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摘要： 目的探讨剑叶龙血素A(Cochinchinenin A)对破骨细胞分化的影响及作用机制。方法采用网络药理学技术预测CCA干预破骨细胞分化的作用机制,并用Auto Dock Tool软件对CCA与破骨细胞分化关键靶点进行分子对接。体外采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和核因子受体配体激活因子(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)诱导小鼠骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophages,BMMs)分化为破骨细胞,并通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)和F-actin染色观察CCA对破骨细胞形成的影响,最后通过Western Blot检测CCA对MAPK和NF-κB信号通路的调控作用。结果通过网络药理学技术共筛选获得20个CCA抗破骨细胞分化的潜在靶点,功能富集分析发现CCA可通过调节MAPK、破骨细胞分化和肌动蛋白细胞骨架组成等信号通路及PIK3CA、MTOR、ESR1及MAPK1等关键靶点发挥抑制破骨细胞分化的作用。分子对接进一步验证了CCA和关键靶点的结合能力。体外实验结果表明CCA可显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化及F-actin形成,同时抑制NFATc1、Integrinβ3、c-Fos蛋白及破骨细胞功能相关蛋白CTSK的表达。此外,CCA抑制了p38的磷酸化和IκB-α的降解。结论CCA可通过调控p38/MAPK及NF-κB信号通路抑制破骨细胞分化。
关键词: 剑叶龙血素A ；破骨细胞 ；网络药理学 ；分子对接 ；MAPK
摘要： 目的研究维生素D和维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)在破骨细胞分化各阶段的作用及其机制。方法从C57BL/6小鼠四肢骨骨髓中提取原代单核巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMMs),使用核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stlimulating factor,M-CSF)将BMMs诱导成破骨细胞。同时使用不同浓度(0.1、10、1 000 nmol/L)的1,25(OH)_(2)D_(3)进行干预,激活VDR。采用TRAP和FAK染色、噬骨实验、q PCR和Western blot等实验分析1,25 (OH)2D3对破骨细胞生成的影响。结果 1,25(OH)_(2)D_(3)作为VDR的强激动剂,在1 000 nmol/L时能高效激活VDR,在mRNA和蛋白水平均抑制破骨细胞分化早期c-Fos和NFATc1的表达,以及抑制成熟期Cts K和MMP-9的表达(P<0.05)。1 000 nmol/L 1,25(OH)_(2)D_(3)显著下调IκBα的磷酸化水平(P<0.05),从而抑制p65的核转位与磷酸化。结论 1 000 nmol/L 1,25(OH)_(2)D_(3)显著上调VDR的表达,1,25(OH)_(2)D_(3)激活VDR可通过IκBα/NF-κB p65信号通路抑制破骨细胞分化、融合和骨吸收活性。
关键词: 1,25(OH)_(2)D_(3) ；维生素D受体 ；破骨细胞 ；NF-κB
被引量
9
摘要： 背景:前期研究表明葛根素干预后破骨细胞的分化被抑制,Notch1、HES1、Jagged1等Notch信号通路相关蛋白表达量下降,但Notch1信号通路对于葛根素抑制破骨细胞分化的作用机制尚不明确。目的:探究Notch信号通路对葛根素抑制小鼠巨噬细胞Raw264.7分化为破骨细胞的影响。方法:将Raw264.7细胞分为7组干预培养,空白对照组采用DMEM高糖完全培养基培养,破骨细胞诱导组采用破骨诱导培养基培养,葛根素干预组在破骨诱导的同时加入50μmol/L葛根素培养,葛根素+Notch1 si RNA对照组、葛根素+Notch1 si RNA组、葛根素+Notch1过表达对照组、葛根素+Notch1过表达组分别采用Notch1 si RNA对照序列、Notch1 si RNA序列、Notch1过表达对照质粒、Notch1过表达质粒转染Raw264.7细胞后,加入破骨诱导培养基和葛根素进行培养。培养7 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞的数量和大小,F-actin染色观察破骨细胞骨架形成情况,RT-PCR检测破骨细胞形成标志物的基因表达水平。结果与结论:(1)抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示:葛根素干预可以抑制破骨细胞的生成,Notch1沉默会进一步减少破骨细胞的生成数量,Notch1过表达后破骨细胞生成数量明显增加;(2)F-actin染色显示:Raw264.7细胞经破骨诱导可以形成边界清晰的F-actin环,葛根素干预会抑制细胞骨架的形成,Notch1沉默会增强葛根素的抑制作用,而Notch1过表达则能减弱葛根素的抑制作用;(3)RT-PCR检测显示,葛根素可以抑制抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和c-Fos的m RNA表达,Notch1沉默后上述3个因子的m RNA表达进一步降低,Notch1过表达后上述3个因子的m RNA表达增加。结果表明:Notch信号通路在Raw264.7细胞分化为破骨细胞的过程中发挥作用,葛根素通过抑制Notch信号通路抑制Raw264.7细胞分化为破骨细胞。
关键词: 葛根素 ；Raw264.7细胞 ；Notch1 ；过表达 ；沉默 ；破骨诱导 ；破骨细胞 ；牙周炎
被引量
1
摘要： 目的研究苦参黄素(kurarinone,KE)调控骨质疏松症中破骨细胞分化的作用机制。方法运用网络药理学和生物信息学分析预测KE调控骨质疏松症中破骨细胞分化影响的主要生物进程和信号通路。以小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)为体外细胞研究对象,使用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)组成的破骨细胞诱导剂对BMDM进行破骨细胞分化诱导。通过破骨细胞特异性抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAcP)染色和细胞骨架F-actin环染色检测KE调控破骨细胞分化的作用,使用Western Blot技术对生信分析预测的信号通路进行验证,最后通过荧光染色和流式细胞仪技术检测KE对破骨细胞分化中ROS的影响。结果网络药理学和生信分析获得KE调控骨质疏松症的蛋白互作网络,核心靶点为TNF、MAPK1、PIK3CA、HSP90AA1和MAPK14等。通路富集发现KE调控破骨细胞分化主要与破骨细胞分化、MAPK信号通路相关,功能富集发现与蛋白激酶活性、MAPK级联调节进程相关。体外细胞实验表明8μmol/L的KE能显著抑制MAPK信号通路上JNK、P38和ERK的磷酸化水平;抑制破骨细胞分化相关蛋白c-Fos、CTSK、MMP9和NFATc1的表达;减少ROS产生和细胞骨架F-actin环形成;抑制RANKL诱导的BMDM向破骨细胞分化。结论KE通过激活MAPK信号通路和减少ROS产生抑制破骨细胞分化。
关键词: 苦参黄素 ；破骨细胞 ；骨髓来源巨噬细胞 ；RANKL ；MAPK ；骨质疏松症
摘要： 目的研究氯化镧对RAW264.7细胞分化为破骨细胞的抑制效果及其对破骨细胞形成相关基因表达的影响。方法建立重组鼠核因子κB受体活化素的配体(RANKL)诱导小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)细胞破骨分化模型,给予不同浓度氯化镧(2.5、20.0、100.0μmol/L)处理后,采用MTT法检测24、48、72h的细胞增殖活性;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞形成数量;RT-PCR技术检测TRAP、c-fos、CAⅡ、RANK及TRAF6的基因表达。结果 MTT结果显示不同浓度氯化镧均对RAW264.7细胞增殖能力无影响(P>0.05);TRAP染色显示氯化镧可使RANKL诱导生成的破骨细胞数量减少,但不同浓度间差异无统计学意义(P>0.05);RT-PCR结果显示各浓度氯化镧均可下调各基因的表达。结论氯化镧可抑制RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞,其机制与RANKL/RANK信号通路相关。
关键词: 氯化镧 ；RAW264.7 ；破骨细胞 ；RANKL
被引量
8
