔德霉素(geldanamycin,GDM)是一种苯(醌型)安莎类抗生素,是分子伴侣热休克蛋白90(Hsp90)的特异性抑制剂,具有抗肿瘤和抗病毒等生物学活性。但是,GDM具有严重的肝脏毒性,且水溶性和光稳定性较差,限制其开发成为药物,因此,它只作为一个重要的抗肿瘤药物开发先导化合物。近年来,寻找水溶性好、肝毒性低的格尔德霉素衍生物成为新的研究热点。
本文通过对吸水链霉菌17997格尔德霉素生物合成PKS后修饰gdmN-(编码氨甲酰基转移酶)变株的次级代谢产物分析,发现了一个预期的新格尔德霉素衍生物,4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基-19-S-甲基格尔德霉素。gdmN变株发酵上清液乙酸乙酯提取后,进行硅胶板TLC分析；对一个红色目标化合物进行HPLC和高分辨质谱分析,并对其进行了1H-和13C-核磁共振分析；对红色目标化合物在吸水链霉菌17997格尔德霉素PKS基因阻断变株中进行了生物转化实验。
结果显示：在gdmN-变株发酵产物中发现了1个预期的红色目标化合物(4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基-19-S-甲基格尔德霉素)；该化合物可被格尔德霉素生物合成PKS后修饰系统7-O-氨甲酰化,生成4,5-双氢-19-S-甲基格尔德霉素,但不能C-4,5氧化。
4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基-19-S-甲基格尔德霉素的发现,以及早期发现的19-S-甲基格尔德霉素和4,5-双氢-19-S-甲基格尔德霉素,加深了对天然存在于吸水链霉菌17997格尔德霉素生物合成PKS后修饰系统以外修饰的认识。通过分析生物转化产物,证实19-S-甲基化修饰对格尔德霉素生物合成PKS后修饰系统中的氨甲酰基化没有影响,而对C-4,5氧化具有抑制作用。
必特螺旋霉素是由基因工程重组菌Streptomyces spiramyceticus WSJ-1产生的一组以4"异戊酰螺旋霉素为主组分的十六元大环内酯类抗生素。将来自碳霉素生物合成中的4"异戊酰基转移酶(ist, carE或acyB1)基因导入到螺旋霉素产生菌中,所表达的酶可以对螺旋霉素进行4"异戊酰化。
已知acyA和acyB1-acyB2这3个基因,acyA主要负责十六元内酯环上C3-羟基的乙酰基化。而acyB1-acyB2负责十六元内酯环C5上连接的糖基的异戊酰基化。acyB1基因编码4"异戊酰基转移酶。Arisawa等人推测acyB2基因是acyB1基因的正调控基因,但是acyB2的表达产物对acyB1基因的调控结合位点并不清楚。本研究的目的是确证acyB2基因表达产物的DNA结合区,为acyB2基因是acyB1基因的正调控基因提供直接证据；同时,将为应用生物技术手段构建必特螺旋霉素高产菌株提供更加坚实的理论依据。
我们首先将acyB2基因克隆到pMD18-T Simple Vector上,获得pMA01基因重组质粒并测序验证无误。然后,采用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切,切下acyB2基因并插入到冷休克表达载体pCold Ⅱ Vector (利用大肠杆菌冷休克基因cspA启动子序列的蛋白质表达系统,采用低温诱导方法,蛋白质表达量和可溶性较高)中,获得pCA01重组质粒。将pCA01重组质粒导入到E. coli Competent Cell BL21中进行异源表达,发现目的蛋白以包涵体形式存在。随后尝试更换表达宿主,Chaperone Competent Cells BL21系列——分别含有一种伴侣蛋白质粒,能有效表达一组协同作用、共同参与蛋白折叠的分子伴侣(以增加可溶性蛋白表达水平),但仍没有获得可溶性目的蛋白。最后,我们对以包涵体形式表达的目的蛋白进行了纯化和复性。
acyB2与acyB1间有段约300bp的DNA片段,我们推测其中可能包含acyB2编码蛋白的DNA结合区(以正调控acyB1转录表达)。我们设计PCR引物,扩增该300bp DNA片段,标记后作为探针,利用凝胶阻滞实验,以确证acyB2蛋白的DNA结合位点,但是没有成功。
关键词: gdmN- ；格尔德霉素生物合成 ；PKS后修饰 ；必特螺旋霉素 ；异戊酰基转移酶基因 ；正调节基因 ；蛋白表达