摘要： 目的研究WT161对破骨细胞分化及骨吸收功能的作用及机制。方法取8周龄雄性C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMM)进行原代培养,通过CCK-8细胞毒性试验探究不同浓度WT161对BMM增殖的作用;通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察各浓度WT161对破骨细胞分化的影响;通过骨吸收试验探究各浓度WT161对破骨细胞骨吸收功能的作用;通过蛋白质印迹试验检测WT161对核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65、p-NF-κB p65及活化T细胞核因子(nuclear factor-activated T cell 1,NFATc1)信号通路的影响。结果CCK-8结果显示当WT161浓度>0.63μmol/L时,WT161对BMM具有显著的抑制增殖作用;诱导破骨细胞分化时,WT161抑制BMM分化为破骨细胞,破骨细胞数目及铺展率明显减少;骨吸收试验显示WT161可显著抑制破骨细胞骨吸收功能;蛋白质印迹试验结果表明,WT161抑制NF-κB p65的磷酸化及下游NFATc1的表达。结论WT161通过抑制NF-κB及下游的NFATc1信号通路从而抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能。
关键词: WT161 ；破骨细胞 ；骨吸收 ；信号通路
摘要： [目的]探讨ERK5信号通路在RANKL诱导小鼠巨噬细胞分化为破骨细胞过程中的作用。[方法]体外构建RANKL诱导小鼠巨噬细胞分化成破骨细胞的实验模型,采用western blot检测不同时间点p-erk5表达量(0、15、30min,1、2、6 h);免疫荧光观察p-erk5蛋白向细胞核内转位情况;CCK-8确定药物组添加ERK 5抑制剂BIX02189的不同浓度;不同浓度BIX02189(0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L)与RANKL诱导的RAW 264.7细胞共培养6 d,采用PCR检测TRAP的基因表达量。[结果]Western blot检测结果:加入RANKL 15 min后pERK5表达量开始增加,30 min后达到高峰(P<0.01),之后慢慢下降,且磷酸化的ERK5蛋白逐渐开始出现向细胞核内转位;CCK-8检测细胞增殖率结果显示,浓度在3.0μmol/L以下的BIX02189对小鼠巨噬细胞正常增殖不构成影响;不同浓度的BIX02189对破骨细胞特异性基因TRAP表达量,较对照组有较明显抑制作用,且TRAP的基因表达随着浓度的增加有不同程度的减少(P<0.05)。[结论]RANKL能够激活RAW264.7细胞的ERK5信号通路,且抑制ERK5通路后,能够一定程度减少巨噬细胞向破骨细胞分化。
关键词: ERK5 ；核因子-κB受体活化因子配体 ；小鼠巨噬细胞 ；BIX02189
摘要： 目的:研究CXC-型趋化因子4(CXCL4)对体外核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导小鼠骨髓来源单核巨噬细胞(BMDM)向破骨细胞分化的影响。方法:无菌分离小鼠BMDM,使用50 ng/mL M-CSF以及不同浓度的CXCL4刺激细胞,CCK-8实验检测细胞增殖活性,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力。在M-CSF及RANKL均存在的前提下,以不同浓度的CXCL4作为干预因素,体外诱导细胞分化为破骨细胞,另设组加入BX471阻断剂处理细胞。TRAP染色法观察破骨细胞的形态并统计破骨细胞数目,RT-PCR检测JDP-2、NFATc1、c-Fos、MMP-9、TRAP、CTSK mRNA的表达情况。结果:不同浓度梯度的CXCL4均可增强BMDM的增殖活性及迁移能力;在RANKL及M-CSF均存在的前提下,加入不同浓度CXCL4的各实验组的TRAP染色阳性的细胞数量明显多于对照组(P<0.05),而在BX471阻断剂预处理组中TRAP染色阳性的细胞数量低于各实验组,但高于对照组(P<0.05)。此外,CXCL4能够上调破骨相关基因的表达,而BX471则能部分抑制上述mRNA表达的增高(P<0.05)。结论:CXCL4能提高BMDM的增殖及迁移能力,并促进RANKL介导的BMDM向破骨细胞分化,其促进作用可能与CXCL4/CCR1通路有关。
关键词: 牙周炎 ；破骨细胞 ；CXCL4 ；CCR1
被引量
1
会议时间： 2020-10-31
摘要： 目的:大多数骨骼疾病是由于破骨细胞的活性失调,骨骼重建中骨吸收骨形成的不平衡导致。研究破骨细胞调控骨改建的分子机制对提高骨代谢疾病患者的骨质健康意义重大。此外,破骨细胞在口腔疾病的发生发展中扮演重要角色。USP13作为泛素特异性酶(ubiquitin-specific protease,USP)家族的重要成员之一,通过水解泛素和底物蛋白之间的硫酯键抑制底物蛋白的降解,促进蛋白酶体的分解和泛素的再利用,以维持细胞的正常功能。USP13的去泛素化功能可修复损伤的DNA,从而维持基因的稳定。泛素特异性酶家族部分成员参与调控破骨细胞的分化与功能,与骨代谢和骨改建密切相关。然而,USP13在骨吸收及破骨分化中的作用尚不清楚。因此,本实验拟研究USP13在小鼠单核巨噬细胞破骨向分化中发挥的作用。材料与方法:首先,通过siRNA转染敲降小鼠单核巨噬细胞中的内源性Usp13,并进行破骨向分化诱导,TRAP染色探索敲降Usp13对于破骨细胞活性的影响;成骨-破骨细胞共培养实验可以模仿体内环境,进一步验证USP13对于破骨细胞形成的影响。接下来,通过实时荧光定量(Quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Westernblot,WB)探索敲降Usp13对破骨分化相关因子的影响。Westernblot探索USP13是否通过Smad2/3-依赖的TGFβ信号通路调控小鼠单核巨噬细胞破骨向分化。细胞免疫荧光染色进一步探索USP13调控的关键靶基因的变化。最后,利用TGFβ-Smad2/3的抑制剂SB431542,通过TRAP染色,qRT-PCR和Western blot实验进行反向验证。结果:敲降小鼠单核巨噬细胞中的内源性Usp13,破骨形成能力,破骨分化潜能及破骨向分化关键基因(Nfatc1, Fos, Src, Mmp9, Ctsk等)表达均显著增加。成骨-破骨细胞共培养实验进一步证明USP13抑制破骨的形成。Western blot显示USP13通过Smad2/3-依赖的TGFβ信号通路调控小鼠单核巨噬细胞破骨向分化,并抑制Smad2/3的磷酸化。细胞免疫荧光染色进一步证实敲降小鼠单核巨噬细胞中的Usp13后,磷酸化的Smad2/3的表达及核转位显著增加。SB431542是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) I型受体的抑制剂,抑制Usp13敲降引起的破骨形成能力和破骨分化潜能的增加。结论:本研究发现USP13是调控破骨分化的潜在因子,通过Smad2/3-依赖的TGFβ信号通路调控小鼠单核巨噬细胞的破骨分化,提示USP13是治疗骨代谢异常疾病的潜在靶点。
关键词: 泛素特异性蛋白酶USP13 ；小鼠单核巨噬细胞 ；破骨分化
被引量
1
会议时间： 2023-11-03
摘要： 研究目的:骨质疏松(osteoporosis,OP)是一种以骨量降低和骨微环境破坏为主要特征的全身性骨代谢疾病。女性OP患者所占比例高达70%,由绝经引发的雌激素水平降低,是女性骨量降低的主要因素。科学规律性运动能够改善骨重塑进程,防治骨丢失。破骨细胞主导的骨吸收是骨重塑进程的重要环节,对骨量调控起关键作用。但运动在调控骨吸收进程中的具体机制尚不清楚。运动代谢产物乳酸作为G蛋白偶联受体81(G protein-coupled receptor 81,Gpr81)的唯一内源性配体,可能在调控破骨细胞功能中发挥重要作用。本研究构建Gpr81基因敲除小鼠模型和去卵巢手术(OVX)诱导骨量丢失小鼠模型,采用产生乳酸的高强度间歇训练(High-intensity Interval Training,HIIT)作为运动干预方案,通过体内和体外实验,分析运动调控OVX小鼠骨吸收进程的作用,并进一步揭示其分子机制,为防治骨代谢相关疾病提供潜在的治疗靶点。研究方法:(1)实验分组:将60只SPF级别的C57BL/6野生型(Wild type,WT)小鼠和Gpr81-/-小鼠,体重18-20g,随机分到以下10组:WT组、Gpr81-KO组、WT+Sham(野生型+假手术)组、WT+OVX(野生型+去卵巢手术)组、WT+OVX+HIIT(野生型+去卵巢手术+高强度间歇运动)组、WT+OVX+Lac(野生型+去卵巢手术+乳酸注射)组、Gpr81-KO+Sham(基因敲除+假手术)组、Gpr81-KO+OVX(Gpr81基因敲除+去卵巢手术)组、Gpr81-KO+OVX+HIIT(Gpr81基因敲除+去卵巢手术+高强度间歇运动)组、Gpr81-KO+OVX+Lac(基因敲除+去卵巢手术+乳酸注射)组。(2)Gpr81基因敲除小鼠模型:利用CRISPR/Cas9技术敲除Gpr81基因,获得Gpr81全敲小鼠模型(Gpr81-KO);(3)骨量丢失小鼠模型的构建:适应性喂养1周后假手术组小鼠背部手术后仅取少量脂肪组织,保留卵巢完整。其余各组均进行OVX手术摘除卵巢;(4)运动干预方式:小鼠在坡度为0°跑步机上进行每周5天的高强度间歇运动,共持续8周。先进行10min速度为10m/min的热身,随后进行10次跑台速度为80%～90%最大速度的间歇运动,每次持续4分钟,中间进行2分钟速度为40%～50%最大速度的调整运动;在适应期结束及第2、4、6周对小鼠进行最大运动能力测试,调整训练期的跑步速度,使小鼠运动过程中接近最大摄氧量;(5)乳酸注射及检测:以生理盐水作为溶剂,配置200mg/ml的L-乳酸钠溶液。OL组小鼠按照1g/kg的剂量腹腔注射乳酸,每周5次,共持续8周。