摘要： 目的:肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）是由肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）引起的肺炎。该病原体在儿童群体中尤为常见,是儿童呼吸道感染的重要病因之一。虽然MPP通常具有自限性,但若不及时治疗,可能导致并发症和病情加重[1-2]。目前,临床上常采用阿奇霉素等大环内酯类抗生素进行治疗,但由于滥用导致耐药性逐渐增强,药物疗效受到挑战。此外,部分患者需使用甲泼尼龙等肾上腺皮质激素以减轻炎症反应,但此类治疗可能引发免疫抑制和代谢紊乱等副作用[3-5]。 近年来,随着组学技术的持续发展,蛋白质组学和代谢组学在MPP致病机制的研究中展现出了越来越重要的作用。这些技术的应用不仅丰富了我们对MPP病理过程的理解,也为相关疾病的诊断和治疗提供了新的思路和方法。同时,这些技术也为相关生物标志物的鉴定提供了重要支持。在现有研究中,通过对MPP患者的代谢组数据进行随机森林分类模型构建,鉴定出Cer等代谢物为潜在生物标志物,表明MPP发病过程中发生细胞膜损伤和免疫激活[6]。然而,这些研究存在局限性:首先,多数研究仅依赖单一组学数据,忽视了不同生物层次间的互补信息,限制了对疾病全貌的全面解析;其次,大多数研究样本仅来源于血液,无法直观反映肺部的病理变化,影响了结果的特异性和临床应用价值[7-8]。鉴于上述不足,本研究采用多组学整合策略,以MPP患儿肺泡灌洗液样品蛋白质组学和代谢组学为研究对象,对在此病发生、发展过程中起着关键作用的生物分子进行分析。通过应用随机森林等机器学习算法,并结合富集分析、聚类分析以及相关性分析等生物信息学方法,对这些生物标志物的生物功能及其相互作用网络进行更深层次的分析。这一研究不仅有助于揭示MPP的潜在致病机制,同时也为临床诊断和治疗提供了重要的理论依据。 方法:1.本研究分析了2023年10月至2024年3月在深圳市南山区人民医院57例接受无痛电子支气管镜检查,确诊为肺炎支原体肺炎（MPP）的患者临床数据。根据病情的严重程度,将患者分为轻症组（Mild组,19例）和重症组（Severe组,38例）。 2.蛋白质组学采用超高液相色谱质谱联用技术。对质谱数据进行质量控制评估,评估内容包括肽段长度、数量分布、蛋白质覆盖度、蛋白质分子量分布等。通过对蛋白质的强度值进行中心化变换的方法,对不同样本中的蛋白质进行比较量化的分析。 3.代谢组学研究应用超高液相色谱质谱联用技术。首先进行数据质量评估和质量控制,以确保分析结果符合标准,随后对样本进行中位数标准化处理。 4.机器学习采用随机森林模型。在训练好的随机森林模型中使用Importance函数计算特征重要性,用ROC曲线对模型效果进行评估。 5.使用单变量T检验评估不同分组的显著性差异。采用主成分分析（PCA）降维,展示样本分布特征。为减少噪音干扰,应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）,通过最大化组间差异和最小化组内差异,提升模型判别能力。 6.采用GO和KEGG数据库对差异表达蛋白质进行功能注释和通路分析。首先,通过GO数据库从分子功能、生物过程和细胞组分三个层次对蛋白质进行二级分类。其次,结合KEGG通路富集分析,探讨差异蛋白在代谢通路中的分布及其参与的生物学过程。 7.利用STRING数据库分析比较组间差异蛋白的相互作用关系。首先,以差异倍数1.5为筛选标准,筛选出差异蛋白,并提取其数据库编号或氨基酸序列。随后,在STRING数据库中进行检索,构建蛋白质相互作用网络。 结果:1.本研究共鉴定出613个具有显著差异的蛋白质（P<0.05）。其中,287个蛋白质的表达水平显著上调,326个蛋白质的表达水平显著下调。火山图分析显示,上调最显著的5个蛋白质为MYO7A、CATSPERG、MED7、HBZ和CDKL5;下调最显著的5个蛋白质为KRT4、PAPOLG、PRR4、MYOCD和BPIFA2。主成分分析（PCA）结果表明,轻症组与重症组之间存在显著的蛋白质表达差异,这些差异蛋白能够有效区分两组样本。 2.通过蛋白质组学筛选,确定了7种与炎症相关的KEGG通路。这些关键通路包括精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、p53信号通路以及酪氨酸代谢等。进一步对这些通路中的蛋白质进行PPI网络分析,结果显示存在4个相对明显的子网络。 3.炎症相关的代谢通路中,蛋白质和代谢物呈现正向或者负向协同作用。其中,鸟嘌呤（Guanine）和蛋白质FMO3、CKMT1A、FMO5、SERPINB5、ALDH3A1、SFN、MAOB、ERCC1、MAOA呈现较强的正相关性,P值很小（相关系数≥0.46,P<0.00001）。 4.通过研究,共鉴定出106个具有显著差异的代谢物（P<0.05）,其中上调与下调的代谢物各53个。火山图显示,TOP5上调代谢物包括:Arg Ala Trp Val、Lys Asp Trp Trp、Leu Lys Val、Met Ile Met Ala、Arg Tyr Thr;TOP4下调代谢物包括:1-（2-Hydroxyethyl）-2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol、2-Oxiraneoctanoic acid,.eta.-hydroxy-3-octyl-、5-Hydroxyindoleacetic acid、Pro Tyr Lys。代谢物的主要种类及数量包括:六种有机酸及其衍生物、两种脂类及类脂分子、一种类苯化合物以及有机杂环化合物。 5.