此外每隔两周用Lactate Scout4乳酸检测仪采集各组小鼠尾部血乳酸浓度,WT+OVX+HIIT组小鼠于运动结束后即刻采集血乳酸;(7)骨组织形态计量学指标:取小鼠股骨,通过Micro-CT取生长板下100张图片分析松质骨骨密度(BMD)和松质骨体积/骨组织总体积(BV/TV)、单位体积内骨小梁厚度(Tb.Th)、单位体积内骨小梁数目(TB.N)等指标;(8)破骨细胞体外分化:将骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMMs)以每孔10000个细胞接种于96孔板中,加入含有10%FBS的α-MEM培养基,同时分别加入终浓度为10ng/ml和50ng/ml的M-CSF和RANKL将其诱导分化成破骨细胞,隔天换液,将单核骨髓源巨噬细胞诱导分化为成熟的多核破骨细胞,通过TRAP染色分析破骨细胞分化能力,并通过ipp统计破骨细胞数量和破骨细胞面积;(9)破骨细胞蛋白提取和蛋白免疫印迹:分化成熟的破骨细胞用PBS清洗后加入RIPA裂解液,收集细胞裂解液上清,利用试剂盒提取蛋白。蛋白浓度用BCA法测定后,进行SDS-PAGE蛋白电泳并转移到PVDF膜上。封闭后,孵育抗体,然后再用含有HRP标记的IgG的封闭液孵育。用ECL超敏发光液发光,并在X-光胶片上曝光。检测破骨细胞中Gpr81、p-p65蛋白表达的水平。研究结果:(1)与WT组相比,Gpr81-KO组小鼠的松质骨BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等指标显著降低(P<0.01),颅骨/股骨破骨细胞活性增加。(2)与WT+Sham相比,WT+OVX组小鼠体重显著增加(P<0.01);与WT+OVX小鼠相比,WT+OVX+Lac和WT+OVX+HIIT小鼠的体重均显著的降低(P<0.01)。此外,WT+OVX+HIIT小鼠的血乳酸水平显著高于WT+OVX小鼠(P<0.01)。(3)与WT+Sham相比,WT+OVX小鼠的松质骨BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等指标显著降低(P<0.01)。与WT+OVX组相比,WT+OVX+Lac小鼠BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等指标均显著升高(P<0.01)。(4)与Gpr81-KO+Sham组相比,Gpr81-KO+OVX小鼠松质骨的BV/TV、BMD、TB.N指标参数明显降低(P<0.01)。与Gpr81-KO+OVX相比,Gpr81-KO+OVX+Lac和Gpr81-KO+OVX+HIIT组小鼠松质骨的BV/TV不存在显著性变化(ns)。与Gpr81-KO+OVX相比,Gpr81-KO+OVX+HIIT组小鼠松质骨BMD、BV/TV水平显著提升(P<0.05),对于Gpr81-KO+OVX+HIIT组小鼠松质骨Tb.Th参数方面无显著性差异(ns)。(5)在体外BMMs定向诱导破骨细胞分化中,来源WT+OVX小鼠的破骨细胞数目和面积显著高于来源WT+Sham、WT+OVX+Lac和WT+OVX+HIIT的小鼠,WT+OVX+Lac和WT+OVX+HIIT组破骨细胞数目和面积无显著性差异。(6)分子机制层面:Gpr81敲除后抑制破骨细胞分化,破骨细胞面积和破骨细胞数量均显著降低(P<0.01),同时Gpr81介导乳酸对破骨细胞分化的抑制作用。与WT+Sham相比,WT+OVX小鼠小鼠Gpr81蛋白的表达不存在显著差异,但是p-p65/GAPDH蛋白的表达量显著升高(P<0.01)。研究结论:(1)Gpr81可以调控小鼠骨量和破骨细胞活性。(2)OVX能够增加小鼠的体重,并引起骨量丢失,HIIT运动能够提高血乳酸水平,并抑制OVX引起的体重增加和骨量丢失。(2)8周HIIT运动干预和体外乳酸注射均能够通过抑制破骨细胞的分化和功能,抑制骨吸收进程,并提高骨密度和骨量。(3)HIIT运动能够引起机体循环水平乳酸浓度的增加,通过激活破骨细胞膜上的乳酸受体Gpr81,抑制胞内下游NF-kB信号通路,从而抑制破骨细胞分化。
关键词: 高强度间歇运动 ；乳酸 ；GPR81 ；破骨细胞 ；骨吸收
摘要： 目的：探讨Fisetin阻断c－Fos／NFATc1信号通路对钛颗粒诱导小鼠巨噬细胞向破骨细胞分化的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264．7，根据处理条件不同分为5组：A组（空白对照组）、B组（钛颗粒对照组）、C组（1．25μmol／L Fisetin＋钛颗粒）、D组（2．5μmol／L Fisetin＋钛颗粒）、E组（5μmol／L Fisetin＋钛颗粒）。采用CCK－8法检测各组RAW264．7细胞增殖活性。培养6天后，抗酒石酸酸性磷酸酶（ TRAP）染色检测各组细胞破骨细胞（细胞核≥3）数目，免疫印迹法检测各组细胞中c－Fos／NFATcl蛋白表达，RT－PCR法检测c－Fos／NFATc1的基因表达。结果 CCK－8法检测结果显示各组RAW264．7细胞增殖能力差异无统计学意义（P＞0．05）。 TRAP染色结果显示各组细胞均有TRAP阳性多核细胞生成，B组TRAP阳性多核细胞数目最高，C、D、E组呈现逐渐减少趋势，A组最少。 RT－PCR和Western blot检测表明，B组c－Fos／NFATc1表达最高，C、D、E组表达逐渐减少，与B组比较差异具有统计学意义（ P＜0．05）。结论 Fisetin可通过c－Fos／NFATc1信号通路抑制钛颗粒作用下小鼠巨噬细胞向破骨细胞的分化，其抑制程度与Fisetin药物浓度有关。
关键词: Fsietin ；小鼠巨噬细胞 ；抗酒石酸酸性磷酸酶 ；c-Fos ；NFATc1
会议时间： 2015-11-14
摘要： 目的:骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种分泌型磷酸化糖蛋白,具有细胞黏附蛋白和细胞因子的双重作用,能够与破骨细胞表面αvβ3结合引起酪氨酸激酶活化,但其对破骨细胞分化、功能的影响及作用机制尚未完全阐明。本研究观察OPN对破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中的影响,为进一步开展深入的机制探讨奠定基础。方法 :体外培养小鼠破骨前体RAW264.7细胞,以核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)进行刺激,建立破骨细胞诱导模型,并加入OPN干预。甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法及抗酒石酸酸性磷酸酯酶(TRAP)染色法分别检测RAW264.7细胞的增殖活性及其分化为破骨细胞的情况,RT-PCR检测TRAP、c-fos、RANK等基因的表达。结果 :OPN可明显促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化、增加细胞增殖。同时,TRAP、c-fos等破骨细胞特征基因的表达水平亦显著上调。结论 :本研究中OPN可促进RAW264.7细胞分化为破骨细胞,可能与影响RANK/RANKL信号通路有关,提示OPN有望成为防治骨质疏松等骨相关疾病的新靶点。
关键词: 骨桥蛋白 ；RAW264.7细胞 ；破骨细胞 ；核因子-κB
【会议论文】 •
+6位作者
会议时间： 2014-04-18
摘要： 目的:骨质疏松症是破骨细胞引起的现代社会最常见的骨重建失衡性疾病。然而目前治疗这些疾病的药物还不理想,为了追求更好的效果许多其他药物正在研究。齐墩果酸(OA)是甙类的化合物,能够通过抑制破骨细胞的形成阻止去卵巢小鼠的骨丢失。然而,OA在RANKL介导的破骨细胞的形成的机制仍然没有被阐明。在这项研究中,我们在体外和体内实验观察OA在破骨细胞生物学中的作用。方法:3月龄小鼠建立去卵巢模型,造模后一周给予齐墩果酸(10 mg/kg/天)干预3月,处死取材后通过u—CT检测骨密度,病理染色观察形态结构,免疫组化染色观察相关蛋白表达情况。体外通过RANKL诱导骨髓间充干细胞分化为破骨细胞,给予齐墩果酸干预,RT—PCR和Western-blot观察相关指标。结果:0A成剂量依赖性抑制RANKL介导的破骨细胞的形成和破骨细胞功能的骨髓巨噬细胞的形成。此外,0A能够显著抑制去卵巢切除的小鼠破骨细胞活性,从而增加骨密度(BMD)。机制研究发现,虽然齐墩果酸对破骨细胞发育过程中NF—κB,JNK,p38和ERK等信号途径没有影响,但是却能够抑制RANKL诱导的两个重要转录因子NFATc1和c—Fos的表达,上述因子在破骨细胞的发育过成中占有重要作用。进一步深入研究发现,齐墩果酸显著抑制了RANKL诱导的MMP9,CtsK,TRAP和Car2等基因在破骨细胞发育中的表达。尤为有趣的是,齐墩果酸对上述因子(NFATc1、c—Fos)和骨吸收基因(MMP9、Ctsk、TRAP、Car2)的抑制作用也在被RANKL提前处理的骨髓破骨细胞的发育中起到抑制作用。结论:我们研究不仅明确了齐墩果酸在破骨细胞发育过程中的作用,也同时揭示了齐墩果酸调节破骨细胞发育的分子生物学机制。
关键词: 骨质疏松症 ；齐墩果酸 ；卵巢切除 ；破骨细胞 ；骨吸收