代谢组学分析结果显示,四条与炎症相关的KEGG通路被筛选出来,具体包括胞吐、脂肪酸延长、D-氨基酸代谢以及克拉维酸生物合成。在这些通路中,左旋精氨酸和棕榈油酸被鉴定为差异代谢产物。 6.对106个代谢物进行斯皮尔曼相关性分析的结果显示,相关性矩阵可划分为9个不同的模块。其中,5个模块呈现正相关关系,其余4个模块则表现出负相关关系。 7.对肺炎支原体肺炎轻症和重症患者之间变化倍率最高的两个蛋白质（SAT1、TNFRSF10B）及代谢物（4-Nitrophenol、L-Arginine）,进行随机森林机器学习模型的构建,预测值为正的蛋白质和代谢物有2个分别为:4-Nitrophenol（importance=4.14）、SAT1（importance=1.5）。预测值为负的蛋白质和代谢物有2个分别为:TNFRSF10B（importance=-0.08）、L-Arginine（importance=-3.69）。代谢物4-Nitrophenol对预测轻重症的贡献最大。 8.构建ROC曲线对随机森林模型进行评价,曲线下面积（AUC）为0.92,敏感性（SEN）0.8,特异性（SPE）1,模型预测效果好。 结论:1.研究共鉴定出613个差异表达蛋白质和106个差异代谢物（P<0.05）。这些蛋白质和代谢物在区分轻症组与重症组方面表现出良好的鉴别能力。 2.蛋白质组学和代谢组学研究分别筛选出7个和4个与炎症有关的KEGG通路。这些通路主要包括精氨酸和脯氨酸代谢,p53信号通路,脂肪酸延长等。 3.通过分析蛋白质与代谢物之间的相关性,研究发现鸟嘌呤与蛋白质FMO3、CKMT1A、FMO5、SERPINB5、ALDH3A1、SFN、MAOB、ERCC1和MAOA呈现较强的正相关性（相关系数≥0.46,P<0.00001）。 4.对变化倍率最高的两个蛋白质（SAT1、TNFRSF10B）及代谢物（4-Nitrophenol、L-Arginine）进行随机森林机器学习模型的构建,发现4-Nitrophenol对预测轻重症的贡献最大（importance=4.14）。 5.构建ROC曲线对随机森林模型进行评价,曲线下面积（AUC）为0.92,敏感性（SEN）为0.8,特异性（SPE）为1,模型预测效果良好。
关键词: 肺炎支原体肺炎 ；蛋白质组学 ；代谢组学 ；机器学习 ；生物标志物 ；生物信息学分析 ；炎症通路
摘要： 必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)是将耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)的4”-O-异戊酰基转移酶基因(4"-O-isovaleryltransferase gene,ist)整合至螺旋霉素产生菌S. spiramyceticus F21基因组所获得的基因工程菌产生的,主成分为4”-O-异戊酰螺旋霉素(4"-O-isovalerylspiramycin, ISP)。ist基因表达水平的提高可提高必特螺旋霉素中ISP的比例,从而简化其生产工艺,降低生产成本。本文对ist的特异性调控基因进行研究,为提高ist基因的表达水平提供了重要依据。有研究推测acyB2基因可能是ist的正调控基因,但未从基因功能上予以证实。本研究将耐热链霉菌中的acyB2基因失活后,突变菌株无法合成碳霉素,acyB2的回复可以使碳霉素重新产生,利用链霉菌强启动子ermE*p过表达acyB2基因能够大幅度提高碳霉素的产量。结果证实acyB2是碳霉素生物合成的正调控基因。本研究还在耐热链霉菌中克隆到一个与acyB2基因连锁的新调控基因cbmR。阻断cbmR基因也导致菌株无法合成碳霉素,回复cbmR基因可以恢复碳霉素的产生。但是利用强启动子ermE*p过表达cbmR,碳霉素的合成反而受到了抑制。通过qPCR在野生菌株、acyB2阻断菌株和cbmR阻断菌株中检测了碳霉素生物合成基因的转录水平,结果显示AcyB2和CbmR可激活碳霉素生物合成基因簇中多数基因的转录,包括ist基因。在acyB2过表达菌株中,被调控的靶基因也过表达,而cbmR过表达菌株中靶基因的表达反而被抑制,这与碳霉素合成的结果一致。为了研究cbmR和acyB2的调控机制,通过优化表达条件,获得CbmR和AcyB2蛋白在E. coli BL21(DE3) /pKJE7中的可溶性表达。螺旋霉素生物合成基因簇中含有与acyB2和cbmR同源的两个调控基因srm40和srm22,srm40是螺旋霉素生物合成的途径特异性正调控基因,srm22又正调控srm40的表达。在麦迪霉素生物合成基因簇中也有同源的两个正调节基因orf27和orf28, orf28正调控orf27。碳霉素、螺旋霉素和麦迪霉素属于结构相似的16元大环内脂,生物合成基因在进化上也存在相似性,同源的正调控基因功能很可能相似,能进行交叉调控。本研究将三组同源调控基因cbmR/acyB2、srm22/srm40和orf28/orf27分别与ist基因一起转化到变铅青链霉菌TK24中,共构建了包括阳性对照和阴性对照在内的9种转化子,对螺旋霉素进行生物转化。通过检测发酵产物中ISP的产量,发现双调控基因cbmR-acyB2、 srm22-srm40对ISP转化率比单调控基因acyB2、srm40的转化率低,而orf28-orf27却明显好于单个调控基因ofr27。其中acyB2和orf28-orf27对提高ist基因的表达的效果最好,甚至超过强启动子ermE*p。而在发酵培养基中加入4mM不同的L-氨基酸可明显提高各转化子的ISP产量,L-Leu的效果最佳。
关键词: 碳霉素 ；4”-O-异戊酰基转移酶基因 ；必特螺旋霉素 ；调控基因 ；异源表达
摘要： Lrp（Leucine-responsive regulatory protein）家族,又被称为 Lrp/AsnC 家族,是一类广泛存在于原核生物中的转录调控因子,能够参与调控细胞的多个生理过程,包括氨基酸的代谢、胞内外物质的转运、DNA的修饰与重组、细菌抗性等多个方面。然而目前在产抗生素的放线菌中关于Lrp蛋白调控抗生素生物合成的研究非常少,具体的调控机制更是有待深入的探究。红霉素（Erythromycin）是一种大环内酯类抗生素,由放线菌（Actinomycete）中糖多孢红霉菌（Saccharopolyspora erythraea）次生代谢产生,对于多种致病菌都具有较强大的抗菌活性。根据生物信息学分析,糖多孢红霉菌中SACELrp（SACE5388）基因编码一种Lrp家族的同源蛋白,与已报道的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）中Lrp同源性高达56%,并且它们转录方向相反的邻近基因都是编码分支氨基酸ABC转运蛋白。本研究首先利用大肠杆菌体外表达技术得到可溶性的SACELrp蛋白,通过蛋白与DNA结合的EMSA实验证实了 SACELrp对邻近的&4CE5387-5386具有直接的调控作用。为了探究SACELrp在糖多孢红霉菌中的功能,我们通过大片段敲除技术在糖多孢红霉菌A226中构建了SACELrp缺失突变株。高效液相色谱分析表明,与出发菌株A226相比,SACELrp缺失突变株（△SACELrp）中红霉素产量提高了 25%,而SACELrp基因回补后,红霉素的产量回复到出发菌株的水平,同时在A226中对SACELrp过表达后红霉素产量相比出发菌株下降23%,说明SACELrp对红霉素生物合成具有负调控作用。SACELrp的缺失对糖多孢红霉菌的菌体生长和形态分化并无明显的影响。进一步的qRT-PCR分析显示,SACELrp缺失突变株中红霉素生物合成基因簇中基因eryAI和ermE、邻近的分支氨基酸ABC转运蛋白基因SACE5387-5386以及分支氨基酸代谢路径中氨基转移酶基因ilvE的转录水平都有显著升高,表明SACELrp很可能通过调节红霉素结构基因、邻近分支氨基酸转运基因以及分支氨基酸代谢基因转录水平最终影响红霉素的产生。利用氨基酸自动分析仪对A226与△SACELrp的胞内外游离氨基酸分析结果表明,△SACELrp中胞外三种分支氨基酸（Val、Ile和Leu）的含量低于A226,而△SACELrp胞内三种分支氨基酸的含量也低于A226,说明SACELrp的缺失不仅影响分支氨基酸从胞外转运至胞内,还影响了胞内分支氨基酸的代谢转化,从而影响红霉素生物合成的前体供应。我们在糖多孢红霉菌A226中过量表达SACE5387-5386,红霉素产量提高了 31%。进一步在糖多孢红霉菌A226的发酵培养基中分别添加分支氨基酸后,红霉素的产量相应提高 47%（Val）、35%（Ile）和 16%（Leu）。本研究利用DNase I footprinting技术解析了糖多孢红霉菌中SACELrp的保守结合位点为一段富含GC的DNA序列:CCTCCGGGCAACATTC,并通过缺失突变进行了验证。根据保守结合位点的分布位置,推测SACELrp不仅调控邻近的转录方向相反的S4CE5387-5386,还可能具有自我调控的作用,本研究通过设计体内的GFP报告系统证实,SACELrp对自身的转录存在转录抑制。Lrp家族的一大特征是C末端结构域具有响应配体氨基酸的能力,通过在体外EMSA体系中添加20种蛋白质氨基酸,发现添加Lys和Arg可以抑制SACELrp与靶DNA的结合,而添加His可以促进蛋白与靶DNA的结合,说明SACELrp具有双向响应的氨基酸配体,Lys和Arg是抑制型配体,His是促进型配体。进一步通过设计体内GFP报告系统,证实了 SACELrp在体内情况下同样可以对三种配体氨基酸进行应答。目前为止,糖多孢红霉菌SACELrp是Lrp家族蛋白中首次被解析双向响应配体的成员。糖多孢红霉菌低产菌株A226中,SACELrp的缺失、增加SACELrp靶基因SACE5387-5386的拷贝数,以及添加SACELrp调控底物分支氨基酸三种策略在提高红霉素产量方面都取得了良好的效果。我们将这三种策略应用于红霉素工业高产菌株WB。