摘要： 研究目的： 骨关节炎(OA)是一种十分常见退行性疾病，表现为软骨和软骨下骨的逐渐被破坏。已有研究表明，通过抑制软骨细胞的降解和软骨下骨的流失，可以预防和治疗OA。目前OA的早期临床治疗策略主要集中在全身或局部应用非甾体抗炎药物(NSAIDs)来缓解疼痛和炎症。然而，NSAIDs不仅半衰期短，清除率快，需要频繁用药，而且长期用药会导致严重的不良反应，包括消化性溃疡、肾衰竭和出血等。关节置换术被认为是治疗晚期OA的有效方法，但手术的风险和昂贵的费用不容忽视。因此，寻找一个安全而有效的策略优化OA的治疗是有价值的。奈拉替尼(Neratinib)作为一种不可逆的泛HER酪氨酸激酶抑制剂，已被用于治疗HER2+癌症其是一种多激酶抑制剂，能抑制RIP3激酶的活性，以及由RIP3介导的相关下游通路的激活，包括MAPK和NF-κB信号通路，可能在OA的发展过程中起着重要作用。本研究旨在阐明奈拉替尼是否可以通过MAPK和NF-κB信号通路调控软骨、软骨下骨和破骨细胞从而发挥延缓骨关节炎的作用及其机制。 研究方法： 1.观察奈拉替尼对于软骨细胞、破骨细胞活力的影响：使用CCK-8来检测不同浓度奈拉替尼对软骨细胞和破骨细胞活力的影响。 2.观察奈拉替尼对于软骨细胞周围基质代谢的影响：使用WesternBlot，qRT-PCR检测合成代谢与分解代谢的相关蛋白表达情况，使用高密度培养甲苯胺蓝染色观察奈拉替尼对软骨细胞周围基质的影响。 3.观察奈拉替尼对模拟OA状态下破骨细胞形成的作用：使用RANKL诱导刺激小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导破骨细胞分化，使用TRAP染色观察奈拉替尼对于破骨细胞形成和分化的影响。 4.观察奈拉替尼对炎症诱发的OA中软骨细胞焦亡的作用：使用WB检测使用IL-1β作用后，观察奈拉替尼对NLRP3等焦亡蛋白的表达情况。 5.观察奈拉替尼对于炎症状态下软骨细胞和破骨细胞中MAPK和NF-κB信号通路的调节作用：使用WesternBlot，qRT-PCR检测的MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白表达情况，观察奈拉替尼对软骨细胞、破骨细胞MAPK和NF-κB信号通路的影响。 6.观察奈拉替尼对于破骨相关基因表达的影响：使用qRT-PCR检测OA状态下小鼠骨髓源性破骨细胞中生长和分化相关基因的表达情况。 7.观察奈拉替尼对内侧半月板失稳型骨关节炎小鼠的影响：采用手术切除小鼠内侧副韧带的方法建立DMM模型，并于奈拉替尼治疗8周后行组织学切片检测：包括HE、SO染色、Aggrecan免疫组化和TRAP染色等，评估奈拉替尼在体内的作用效果。 研究结果： 1.奈拉替尼对于软骨细胞、破骨细胞活力的影响：使用不同浓度梯度(从3.13到400nmol/L)的奈拉替尼孵育细胞24小时和48小时。结果在对ADTC5软骨细胞和破骨细胞无毒性的基础上，我们选择了三种浓度(3.13、6.25、12.5 nmol/L)的奈拉替尼进行后续实验。 2.观察奈拉替尼对于软骨细胞周围基质代谢的影响：WB和高密度染色显示，与IL-1β组相比，奈拉替尼可促进合成代谢蛋白表达，并抑制分解代谢相关蛋白。 3.观察奈拉替尼对模拟OA状态下破骨细胞形成的作用：使用TRAP染色，观察到形成的TRAP(+)破骨细胞总数以剂量依赖的方式减少。同时，在药物处理不同时间后的染色结果显示药物可能在早期阶段抑制破骨细胞的作用较强。 4.观察奈拉替尼对炎症诱发的OA中软骨细胞焦亡的作用：用IL-1β处理时，ATDC5细胞的焦亡途径被激活，奈拉替尼处理抑制了炎症环境中软骨细胞的焦亡水平。 5.观察奈拉替尼对于炎症状态下软骨细胞和破骨细胞中MAPK和NF-κB信号通路的调节作用：qRT-PCR和westernblot结果显示奈拉替尼以浓度依赖的方式有效抑制了IL-1β诱导的p-ERK、p-p38和p-JNK水平的升高和NF-κB信号通路的激活。 6.观察奈拉替尼对于破骨相关基因表达的影响：PCR结果显示奈拉替尼抑制破骨细胞下游核转录因子c-Fos和NFATc1的作用以及其他破骨标志基因。 7.观察奈拉替尼对内侧半月板失稳型骨关节炎小鼠的影响：奈拉替尼给药减轻了的关节面软骨的破坏和塌陷。此外，免疫组织化学染色显示，奈拉替尼可以改善小鼠Aggrecan表达，TRAP染色显示奈拉替尼减轻了OA小鼠模型中软骨下骨中破骨细胞的异常增殖。 研究结论： 奈拉替尼(Neratinib)作为一种具有抗炎和抗肿瘤特性的小分子化合物，对于IL-1β诱导的软骨细胞炎症和合成分解代谢紊乱，能够发挥有效的作用。本文通过研究奈拉替尼对ATDC5软骨细胞的影响实验，结果发现奈拉替尼通过抑制MAPK和NF-κB信号通路降低炎症。破骨细胞是OA软骨下骨重塑过程的关键参与者，我们还研究了奈拉替尼对破骨细胞成熟的影响。结果显示，奈拉替尼在体外能起到抗破骨细胞的作用，可以减少破骨细胞相关基因的表达，从而抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，进一步的体内动物实验的结果支持了体外实验的结论。本研究提示奈拉替尼既能抑制内侧半月板损伤诱导的关节软骨降解破坏，又能抑制破骨细胞的形成，说明奈拉替尼可能具有双重作用，既能保护软骨，又能抑制破骨细胞的形成，奈拉替尼可能成为治疗OA的一种有价值的潜在药物。
关键词: 骨关节炎 ；奈拉替尼 ；软骨细胞 ；破骨细胞 ；MAPK/NF-κB信号通路
摘要： 目的:
骨质疏松症是一种在临床上广泛见到的慢性骨代谢性疾病,其主要特点包括骨密度降低、骨微观结构遭受破坏以及随之而来的骨骼脆性增加和高风险的严重骨折。尽管此疾病可能影响所有年龄段的人群,但在绝经后女性和老年男性中更为普遍。尤其需要注意的是,骨质疏松症和伴发的脆性骨折是老年人致残和死亡的常见原因之一。随着我国人口老龄化问题的日趋严峻,骨质疏松症已经成为我国社会面临的一个重大公共健康挑战。虽然目前临床治疗手段已显示出一定成效,但其潜在的多重风险也不容忽视。因此,急需发掘新的、安全有效的治疗策略。天然草药及其活性成分在缓解骨质流失和预防、治疗骨质疏松症方面,已被证实具有独特的效果和高安全性,特别是某些天然黄酮类化合物,由于其良好的骨组织相容性和靶向性,已成为治疗骨相关疾病的一个重要的替代资源。
本项研究聚焦于骨伤科常用中药木豆叶中的有效成分木豆异黄酮,通过体外实验及动物模型的建立,主要研究木豆异黄酮在抑制破骨细胞形成、促进骨骼干细胞成骨分化以及调节骨重塑过程中的双向作用机制。
方法:
本研究分为体外和体内实验,体外实验主要利用小鼠BMMs、RAW264.7细胞系和SSCs为研究对象,利用分子生物学、病理学等手段明确木豆异黄酮阻碍破骨细胞形成和促进骨骼干细胞成骨分化的效果和分子机制,并通过构建雌激素缺乏性骨质疏松症模型小鼠验证其阻碍骨质疏松症形成的体内效果,具体研究方法主要分三个部分:
第一部分:以小鼠原代BMMs和RAW264.7细胞系为主要研究对象,分别用不同浓度的木豆异黄酮干预BMMs和RAW264.7细胞系进行细胞增殖毒性测试,在通过细胞毒性测试后,继续用不同浓度的木豆异黄酮干预RANKL诱导的破骨细胞形成过程,并筛选出具有最佳抑制效果的浓度,随后用有效浓度的木豆异黄酮干预破骨细胞分化成熟过程中的F-actin环形成,并用qPCR和免疫印记等分子生物学方法检测破骨细胞分化和成熟过程中特异性基因和蛋白的表达情况。在明确了木豆异黄酮对破骨细胞的抑制效果后,随即收集总RNA进行RNA Bulk测序,并用生物信息学、分子生物学、免疫荧光和流式细胞仪等方法和设备分析、检测破骨细胞分化和成熟过程中相关信号通路的表达情况和潜在的结合靶点,用激光共聚焦显微镜评估关键转录因子活化T细胞核因子1(NFATc1)和p65蛋白的核迁移情况,并添加了靶点特异性抑制剂验证其可靠性。
第二部分:利用小鼠骨骼干细胞为主要研究对象,通过用不同浓度的木豆异黄酮干预骨骼干细胞进行细胞增殖毒性测试,通过细胞毒性测试后,用不同浓度的木豆异黄酮干预骨骼干细胞的成骨分化过程,从中筛选出效果最佳的促成骨浓度,随后用qPCR检测经该有效浓度干预后的成骨分化标志物表达情况。
第三部分:通过构建去卵巢雌激素缺乏性骨质疏松症疾病小鼠模型,在小鼠适应了饲养环境后,随机地,将全部小鼠分为3组,分别为模型组、假手术组和药物组,在造模手术恢复后,分别用木豆异黄酮或生理盐水进行治疗,整个干预过程持续6周,每周记录一次体重,干预结束后,分别收集下肢股骨样本,随后行Micro-CT扫描和重建分析,将经过扫描的股骨样本继续浸泡在EDTA溶液中进行脱钙处理,然后进行脱水、切片等处理,最后根据实验实验要求,分别行苏木素伊红染色、酒石酸抗性酸性磷酸酶染色、Masson染色、碱性磷酸酶染色和PTGS1免疫荧光染色以评估木豆异黄酮预防骨质疏松症形成的效果和调节骨重塑的分子机制。
结果:
实验结果表明:木豆异黄酮可有效阻碍破骨细胞形成并促进骨骼干细胞成骨分化,同时能预防雌激素缺乏引起的骨量丢失。具体研究结果分为三部分:
第一部分:0-50μM浓度的木豆异黄酮对小鼠原代BMMs和RAW264.7细胞系无明显细胞毒性效果,且随着木豆异黄酮浓度的升高,对RANKL诱导的破骨细胞形成抑制效果越明显,其中,40μM浓度的木豆异黄酮可显著抑制RANKL诱导骨髓巨噬细胞形成破骨细胞,同时,40μM浓度的木豆异黄酮可显著抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞形成破骨细胞和F-actin环形成。通过qPCR检测发现,20μM和40μM木豆异黄酮能显著抑制破骨细胞骨形成相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(Acp5)和骨吸收功能相关基因ATP酶H+转运溶酶体辅助蛋白(Atp6v0d2)、组织蛋白酶K(Ctsk)、基质金属酶9(Mmp9)的表达。同时,免疫印记结果显示:RANKL会导致破骨细胞分化和骨吸收相关蛋白CTSK、MMP9和c-Fos的表达逐渐升高,其中CTSK、MMP9在RANKL诱导后的第5天表达最高。木豆异黄酮能在干预第3天后抑制MMP9、cFos蛋白的表达,并在第5天能逆转CTSK和MMP9的表达。RNA转录组学结果显示:在木豆异黄酮干预下,上调的基因数目达336个,下调的基因数达882个,差异不明显的基因达11497个,木豆异黄酮的干预下调了Atp6v0d2、Acp5、Ctsk、Mmp9、NFATc1等破骨细胞分化和吸收相关基因的水平,通过对差异基因行KEGG通路富集分析发现,木豆异黄酮的干预效果主要与MAPK和NF-κB信号通路有关。从短时间免疫印记结果发现,40μM木豆异黄酮在RANKL干预的早期(10min至20min)的时候显著抑制ERK和JNK蛋白的磷酸化水平,在第10min的时候抑制了p38蛋白的磷酸化表达。同时,40μM木豆异黄酮在早期(10-20min)对IκBα蛋白的降解无明显逆转作用,而在30min至60min显著降低了IκBα蛋白的降解。同时,p65蛋白的免疫荧光染色显示:40μM木豆异黄酮阻碍了p65蛋白的核内转移。随后,流式细胞仪检测结果显示:40μM木豆异黄酮还通过抑制钙离子震荡水平来阻碍NFATc1,但对活性氧没有明显的抑制作用,对抗氧化基因的表达也无明显促进作用。此外,从RNA转录组学数据中发现,Ptgs1基因在木豆异黄酮的干预后显著上调,而在RANKL干预后显著降低,结合分子对接结果发现Ptgs1可能为木豆异黄酮的效用作用靶点,通过添加TFAP(Ptgs1特异性抑制剂)后发现其能逆转木豆异黄酮的抗破骨细胞形成的趋势。
第二部分:不同浓度的木豆异黄酮对骨骼干细胞无明显毒性作用,与对照组相比,0.25μM和0.5μM浓度均能促进骨骼干细胞成骨分化,且随着木豆异黄酮浓度的升高,对骨骼干细胞的成骨分化促进效果越明显。qPCR实验结果显示:与对照组相比,0.25μM和0.5μM浓度的木豆异黄酮被证实可以有效地促进成骨相关基因(包括RUNT相关转录因子2(RUNX2)、碱性磷酸酶(ALP)和成骨细胞特异基因(OSX))的表达。
第三部分:在整个动物造模和干预的过程中,所有小鼠均未出现死亡或报告任何显著的不良事件,动物的存活率达100%,且药物的干预未对小鼠的体重产生明显的负面影响。从Micro-CT结果显示:模型组成功构建了骨质疏松症疾病模型小鼠,与模型组对比,木豆异黄酮能有效减轻雌激素缺乏引起的骨量丢失,这体现在木豆异黄酮干预后能逆转骨微结构参数,包括骨小梁的体积分数(BV/TV)、骨小梁的表面积(B.S)、骨小梁的数目(Tb.N)和骨密度(BMD)。此外,HE染色结果显示:与模型组相比,药物组样本骨小梁间隔更小,数目更多且骨小梁的连续性更好。TRAcP染色显示:与模型组对比,木豆异黄酮能有效降低骨小梁表面破骨细胞的数量和活性区域。PTGS1免疫荧光染色结果显示:木豆异黄酮能提高骨组织内PTGS1的表达量。ALP染色显示:与模型组对比,木豆异黄酮干预组的小鼠股骨表现出更强的ALP染色强度,表明有更多的新骨形成。Masson染色显示:与模型组对比,木豆异黄酮干预组有更多的成熟骨组织,而模型组的非成熟骨组织更多。
结论:
本研究以骨伤科常用药木豆叶的有效成分木豆异黄酮为干预条件,以骨形成和骨吸收相关的骨骼干细胞和破骨细胞为研究对象,并构建雌激素缺乏性骨质疏松症疾病模型小鼠,从体内和体外验证了木豆异黄酮抑制破骨细胞形成和促进骨骼干细胞成骨分化的效果,并可预防雌激素缺乏引起的骨量丢失。
木豆异黄酮对小鼠BMMs和RAW264.7细胞系增殖无显著毒性作用,木豆异黄酮对RANKL诱导的破骨形成具有显著的抑制作用,并且这种抑制效果与其浓度呈正相关,呈现出剂量依赖性。同时,木豆异黄酮能有效抑制F-actin环形成和破骨细胞成熟和功能相关的基因和蛋白的表达,从RNA转录组学、免疫印记和激光共聚焦结果分析,在RANKL刺激下,木豆异黄酮主要通过抑制p38/ERK/JNK/MAPK和NF-κB信号通路来降低破骨细胞形成,进而抑制关键因子NFATc1的向细胞核内转移趋势,抑制下游的破骨细胞特异性基因的扩增和蛋白的翻译。同时,木豆异黄酮还能通过抑制钙离子震荡水平来阻碍NFATc1的入核,但对活性氧无明显抑制效果。此外,Ptgs1为木豆异黄酮发挥效应的具体作用靶点,抑制Ptgs1能逆转木豆异黄酮的抗破骨细胞形成效应。
木豆异黄酮对骨骼干细胞无明显毒性作用,木豆异黄酮能促进骨骼干细胞成骨分化过程,且与浓度呈正相关,木豆异黄酮还能促进成骨标志物基因的表达,提升RUNX2、ALP、OSX的表达水平。
通过去卵巢的方式成功构建了雌激素缺乏性骨质疏松症疾病模型小鼠,4mg/kg浓度的木豆异黄酮对小鼠无明显毒性作用。体内实验结果表明,木豆异黄酮能减轻雌激素缺乏引起的骨量丢失,逆转骨微结构参数和维持骨小梁的完整性和连续性,提高PTGS1的表达水平,并能抑制破骨细胞的数目,且能促进新骨生成和维持成熟骨的含量,可作为新的骨质疏松症的替代治疗方案。
关键词: 木豆异黄酮 ；破骨细胞 ；Ptgs1 ；骨骼干细胞 ；雌激素缺乏性骨质疏松症
摘要： 目的:
1.通过生物信息学探讨龟甲(PT)抗老年性骨质疏松症(SOP)的潜在机制;
2.临床实验探讨PT干预下的SOP患者外周血单核细胞(HPBMs)破骨分化表型变化;
3.在动物实验中,明确PT抑制破骨分化治疗SOP的作用;
4.在细胞实验中,证实PT通过NF-κB通路抑制破骨分化治疗SOP的机制。
方法:
1.生物信息学分析
检索BATMAN数据库获取PT的成分及靶点信息,SOP靶点信息经由GeneCards平台获取,利用STRING数据库获取PT-SOP两者交集靶点的蛋白互作(PPI)信息,并使用Cytoscape软件、R软件、Enrichr平台进行PPI网络及“PT-成分-靶点-SOP”网络构建、GO生物过程及KEGG通路富集分析。
2.临床实验研究
从SOP患者中抽取血液样本,从中提取HPBMs,CCK8法检测不同浓度PT在0、1、3、5、7d对HPBMs增殖的影响,筛选安全给药浓度;诱导HPBMs破骨分化。TRAP染色检测不同梯度浓度的PT对HPBMs破骨分化的影响。
3.动物实验研究
所有实验小鼠随机分为对照组(CON组)、模型组(SOP组)、PT治疗组(PT组),其中CON组用充足的饲料和水饲养至3月龄时取材。剩余小鼠进行SOP造模后,SOP组和PT组分别予以PT和等体积溶剂干预8周后取材。分别检测:①Micro-CT比较三组小鼠L4椎体骨微结构参数的差异;②骨组织TRAP染色切片比较各组骨小梁表面的破骨分化的细胞数量及其活性。
4.细胞实验研究
(1)PT对小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)增殖的影响
从小鼠胫骨和股骨髓腔内分离BMMs,CCK8法检测不同浓度PT在2、3、4d对BMMs细胞增殖的影响情况,为后续实验确定无细胞毒性的给药浓度范围。
(2)PT对BMMs破骨分化的作用
TRAP染色和羟基磷灰石涂层骨吸收实验检测不同浓度PT对BMMs破骨分化及其骨吸收功能的影响。
(3)PT通过NF-κB信号通路影响破骨分化的机制
BMMs诱导破骨分化后,用不同浓度的PT干预,RT-qPCR、Western blot分别检测Nfatc1、C-fos、Traf6、Ctsk等破骨分化特异性基因、CTSK、RANK、NFATC1、C-FOS等破骨细胞相关标志蛋白以及p50、p-p50等NF-κB通路相关关键蛋白的相对表达情况。
(4)PT对NF-κB/p50轴的调控作用
用TRAP染色检测PT、LPS对破骨细胞分化的作用;羟基磷灰石涂层骨吸收实验检测PT、LPS对破骨细胞骨吸收功能的作用;Western blot检测PT、LPS干预破骨细胞前后p50、p-p50的蛋白表达。
结果:
1.生信分析
获得PT 6个活性成分,342个靶点,其中与SOP靶点交集的有57个,功能富集分析结果共得到882个GO条目(P<0.05),涉及破骨分化等过程,KEGG通路富集得到有188个结果,涉及到41条信号通路(P<0.05),其中包括NF-κB、MAPK等关键通路。
2.临床实验
PT显著抑制RANKL诱导的HPBMs破骨分化(P<0.001),并呈一定的浓度依赖性。
3.动物实验研究
(1)PT的干预显著改善SOP小鼠的骨微结构损害
在雌/雄性小鼠中,相较于CON对照组,SOP组的相对骨体积分数(BV/TV)均明显降低(P<0.001),与SOP组相比,PT干预组的BV/TV均明显升高(P<0.01)。Micro-CT 3D骨重建图显示,雄性和雌性SOP组均相较于对应的CON组,骨微细结构呈现更显著的损害,而PT干预组的骨微细结构较SOP组均显著改善。
(2)PT可以抑制SOP小鼠破骨细胞分化
在雄/雌性小鼠中,PT干预组0c.N/BS、0c.S/BS对比SOP组均明显降低(P<0.05)。
2.细胞实验研究
(1)PT浓度≤20μ g/ml时不影响,BMMs-的细胞增殖,对其没有细胞毒性。
(2)PT呈一定浓度依赖性地抑制破骨分化和骨吸收
①相较于CON对照组,1.25、2.5、5、10、20 μg/mlPT浓度干预后,破骨细胞数量显著减少(P<0.001),并成浓度依赖性;PT浓度在1.25、2.5 μg/ml浓度的PT干预后破骨细胞面积有减少趋势,但5、10、20 μg/ml浓度PT干预后,破骨细胞面积显著减少(P<0.01),并呈现一定的浓度依赖性;②与CON组相比,PT浓度在2.5、5、10 μ g/ml时,骨陷窝形成面积均显著减少(P<0.001)。
(3)PT通过对NF-κB信号转导通路的阻断作用来抑制破骨分化
①PT浓度在1.25、2.5、5、10、20 μ g/ml时能够呈浓度依赖性下调Nfatcl、C-fos、Traf6、Ctsk基因的相对表达(P<0.05);②PT浓度在1.25、2.5、5、10 μ g/ml时能够呈浓度依赖性抑制CTSK、RANK、NFATC1、C-FOS的蛋白表达(P<0.05);③PT在15、30、45分钟三个时间段均能够明显抑制破骨细胞内p50的磷酸化水平(P<0.05)。
(4)PT下调NF-κB/p50轴抑制破骨分化