高效液相色谱分析表明,WB中缺失SACELrp基因（WB△SACELrp）后,突变株红霉素产量提高19%;在缺失SACELrp基因的基础上过量表达SACE5387-5386（WB△SACELrp/5387-5386）,红霉素产量较出发菌株WB提高41%;在工业发酵培养中额外添加10 mM Val,WB△SACELrp/5387-5386的红霉素产量较WB提高48%,最终在5-L发酵罐水平上,红霉素的产量由3503 mg/L显著提高41%,达到5001mg/L。说明在红霉素工业高产菌株中,以SACELrp调控元件为基础的改造确实可以显著的提高红霉素的产量,这一调控元件的开发和应用为未来其他工业高产菌株的改造和筛选提供了基础。根据同源性分析比对,SACELrp的同源蛋白广泛存在于其他产抗生素的放线菌中,为了研究Lrp蛋白对于抗生素生物合成的调控功能是否具有普适性,我们选择模式链霉菌-天蓝色链霉菌作为代表。通过在天蓝色链霉菌M145中缺失SACELrp同源蛋白基因SCO3361,构建缺失突变株△SCO3361,并对次级代谢产物进行分析发现,SCO3361缺失突变后,放线紫红素（Act）的产量急剧下降至出发菌株的20%水平,而十一烷基灵菌红素（Red）和钙依赖抗生素（CDA）的产量并无显著变化。SCO3361缺失突变后,菌株的产孢能力也明显下降,说明SC03361不仅调控天蓝色链霉菌的次级代谢,还调控菌株的形态分化。这些结果说明在产抗生素的放线菌中,Lrp同源蛋白对于抗生物生物合成的调控作用是很可能普遍存在的。qRT-PCR分析结果显示,SC03361缺失突变株中Act生物合成基因簇的簇内调控蛋白基因actⅡ-ORF4（SC05085）和产孢相关蛋白基因amfC（SCO4184）、whiB（SCO3034）、ssgB（SCO1514）的转录水平明显下降,说明SC03361对Act的生物合成和菌株的孢子形成具有显著的正调控作用;△SC03361突变株中,自身基因表达量显著升高,证实SC03361同样具有抑制自身转录的调控作用。EMSA实验证实,SC03361能够结合actⅡ-ORF4的启动子,说明SC03361能够直接调控Act的生物合成基因簇。通过qRT-PCR分析结合EMSA实验发现SC03361也同样可以直接调控邻近的转录方向相反的SC03362。利用体外EMSA和体内GFP报告系统,解析Phe是SC03361的抑制型配体,Cys是SC03361的促进型配体。EMSA实验证实SACELrp能够与SC03361的靶DNA结合,而SC03361也能够与SACELrp的靶DNA结合,二者存在交叉调控的作用。我们的研究结果说明天蓝色链霉菌中Lrp同源蛋白SC03361不仅可以调控特定抗生素的生物合成,还调控了天蓝色链霉菌的形态分化,说明Lrp家族蛋白在其他产抗生素的放线菌中同样可以调控抗生素的生物合成,很可能具有普遍性的调控作用。
关键词: 亮氨酸应答调控因子(Lrp家族) ；糖多孢红霉菌 ；天蓝色链霉菌 ；抗生素生物合成 ；形态分化
被引量
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摘要： 必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)已完成Ⅲ期临床试验,4"位的异戊酰化可以增加其组织浓度和体内抗菌活性,延长抗生素的半衰期,临床研究结果表明,对上呼吸道细菌感染具有很好的疗效,且口服剂量低,不良反应少。本文对BT生物合成基因进行深入研究,为提高BT产量提供了重要依据。通过生物信息学分析,从BT产生菌的全基因组序列中得到BT的生物合成基因簇,在基因簇中有4个内源调控基因和一个外源调控基因acyB2,其中orf23和orf42与生二素链霉菌S.ambofaciens中的srm22和srm40基因同源,二者都是螺旋霉素(Spiramycin,SP)生物合成的正调控基因,acyB2与srm40也互为同源基因。对acyB2、srm40和srm22基因在大肠杆菌中进行异源表达研究,只成功表达表达并纯化出Srm22可溶性蛋白,EMSA实验证实Srm22蛋白能与srm40和外源调控基因acyB2的启动区进行结合,却不能与自身启动区以及基因簇内其它结构基因的启动区结合。这说明Srm22不是直接调控结构基因,而是通过调控srm40和acyB2来影响BT的生物合成。通过生物信息分析推测出全局性调控基因:亮氨酸响应蛋白基因(lrp)和光秃家族基因(bldD),两者都参与调控BT的生物合成。在大肠杆菌中表达并纯化出Lrp和BldD蛋白,EMSA实验证实了 Lrp能与acyB2、srm40和srm22的启动区结合,说明Lrp可能对这三个调控基因具有调控作用;而BldD与acyB2、srm22基因的启动区没有特异性结合,说明BldD不直接影响这些调控基因的表达。在发酵培养基中添加L-Leu能明显提高发酵产物中BT的比例,在生物合成途径上L-Leu与BT的异戊酰基侧链合成密切相关。Lrp蛋白参与多个代谢途径的调控,其中包括L-Leu的生物合成,我们删除Lrp的L-Leu结合结构域,希望解除L-Leu生物合成的反馈抑制,增加异戊酰基底物。