①与CON组相比,LPS组破骨细胞数量和面积显著增加(P<0.001)。在PT干预后,LPS组的破骨细胞数量和面积均显著减少(P<0.001);②与CON组相比,LPS组骨陷窝形成面积显著增加(P<0.001)。PT干预后,LPS组的骨陷窝形成面积均显著减少(P<0.001);③与CON组相比,LPS组p50磷酸化水平(p-p50/p50比值)明显升高(P<0.001);PT干预后,可明显抑制LPS对p50磷酸化水平的上调趋势(P<0.01)。
结论:
本研究从生信分析-临床-动物-细胞实验四个方面证实PT可通过下调NF-κB通路抑制破骨细胞分化,进而起到改善SOP的作用。
关键词: 老年性骨质疏松症 ；龟甲 ；NF-κB ；破骨分化
摘要： 研究目的:探究在失用性骨质疏松症（Disuse osteoporosis,DOP）中破骨谱系细胞是否通过Polycystin1（PC1）感受机械负荷进而影响骨重塑,进一步阐明PC1调控破骨细胞生成的具体分子机制,并评估靶向PC1-TAZ轴的小分子化合物Zinc01442821对破骨细胞生成以及DOP的影响。 研究方法: 1.通过悬尾构建DOP的动物模型,利用micro-CT、免疫组化染色以及TRAP染色评估骨代谢情况; 2.DOP小鼠骨髓单核巨噬细胞（Bone marrow monocytes/macrophages,BMMs）以及经微重力干预后的BMMs进行破骨分化诱导,利用q PCR、TRAP染色、WB以及RNA-seq评估破骨细胞生成以及破骨谱系细胞中PC1的表达水平; 3.在Pkd1 flox/flox（Pkd1为PC1的编码基因）小鼠骨髓腔内注射AAV2/2-F4/80-cre-Zs Green,实现在巨噬细胞上特异性敲除Pkd1(Pkd1BMM△);将Pkd1 flox/flox小鼠与破骨前体细胞特异性Cre转基因小鼠杂交,获得破骨前体细胞特异性Pkd1基因敲除小鼠(Pkd1TRAP△),将这两种条件性敲除小鼠及其对照小鼠进行悬尾,利用micro-CT、免疫组化染色、TRAP染色、免疫荧光以及q PCR等方法评估Pkd1的敲除效率以及骨代谢情况; 4.提取Pkd1TRAP△小鼠BMMs进行破骨分化诱导、使用γ分泌酶抑制剂DAPT以及PC1碳末端尾（C-terminal cytoplasmic tail,CTT）结构域的过表达质粒干预破骨细胞,运用TRAP染色、骨吸收活性检测、F-actin免疫荧光染色、RNA-seq以及q PCR评估PC1-CTT对破骨细胞生成的影响; 5.免疫共沉淀检测PC1与TAZ的结合;siRNA沉默以及质粒过表达TAZ,利用TRAP染色、骨吸收活性检测、q PCR、RNA-seq、Ch IP-seq以及Ch IP-q PCR探究TAZ对破骨细胞生成的影响并明确相关的分子机制;siRNA沉默PC1以及DAPT抑制γ分泌酶的活性,利用q PCR以及WB检测PC1-CTT对TAZ核易位的影响。 6.在Taz flox/flox小鼠骨髓腔内注射AAV2/2-F4/80-cre-Zs Green,实现在巨噬细胞上特异性敲除Taz(Taz BMM△),进一步利用micro-CT、免疫组化染色、TRAP染色、免疫荧光以及q PCR等方法评估Taz的敲除效率以及骨代谢情况; 7.使用小分子化合物Zinc01442821干预破骨细胞,利用TRAP染色、WB以及q PCR评估Zinc01442821对破骨细胞生成以及TAZ核易位的影响;DOP小鼠腹腔注射Zinc01442821或对照溶剂,利用micro-CT、免疫组化染色以及TRAP染色评估骨代谢情况。 研究结果: 1.与对照小鼠相比,DOP小鼠破骨细胞数目增加,成骨细胞数目减少,骨量显著降低。 2.与对照BMMs相比,DOP小鼠BMMs以及经微重力干预后的BMMs分化为破骨细胞的能力增强,同时伴有PC1表达量的显著增加;RNA-seq分析结果表明,微重力可以上调机械敏感相关信号通路以及促进破骨细胞融合。 3.与对照小鼠相比,Pkd1BMM△以及Pkd1TRAP△小鼠破骨细胞数目减少,成骨细胞数目无明显差异,骨量增加;此外,Pkd1BMM△以及Pkd1TRAP△小鼠均可以对抗悬尾诱导的破骨细胞数目增加以及骨量减少。 4.与对照小鼠BMMs相比,Pkd1TRAP△小鼠BMMs分化为破骨细胞的能力减弱;RNA-seq分析结果表明,沉默Pkd1可以下调破骨细胞分化相关通路和基因;γ分泌酶抑制剂DAPT可以抑制破骨细胞生成,而质粒过表达CTT则可以促进破骨细胞生成。 5.PC1与TAZ可以在蛋白水平相结合;siRNA沉默TAZ抑制破骨细胞生成,进一步RNA-seq分析结果表明,沉默TAZ可以下调破骨细胞分化相关通路和基因,而质粒过表达TAZ则可以促进破骨细胞生成;抑制PC1/CTT可以显著减少TAZ的核易位;Ch IP-seq以及Ch IP-q PCR明确TAZ可以结合到破骨细胞相关基因的启动子上。 6.与对照小鼠相比,Taz BMM△小鼠破骨细胞数目减少,成骨细胞数目无明显差异,骨量增加。 7.Zinc01442821可以抑制破骨细胞生成以及TAZ的核易位;与对照组相比,Zinc01442821干预的DOP小鼠破骨细胞数目和脂肪空泡减少,成骨细胞数目增加,骨量增加。 研究结论: 1.破骨谱系细胞通过PC1感受机械负荷进而促进DOP的发生; 2.PC1通过增加TAZ入核从而促进破骨细胞生成; 3.Zinc01442821通过抑制破骨细胞和脂肪空泡生成、促进成骨细胞生成从而延缓DOP的骨丢失。 图25幅,表13个,参考文献91篇
关键词: 失用性骨质疏松症 ；破骨细胞 ；机械负荷 ；Polycystin1 ；TAZ
摘要： 目的:通过探究Temuterkib在体外对破骨细胞和成骨细胞分化和功能的的影响,并在体内研究Temuterkib对小鼠卵巢切除骨质疏松模型中调控骨量的作用,进而探讨Temuterkib是一个有价值的治疗骨质疏松的潜在候选药物,为开发针对破骨细胞活性过高引起的相关骨代谢疾病的药物提供科学的研究基础。
方法:1.提取C57BL/小鼠的骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow macrophages,BMMs),用核因子κB受体活化因子配基(Receptor activator protein Kinases lligand,RANKL)诱导,用CCK8试剂盒检测Temuterkib对破骨前体细胞细胞增殖的影响;行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAcP)染色试剂盒检测分析Temuterkib对破骨细胞分化的影响;在破骨细胞分化的不同时间段加入Temuterkib,用TRAcP染色标记破骨细胞,分析Temuterkib对破骨细胞数量抑制的时间段。应用罗丹明-鬼笔环肽/DAPI对破骨细胞染色,观察不同浓度Temuterkib对伪足小体带形成的影响;予BMMs接种于到骨片,观察Temuterkib对骨吸收功能影响;运用RT-PCR检测Temuterkib对破骨细胞相关基因的表达;免疫荧光染色探究Temuterkib抑制破骨细胞中NFATcl的核转入情况;运用蛋白免疫印迹检测Temuterkib对RANKL诱导的相关骨代谢信号通路的影响,包括NF-ΚB、MAPK等信号通路的影响。
2.成骨细胞用诱导液培养后,用CCK8试剂盒检测Temuterkib对成骨细胞增殖的影响;行碱性磷酸酶染色(ALP)染色,分析其对成骨细胞分化的影响;茜素红染色分析对成骨细胞矿化的影响;运用RT-PCR检测Temuterkib对成骨细胞相关基因的表达,包括RUNX2、ALP、OCN、OPG、COLLA;运用免疫荧光染色检测Temuterkib对骨形成相关的Wnt/β-catenin信号通路的影响。
3.我们构建小鼠卵巢切除(OVX)雌激素缺乏诱导的小鼠骨质疏松模型。Temuterkib治疗结束后,Micro-CT扫描分析测量松质骨骨微结构相关的参数;从H&E和TRAcP染色方面,分析组织形态学变化。
结果:1.Temuterkib对BMMs增殖活性没有影响;TRAcP染色证实Temuterkib浓度梯度抑制破骨细胞的生成,Temuterkib可在早、中期抑制RANKL诱导的破骨细胞形成;F-actin染色结果显示,Temuterkib呈剂量依赖性抑制伪足小体带形成;骨吸收实验结果表明Temuterkib呈剂量依赖性抑制破骨细胞骨吸收面积;RT-PCR检测显示,Temuterkib抑制破骨细胞相关基因C-FOS、DC-STAMP、Acp5、CTSK、MMP9及NFATc 1的表达,且呈剂量依赖性;免疫荧光染色证实Temuterkib抑制破骨细胞中NFATc 1的核转入情况。蛋白免疫印迹证实Temuterkib抑制RANKL诱导的BMMs细胞MAPK通路中的JNK的磷酸化,从而抑制下游信号蛋白c-Fos/NFATc1和功能蛋白CTSK的表达。
2.Temuterkib对成骨细胞增值活性没有影响;碱性磷酸酶染色(ALP)证实Temuterkib浓度梯度促进成骨细胞分化。茜素红染色证实Temuterkib浓度梯度促进成骨细胞矿化。RT-PCR检测显示,Temuterkib促进成骨细胞相关基因RUNX2、ALP、OCN、OPG、COLLA的表达,且呈剂量依赖性;Western Blot结果显示Temuterkib激活Wnt/β-catenin信号通路的促进成骨细胞β-catenin、RUNX2蛋白的表达。
3.Micro-CT扫描证实Temuterkib抑制OVX诱导骨丢失;H&E染色证实,Temuterkib改善OVX诱导小鼠组织形态学骨量减少;TRAcP染色证实Temuterkib减少OVX诱导小鼠组织形态学破骨细胞数量。内脏器官病理切片染色分析Temuterkib的对小鼠体内无代谢毒性。
结论:Temuterkib通过调控JNK/MAPK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收功能,Temuterkib通过Wnt/β-catenin信号通路的激活,促进成骨细胞分化和成熟,减少OVX导致的骨丢失,调节骨稳态。