我们利用HPLC检测SP及BT产量,发现在△lrp-SP变株中,SP总比例由原株的76.3%提高至81.5%,其中SPⅢ产量提高了 88.6%,在Alrp-BT变株中,ISP总比例由原株的17.7%提高至18.9%,其中ISPⅢ产量提高了 212.1%,说明删除Lrp的L-Leu结合结构域能提高SP与BT的产量与组分比例。氨基酸含量结果表明,△lrp-SP变株内BCAAs(Val:32.0μg/g;Leu:37.8μg/g;Ile:13.5 μg/g)比原株内 BCAAs(Val:65.1 μg/g;Leu:62.6 μg/g;Ile:25.1 μg/g)含量低,说明删除Lrp的L-Leu结合结构域能增加菌体内BCAAs的分解代谢。通过转录组分析,我们发现BT和SP生物合成途径,丙氨酸生物合成途径,酰基辅酶A代谢途径等相关基因表达量提高。BT化学结构中含有三个糖基,这些糖基对抑菌活性至关重要,orf21基因(NDP-氨基己糖N二甲基转移酶基因),推测其参与BT左侧糖基福洛氨糖的生物合成,为了证实其功能,我们将orf21基因进行阻断,经过抑菌活性测定证实△orf21基因阻断株的发酵产物中不产生抗菌物质,TLC和HPLC检测证实其不能合成螺旋霉素,但产生一些螺旋霉素类似物,其化学结构正在进行鉴定。
关键词: 必特螺旋霉素 ；亮氨酸响应蛋白 ；调控机制 ；次级代谢
摘要： 必特螺旋霉素(BT)是利用基因工程技术对螺旋霉素(SP)的碳霉糖4″-羟基进行酰化获得的以4″异戊酰SP为主组分的新抗生素，组分比较复杂，原因有两个：首先是SP本身有三个组分(SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ)，其次是异戊酰化SP的异戊酰基转移酶特异性有限。本论文从减少SP组分数量入手，实现减少BT组分的目的，为今后简化BT提取工艺、推进产业化做出贡献。
在SP三个组分中，SPⅡ和SPⅢ是SPⅠ分别乙酰化和丙酰化的产物，并且由同一个酶(3-O-酰基转移酶，编码基因称为sspA)催化完成。因此，如果将该酶基因替换为酰化效率和酰化专一性更高的酶基因，可以显著减少SP的组分数量；如果将该酶基因破坏，则SP由三个组分变为一个组分(SPⅠ)，也将显著减少SP的组分数量。本论文正是围绕这种构思进行。
实施上述构思均需要利用DNA同源双交换技术，以实现基因阻断或基因替换的目的。因此，获得SP生物合成中的sspA基因及其侧翼序列是必需的。麦迪霉素、碳霉素与SP的结构非常相似。我们根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶(3-O-AT)序列，设计了简并性PCR引物，以SP产生菌S. spiramyceticus F21总DNA为模板，PCR扩增获得了一段878bp DNA序列；接着，采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法，获得了sspA基因完整ORF及其侧翼序列，共约4.3kb。
我们采用DNA同源双交换技术对SP产生菌S. spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。sspA缺失变株发酵产物分析表明其主要组分为SPⅠ(原株主要组分为SPⅡ和SPⅢ)；但是SP的发酵效价也下降了约90％，原因尚不清楚。
麦迪霉素的16元内酯环3位羟基均被丙酰化，我们推测其生物合成中的3-O-AT(MdmB)具有较高的酰化效率和丙酰化特异性；因此，我们将mdmB基因替换SP产生菌中的sspA基因，希望获得单组分SPⅢ。基因替换变株发酵产物分析表明其中仍存在SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ组分，说明mdmB基因的高酰化效率和丙酰化特异性与麦迪霉素产生菌本身具有紧密的联系。
依据上述实验结果，我们减少BT组分的策略为：对BT基因工程菌中的sspA基因进行阅读框架内部分序列删除操作，在实现sspA基因失活、导致菌株只能产生SPⅠ组分的同时，尽量不影响菌株的SP产生潜力，从而获得有效地简少BT组分数量的基因工程菌。sspA基因阅读框架内部分序列(612bp，占整个基因大小的50％)删除的新BT产生菌发酵产物分析表明，原BT组分中的的两个主要组分——异戊酰SPⅡ和异戊酰SPⅢ已经消除。我们成功地获得了以异戊酰SPⅠ为主要组分的BT新基因工程菌。
关键词: 必特螺旋霉素 ；异戊酰基转移酶 ；单引物巢式PCR ；异戊酰螺旋霉素I
摘要： 本文对C-3前体,金属离子Mn<'2+>、Mg<'2+>和Co<'2+>对必特螺旋霉素生物合成的影响进行了初步研究,提出了必特螺旋霉素工艺优化的方向.继而,以有机酸、金属离子测定为分析手段,系统地研究了金属离子Mn<'2+>对必特螺旋霉素发酵代谢的影响.利用HPLC,从有机酸的角度,揭示了发酵前期添加Mn<'2+>促进产物合成的一个可能的原因,即促进了丙酸等前体酸的合成,丰富了大环内酯合成的前体库.另外本文还对金属离子Mg<'2+>对必特螺旋霉素发酵代谢的影响进行了初步探讨.在上述基础上,采用摇瓶-发酵罐联动的方法对发酵工艺进行优化,并从工程角度研究了添加金属离子Mn<'2+>后对必特螺旋霉素产量及其相关参数的影响.