关键词: Temuterkib ；破骨细胞 ；成骨细胞 ；骨质疏松
摘要： 研究背景器官移植是当代医学一项重要成就。然而,由于细胞表面的人类白细胞抗原HLA具有高度多态性,除同卵双生个体外,供-受体之间HLA不能完全匹配,在进行同种异体器官移植后,机体会启动免疫应答,导致急性排斥(acute rejection)反应。急性排斥反应是由获得性免疫和先天性免疫途径共同参与和介导的同种异体免疫反应。其中CD4+辅助T细胞在介导急性排斥反应导致的同种异体移植物的炎症和损伤中起着关键作用。CD4+T细胞活化后,进一步分化为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg),并通过分泌多种细胞因子刺激其他效应细胞。其中Th1和Th17T细胞通过分泌细胞因子白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-17(IL-17)等促进免疫排斥的发生;而Treg细胞则可通过分泌白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)等因子对免疫排斥反应产生负调控作用。因此,目前针对器官移植后急性排斥反应的干预策略主要关注如何有效抑制Th1、Th17T细胞的免疫功能及如何增加CD4+T细胞向Treg方向分化两个方面。当前临床上移植术后常用的免疫抑制剂主要包括糖皮质激素、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)抑制剂、mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶点)抑制剂、霉酚酸盐和基于多克隆/单克隆抗体的生物疗法。这些药物的应用,使早期的急性排斥反应得到有效控制,极大提高了移植物的存活率。然而,使用免疫抑制药物所产生的不良影响,例如,肾毒性、慢性肾脏损伤和移植后恶性肿瘤等,某些患者中难治性排斥反应的发生,以及因一种治疗方案疗效不好而转换到另一种治疗方案时患者出现的药物不耐受,这些因素都可能限制现有药物的整体治疗效果。同时,这些药物通常不能诱导免疫耐受,使得移植后患者需要长期甚至终生用药。因此,寻找新的具有良好功效和安全性的替代性免疫抑制剂是非常必要的。CX-5461是一种选择性RNA聚合酶Ⅰ抑制剂,其最初的研发目的是作为抗肿瘤药,目前正在进行血液和实体恶性肿瘤的临床试验。这些试验的初步数据表明,CX-5461静脉注射后人体耐受性良好,并显示出良好的短期安全性。除了抑制肿瘤细胞增殖,我们之前的研究表明CX-5461对各种增殖性血管疾病有治疗作用,包括球囊损伤诱导的新生内膜增生、移植血管病变和实验性肺动脉高压。在这些研究中,我们观察到CX-5461在血管和巨噬细胞中表现出抗增殖和抗炎作用。此外,我们发现CX-5461在小鼠心脏成纤维细胞中有显著的抗纤维化作用。基于这些结果,本研究中我们探索CX-5461是否具有免疫抑制活性,是否可以用于预防同种异体移植后的急性排斥反应。研究目的1.在异位心脏移植模型(F344-Lewis大鼠)中观察CX-5461是否能防止急性同种异体移植排斥反应,延长移植物存活时间。2.在细胞水平研究CX-5461是否能抑制T细胞活化,是否对Treg细胞分化有影响。3.探索CX-5461潜在的免疫抑制作用的生物学机制。研究方法一、CX-5461抑制同种异体心脏移植后急性排斥反应的药理作用研究1.动物分组及给药将接受同种异体心脏移植大鼠随机分为3组:对照组、CX-5461干预组和FK506干预组(每组8只)。CX-5461以12.5mg/kg/3天的剂量灌胃给药。FK506给药剂量为1.Omg/kg/天,肌肉注射。每天对动物进行触诊检查,记录移植物生存时间。我们还设立一个单独的长期观察队列,前两周动物按上述方法分组和给药;之后采用CX-5461按12.5mg/kg/5天,FK506按1.0mg/kg/3天的剂量进行维持治疗。总观察时长为85天。2.异位心脏移植模型采用异体(F344 to Lewis)异位心脏移植模型。供体大鼠戊巴比妥钠(60 mg/kg腹腔注射)麻醉后剖开腹腔。经下腔静脉输注肝素,3分钟后,下腔静脉放血处死动物。胸腔置冰屑使供体心脏停跳。依次结扎下腔静脉、肺静脉、左右上腔静脉、主动脉弓;横断升主动脉(连同无名动脉)和肺动脉。取出心脏,经无名动脉用冷肝素生理盐水冲洗,4℃保存在肝素生理盐水中。受体大鼠术前禁食12小时,戊巴比妥钠(60 mg/kg)加卡洛芬(5 mg/kg,皮下)麻醉。沿颈部行纵行旁正中切口。分离右侧颈外静脉和颈动脉,夹闭血管近端;远端结扎切断。采用套袖原理用静脉留置针套管翻套动脉和静脉。分别将移植物上的肺动脉与受体的颈外静脉吻合,将移植物上的无名动脉与受体的颈动脉吻合。取出血管夹恢复血流。生理盐水冲洗并缝合皮肤切口。给予庆大霉素(20mg/kg/天,腹腔注射)连续3天预防感染。如果供体心脏跳动正常,则在术后48小时(计为实验第1天)开始免疫抑制治疗;否则,该样本将视为手术失败排除在外。3.取材及标本检测第7天,动物腹腔注射戊巴比妥钠(～300 mg/kg)安乐死,采集外周血、心脏移植物、手术同侧颈浅淋巴结、脾脏。全自动血细胞分析仪对外周血细胞进行分类计数;Elisa试剂盒检测外周血血浆中IL-2、IFN-γ的含量。对心脏组织切片进行苏木素-伊红(HE)和Masson染色,统计心外膜纤维-炎症组织层的平均厚度。免疫组化检测心外膜边缘区T细胞(CD3)、巨噬细胞(CD68)、B细胞(CD20)和浆细胞(CD138)的数量。用qPCR检测心脏和脾脏组织中 IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-1 7、IL-10、TGF-β、B 细胞激活因子(BAFF)及Pax5的mRNA表达;流式细胞术检测受体大鼠脾脏和外周淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量。二、CX-5461抑制T细胞增殖、活化的作用及机制研究1.人原代T细胞分离、培养取健康志愿者的外周血,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,加入X-VIVOTM 15无血清造血细胞培养基重悬,接种到24孔板中,加入抗CD3/CD28抗体(磁珠)刺激T细胞增殖,作用48小时,收集细胞于25cm2培养瓶中培养。2.CX-5461对T细胞增殖和活化的影响CX-5461(1μM)作用于用PMA(80 nM)+离子霉素(1μM)(P/I)刺激的Jurkat细胞。使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒测定细胞增殖。qPCR检测IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)及IL-17的mRNA表达。ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-2和IFN-γ的含量。Western blot检测IL-2和IFN-γ的蛋白表达。3.CX-5461对T细胞活化相关信号通路的影响由于蛋白激酶C(PKC)依赖的核因子(NF)-κB的激活和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)级联反应的激活是参与T细胞激活的两个关键信号通路,我们随后利用P/I刺激的Jurkat细胞研究了 CX-5461是否影响这些通路。用P/I诱导细胞活化,CX-5461(1μM)处理24小时。Western blot检测细胞中PKC的膜转位;检测NF-κB p65、细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)、JNK和p38的磷酸化水平;检测IκB-α、c-Fos、c-Jun和活化T细胞核因子(NFATc1)的蛋白表达水平。为了证实CX-5461在原代T细胞中具有类似的作用,我们用CX-5461处理预激活的人原代T细胞。Western blot检测Erk1/2磷酸化和c-Fos的蛋白表达水平。qPCR检测c-Fos的mRNA水平。4.CX-5461在人类T细胞中的全基因组mRNA测序分析为了进一步了解CX-5461抑制T细胞活化的分子机制,我们在预先活化的人原代T细胞中用CX-5461处理,然后进行全基因组mRNA测序。基于测序信息,我们在Jurkat细胞中进行了一系列的PCR验证。5.p53-DUSP5途径在CX-5461抑制T细胞活化作用中的角色基于测序信息和以往研究结果,我们进一步检测p53-双特异性磷酸酶5(DUSP5)通路是否介导了 CX-5461的免疫抑制作用。qPCR和Western blot检测DUSP5的mRNA和蛋白水平;Western blot检测p53蛋白的磷酸化水平。为了确定CX-5461对DUSP5表达的刺激作用是否依赖于p53,我们用选择性p53抑制剂pifithrin预处理Jurkat细胞,用Western blot/qPCR重新检测DUSP5和c-Fos的表达变化,Erk1/2的磷酸化水平,以及各种细胞因子的表达变化。为了进一步确定DUSP5在介导CX-5461药理作用中的角色,我们在Jurkat细胞中分别进行了 DUSP5基因沉默和过表达实验,用Western blot分别检测细胞中DUSP5和c-Fos蛋白的表达水平,Erk1/2的磷酸化水平;qPCR检测IL-2、IFN-γ、TNF-β及IL-17细胞因子的mRNA表达。6.CX-5461对Treg分化的影响由于Treg在调节机体免疫反应中起着关键作用,因此我们研究了 CX-5461 对急性同种异体排斥反应的抑制作用是否与 Treg 分化的改变有关。