关键词: 必特螺旋霉素 ；金属离子 ；有机酸 ；基因重组 ；发酵代谢 ；发酵工艺
摘要： 乙酰乳酸合酶（也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacid synthase,AHAS）是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸Val、Leu、Ile生物合成过程中关键酶,是乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰氨类的作用靶标。
本文从长期使用甲磺隆的土壤中分离到1株抗甲磺隆的菌株Lm10,菌株Lm10对甲磺隆的最高耐受浓度达到14,000μmol/L。经形态、生理生化特性测定及其16SrDNA序列和系统进化树的分析,该菌被鉴定为假单孢菌（Pseudomonas sp.）。
该菌的最适温度为30℃,最适生长pH是7.0;装液量小于100mL/250mL时,通气量的改变对抗性菌Lm10的生长影响不大;可以很好的利用麦芽糖,葡萄糖;在以葡萄糖为碳源时,以有机氮为氮源生长较好,在供试的几种无机氮源中,Lm10对NH4NO3利用最好;该菌株对氨苄青霉素、四环素、链霉素有抗性。且菌株对各种乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性。
菌株Lm10的AHAS酶的Km为18.38 mM,Vmax为0.568 mmol·h-1。在甲磺隆高达2500μmol/L时菌株Lm10的AHAS酶粗酶液酶活仍为无甲磺隆时粗酶液酶活的50%。菌株Lm10的AHAS最适温度30℃,最适pH在6.5左右,终产物Val对AHAS酶具有反馈抑制作用。AHAS酶对测试的几种有机溶剂不敏感;在供试的几种金属离子中,当浓度为2mmol·L-1时,Fe2+、Ca2+对酶活都有明显的促进作用,Ni2+、Fe3+离子对酶活影响不大,Cu2+对酶活表现抑制作用。
通过PCR的方法,扩增得到了菌株Lm10（Pseudomonas sp.）乙酰乳酸合酶（Acetolactate synthase,ALS）的基因全序列。测序和比对分析结果表明该片段包含二个基因克隆ilvI、ilvH,其基因序列全长分别为1725bp、492bp,分别编码含有575、164个氨基酸残基的多肽链。将PCR产物分别连接到表达载体pET29a（+）上构建了重组质粒pET-I、pET-H和pET-IH,实现了ilvI、ilvH基因的分别高效表达;而含有重组质粒pET-IH的转化子,只在67kD附近出现很强的表达条带,没有发现小亚基的表达条带,这可能是由于小亚基位于大亚基后面,大肠杆菌的翻译系统不能识别其核糖体结合位点。通过对粗酶液酶活试验结果表明Lm10的ilvI基因表达的AHAS大亚基对甲磺隆有很强的抗性,活性与对照相比高5倍以上,说明菌株Lm10的ilvI基因表达的AHAS大亚基具有催化活性。通过对ilvI、ilvH序列比较,发现抗甲磺隆菌株Lm10与敏感菌株KT2440的ilvH在氨基酸水平上无差异,而ilvI则有6个氨基酸位点差异,分别为N134H、P135A、T136S、V210I、Y214F和W486S,有必要通过点突变等技术作进一步分析这些位点突变与乙酰乳酸合酶对磺酰脲除草剂抗性产生之间的关系。
关键词: 甲磺隆 ；除草剂抗性 ；乙酰乳酸合酶 ；抗性基因 ；克隆与表达
摘要： 必特螺旋霉素是一种新型大环内酯类抗生素。它是在螺旋霉素的基础上,通过4"-O-异戊酰基转移酶的催化在4"羟基上接入一系列酰基形成的一族多组分酰化螺旋霉素。根据构效关系,大环内酯类抗生素4"位酰基化后,其体内外抗菌活性尤其是体内抗菌活性与治疗效果显著提高,并且碳霉糖4"羟基酯的碳链越长在体内的稳定性越好,表现为异戊酰基>丙酰基>乙酰基。因此,对于必特螺旋霉素发酵过程特别是异戊酰螺旋霉素组分的调控进行研究具有重要意义。 实验结果表明,在合成培养基中降低基础培养基中铵离子浓度对必特螺旋霉素发酵组分有显著改善,但产素明显下降。采用降低复合培养基基础配方中铵离子浓度、发酵过程从24h开始每12h补加3.2 mmol/L的铵离子的方法,总异戊酰螺旋霉素达38％,比原配方高15％,而生物效价达2200μg/mL,是原配方的90％。 在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响,证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明,在36h分别添加0.5g/l的上述三种氨基酸以后,发酵过程pH、铵离子浓度和糖代谢都存在着显著差异,而缬氨酸脱氢酶活性都增加了2-3倍。添加缬氨酸使菌体在60h之前糖耗速率加快,达到1.0 g/l*h,发酵液中胞内丙酮酸积累,丙酮酸羧化酶活性增加20％-95％,柠檬酸合成酶活性降低,发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象,最终效价比对照高出45.3％,而总异戊酰组分则降低了23％,其他酰化组分降低了39.6％；添加异亮氨酸以后,菌体糖耗速率下降,只有对照的30-40％,柠檬酸合成酶活性也降低,发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象,最终效价为对照的85％,而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126％、50％、296％；添加亮氨酸对初级代谢影响不大,异戊酸在胞外积累明显,随后被重新吸收利用,最终异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III组分分别提高了41％和50％,同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了41.9％,而效价和对照基本一致。 通过在复合培养基中一次性添加与分批添加终浓度为15.4 mmol/L的亮氨酸,发现分批添加亮氨酸可以维持效价基本不变,而总异戊酰基螺旋霉素与异戊酰基螺旋霉素III分别由对照的31.1％和12.0％,提高至46.9％和19.5％。同时通过分析发酵过程有机酸以及氨基酸的变化规律,讨论了亮氨酸提高必特螺旋霉素主要组分的作用机理。随后在15L发酵罐中对分批添加亮氨酸实验的效果进行了验证。实验结果表明,必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素和异戊酰基螺旋霉素III在发酵96h分别提高到了59.91％和21.45％。 应用统计学方法优化了必特螺旋霉素发酵培养基。先利用Plackett-Burman设计法析出影响必特螺旋霉素效价的四个最显著的因素,再以Box-Behnken设计法及响应面分析法确定了主要影响因素的最佳浓度,即鱼粉22.8 g/L,酵母粉2.44 g/L,CoCl29.25 mg/L,NaCl 9.13 g/L,此时必特螺旋霉素效价为2245 μg/mL。新配方验证结果表明必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量在96小时分别达到2380μg/mL和54％,比原配方分别提高了53％和20％,达到了同时提高必特螺旋霉素效价和总异戊酰螺旋霉素组分的目的。
关键词: 必特螺旋霉素 ；大环内酯类抗生素 ；发酵过程 ；组分调控
摘要： 本文首先对必特螺旋霉素摇瓶发酵基础条件进行了初步研究。实验确定摇瓶培养灭菌方式为：灭菌前添加Mg<'2+>和葡萄糖，采用灭菌后立即手动减压后开盖；摇瓶发酵条件为：接种量8％，发酵温度28℃，发酵采用自然pH(不控制)，摇瓶装液量为50ml/500ml，转速220rpm，培养时间为96h。本文也研究了水解羽毛粉、碳酸钙，表面活性剂对必特螺旋霉素的效价和异戊酰螺旋霉素的百分含量的影响。 在上述研究基础上，在摇瓶中分别添加两种不同的有机酸(异戊酸和α-酮戊二酸)，通过测定发酵过程的有机酸、氨基酸、以及酶学数据，分别考察它们对必特螺旋霉素生物合成的影响。研究发现，在发酵前期(18h)添加0.05％的异戊酸一方面可以有效地提高有效组分异戊酰螺旋霉素，尤其是异戊酰螺旋霉素Ⅲ的百分比，另一方面，异戊酸的添加也一定程度上抑制了菌体的生长，使得必特螺旋霉素总体效价较对照低。同时在产素期(48h)添加0.025％的α-酮戊二酸可以明显提高必特螺旋霉素的效价，但对必特螺旋霉素组分基本没有影响。进一步考察了异戊酸和α-酮戊二酸两者协同作用对必特螺旋霉素的影响，结果表明对必特螺旋霉素组分和效价都有促进作用，达到了既提高组分又提高效价的目的。
关键词: 必特螺旋霉素 ；异戊酸 ；α-酮戊二酸 ；有效组分 ；生物合成