在人原代T细胞及Jurkat细胞中用qPCR检测CX-5461是否影响Treg标志物IL-10和TGF-β的表达;用pifithrin预处理明确p53在其中的角色。结果一、CX-5461抑制同种异体心脏移植后急性排斥反应的药理作用研究1.CX-5461延长大鼠同种异体心脏移植物存活时间CX-5461和FK506均能显著延长移植物生存期。HE染色和免疫组化结果显示,CX-5461治疗显著抑制了心外膜纤维炎性组织的形成,并减少了心肌中免疫细胞(T细胞、巨噬细胞、B细胞和浆细胞)的浸润。FK506的保护作用与CX-5461相似。2.CX-5461不引起系统性造血抑制外周血细胞分类计数表明,心脏移植术后白细胞总数显著增加,其中主要是由于淋巴细胞数量的扩增。CX-5461处理部分逆转了这种变化。FK506也有类似的效果。此外,与正常基线值相比,CX-5461没有引起明显的贫血或白细胞减少,说明CX-5461治疗与系统性造血抑制无关。3.CX-5461抑制受体大鼠体内T细胞的活化外周血血浆Elisa检测结果显示,接受CX-5461治疗的大鼠循环中IL-2和IFN-γ水平均显著下降;PCR结果显示CX-5461干预显著抑制了心脏移植物和脾脏中IFN-γ和IL-2的表达,但IL-6、IL-17和BAFF的改变不明显;B细胞特异性标记物Pax5在移植物中表达下降,但在脾脏中没有。4.CX-5461促进体内Treg分化在移植受体大鼠中,CX-5461 显著增加了脾脏和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Treg的数量;相比之下,FK506对Treg没有任何影响。PCR结果证实,CX-5461干预的大鼠脾脏中Treg标志物IL-10和TGF-β的表达水平上调,而在移植心脏组织中没有明显变化。二、CX-5461抑制T细胞增殖、活化的作用及机制研究1.CX-5461抑制T细胞增殖和细胞因子的表达CCK-8结果显示,1μM CX-5461能显著抑制P/I刺激的Jurkat细胞的增殖;PCR结果显示CX-5461显著降低了 P/I刺激的Jurkat细胞中IL-2、IFN-γ、TNF-β 和 IL-17 的 mRNA 水平;Elisa 和 Western blot 结果显示,CX-5461不仅显著抑制P/I刺激的Jurkat细胞上清中IL-2和IFN-γ的水平,还抑制了人原代T细胞中IL-2和IFN-γ的蛋白表达。2.CX-5461对T细胞中PKC和NF-κB通路的激活无显著作用Western blot结果显示,在Jurkat细胞中CX-5461对P/I刺激的PKC膜转位和NF-κB的抑制蛋白IκB-α的降解无显著影响;此外,NF-κB p65磷酸化水平无论在静息细胞还是P/I刺激的Jurkat细胞中均不受CX-5461的影响。3.CX-5461抑制T细胞中MAPK信号转导Western blot结果显示,CX-5461显著减弱P/I诱导的Jurkat细胞中Erk1/2的磷酸化水平,而并未改变c-Jun氨基末端激酶(JNK)或p38的磷酸化水平;
关键词: 同种异体免疫 ；CX-5461 ；急性排斥反应 ；p53 ；DUSP5 ；Erk1/2 ；T细胞受体信号转导
摘要： 目的:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因不明的慢性系统性炎症性疾病,其核心特征为受累部位滑膜异常增生、慢性滑膜炎症以及软骨和骨组织不可逆的侵蚀、破坏。70%的RA患者在发病2年内会出现不同程度的骨质疏松及骨破坏,重者可出现病理性骨折或身体残疾,严重影响生活质量。大量研究表明,多种因素参与下的破骨细胞(Osteoclast,OC)功能异常活化是RA骨破坏的始动因素。OC源自骨髓单核巨噬细胞系统,能够溶解骨组织是其独特的本领,因其可以通过向骨表面迁移、对骨质进行侵袭和吸收,而成为了RA患者发生骨质疏松和骨破坏的“元凶”。因此针对OC分化和功能的相关研究是预防和治疗RA骨破坏的关键。白细胞介素(Interleukin,IL)-35在多个自身免疫疾病中扮演重要角色。现有研究表明,IL-35在RA的病理过程中发挥负向调控作用。我们研究小组发现IL-35可以通过下调核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)、上调骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的方式参与骨代谢调节。同时,IL-35还能够抑制成熟OC的增殖、促进其凋亡。也有文献报道,IL-35可通过NF-κB通路抑制成熟OC所致的骨陷窝形成。但目前针对IL-35在OC形成和分化过程中作用的研究尚不够深入,因此本研究中,我们通过体外诱导RAW264.7细胞系生成OC和建立胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型,探讨IL-35对OC分化的影响及在CIA模型骨破坏中扮演的角色和相关机制,为临床RA合并骨破坏的预防和治疗提供依据。方法:1、选用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7作为OC前体细胞,加入不同浓度IL-35(0、25、50、100、150及200ng/ml)及RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage Colony Stimulating Factor,M-CSF)共同诱导成熟OC。(1)Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测不同浓度IL-35对RAW264.7细胞活性的影响;(2)用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色来评估不同浓度IL-35对RANKL及M-CSF诱导RAW264.7细胞向OC分化的影响;(3)Transwell小室方法检测不同浓度IL-35对OC迁移和侵袭能力的影响;(4)采用RT-PCR和Western-blot方法检测不同浓度IL-35对OC分化相关标志性基因及蛋白表达的影响。2、加入STAT1特异性抑制剂氟达拉滨(fludarabine),检测IL-35对OC分化相关信号通路的影响,进一步探讨IL-35影响OC分化和功能的相关机制。3、采用DBA/1J小鼠诱导建立CIA模型,实验组与模型组分别给予IL-35和磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)腹腔注射,评估小鼠一般状态及关节炎情况,并对关节骨组织行TRAP染色、苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色和微计算机断层扫描(Micro computed tomography,Micro-CT),评估IL-35在CIA小鼠模型骨破坏中的作用。结果:1、CCK-8结果显示IL-35对RAW264.7细胞无明显促进或抑制增殖的作用,说明IL-35对RAW264.7细胞活性无明显的影响。TRAP染色结果提示,RAW264.7细胞可以在RANKL和M-CSF诱导下分化成为成熟OC,不同浓度的IL-35组与对照组(即IL-35为0ng/ml组)相比,IL-35呈现浓度依赖的抑制OC生成(P<0.05),在200ng/ml组几乎无TRAP阳性细胞生成。Transwell小室结果显示,IL-35可以减少OC迁移和侵袭的穿膜细胞数,说明IL-35可以抑制OC的迁移、侵袭能力。RT-PCR及Western blot结果提示,IL-35显著降低C-fos、活化T细胞核因子1蛋白(NFATc1)及OC标志性因子核因子κB受体活化因子(Receptor Activator of Nuclear factorκB,RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate Resistant Acid Phosphatase,TRACP)、组织蛋白酶K(cathepsin K)的表达水平(P<0.05)。2、TRAP染色结果显示,加入fludarabine组TRAP阳性细胞数较IL-35组增多(P<0.05),但少于对照组。RT-PCR和Western-blot结果提示,IL-35可以促进STAT1的磷酸化,同时能够抑制PI3K/AKT信号通路及下游转录因子C-fos和NFATc1的表达,而这种抑制作用会被fludarabine所减弱(P<0.05)。3、与对照组相比,CIA+IL-35组和CIA组小鼠体重均呈现下降趋势,且CIA组体重整体低于CIA+IL-35组;CIA组关节肿胀度、关节炎指数明显高于CIA+IL-35组。关节骨组织TRAP染色提示IL-35可明显减少关节滑膜及骨组织附近TRAP阳性细胞数量。HE染色提示IL-35显著减轻滑膜增生及炎性细胞的浸润、聚集以及骨组织的破坏。Micro-CT提示IL-35上调CIA小鼠的骨体积分数(BV/TV)、骨密度(BMD)并减少CIA小鼠的关节骨破坏。结论:1、IL-35对RAW264.7细胞系无明显细胞毒性;IL-35能够抑制OC分化、减少成熟OC的生成,抑制OC的迁移和侵袭能力;同时还可以降低OC中RANK、TRACP、Cathepsin K、C-fos及NFATc1的基因及蛋白表达。2、IL-35通过激活STAT1通路、抑制PI3K/AKT信号通路及下游转录因子的表达,抑制RANKL和M-CSF诱导的OC分化。3、IL-35可以减轻胶原诱导性关节炎小鼠模型的关节骨破坏程度,起到骨保护作用。
关键词: 类风湿关节炎 ；骨破坏 ；白细胞介素-35 ；破骨细胞
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