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摘要： 为了研究葡萄籽原花青素提取物(Grape Seed Proanthocyanidin Extracts,GSPE)对糖尿病小鼠的降血糖作用及其机制,本文中采用腹腔注射四氧嘧啶(ALX)构建糖尿病动物模型。造模成功后,将糖尿病小鼠分为模型对照组、格列本脲处理组、葡萄籽原花青素提取物低、中、高三个剂量(50、100、150 mg/kg)处理组,另设正常对照组。连续灌胃给药21天,每天一次,以糖尿病小鼠的体重、血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性胰岛素水平、空腹血糖值和糖耐量为测定指标,研究不同剂量葡萄籽原花青素提取物对糖尿病小鼠的降血糖作用及机制。结果显示原花青素高剂量组能促进体重增长,显著降低糖尿病小鼠的血糖水平和糖耐量(P<0.01);同时降低糖尿病小鼠血清MDA水平,提高其SOD活性。通过本实验研究可以看出葡萄籽原花青素提取物具有较强的降血糖作用,降糖机制可能与其提高胰岛素水平和抗氧化能力有关。
关键词: 葡萄籽原花青素提取物 ；四氧嘧啶 ；糖耐量 ；降血糖机制
被引量
28
摘要： 目的:探讨葡萄籽原花青素提取物(GSPE)对糖尿病牙周炎大鼠牙周炎症的改善作用,并阐明其作用机制。方法:40只雄性SD大鼠随机分为对照组、糖尿病牙周炎模型组(模型组)、低剂量(100 mg·kg^(-1))GSPE组和高剂量(200 mg·kg^(-1))GSPE组,每组10只,除对照组外,其他各组大鼠采用牙周结扎法联合一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病牙周炎模型。模型建立成功后,低和高剂量GSPE组大鼠分别按100和200 mg·kg^(-1)GSPE灌胃给药,对照组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃,每天1次,连续8周。观察大鼠一般情况和血糖水平变化,采用HE染色观察各组大鼠牙周组织病理形态表现,测量各组大鼠牙槽骨吸收量,采用相关试剂盒检测各组大鼠牙周组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和活性氧(ROS)及丙二醛(MDA)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)水平,Western blotting法检测各组大鼠牙周组织中Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠出现明显“三多一少”症状,血糖水平明显升高(P<0.05),牙周结缔组织中炎性细胞浸润,牙周组织损伤,牙槽骨吸收量明显增加(P<0.05),牙周组织中SOD和CAT活性明显降低(P<0.05),ROS和MDA水平明显升高(P<0.05),血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高(P<0.05),牙周组织中TLR4和NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,低和高剂量GSPE组大鼠一般情况均明显好转,血糖水平明显降低(P<0.05),牙周组织损伤明显减轻,牙槽骨吸收量减少(P<0.05),牙周组织中SOD和CAT活性明显升高(P<0.05),ROS和MDA水平明显降低(P<0.05),血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低(P<0.05),牙周组织中TLR4和NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与低剂量GSPE组比较,高剂量GSPE组大鼠牙周组织中SOD和CAT活性明显升高(P<0.05),ROS和MDA水平明显降低(P<0.05),血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低(P<0.05),牙周组织中TLR4和NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:GSPE可改善糖尿病牙周炎大鼠牙周组织炎症,其作用机制与调节牙周组织中TLR4/NF-κB信号通路有关。
关键词: 葡萄籽原花青素 ；糖尿病 ；牙周炎 ；Toll样受体4 ；核因子κB
被引量
6
摘要： 目的研究葡萄籽原花青素对糖尿病小鼠肾脏氧化应激的作用以及其对血红素加氧酶-1的影响。方法选取ICR小鼠90只,通过腹腔注射四氧嘧啶200/(mg·kg^-1)对其中的60只小鼠进行造模。将模型组分为3组,分别为DM组、DM+低浓度GSPE组和DM+高浓度GSPE组。对照组30只,分为3组,分别为正常对照组、正常+低浓度GSPE组和正常+高浓度GSPE组。实验过程中定期观察体重、血糖、平均饮水量变化情况。干预6周后,摘眼球取血、处死小鼠取肾脏组织制备匀浆,进行各项指标的测定。结果一般情况:GSPE缓解DM小鼠体重减轻症状(P<0.05),模型各组小鼠的血糖比正常对照组高(P<0.05)。生化指标:模型各组TG和TC均高于正常对照组(P<0.001),模型组内DM+高浓度GSPE组最低、DM组最高(P<0.001)。肾功能指标:模型各组BUN、CRE均高于正常对照组(P<0.001),模型组内DM+高浓度GSPE组最低、DM组最高(P<0.05)。氧化损伤与抗氧化指标:与正常对照组比较,模型各组MDA、CAT均升高,GSH-Px、GSH、SOD、HO-1均降低(P<0.05),模型组内DM组各项指标均最高(P<0.05)。结论GSPE能够通过提高机体内抗氧化能力,抑制氧化应激作用来缓解糖尿病小鼠基本情况,缓解肾脏损害,GSPE通过影响HO-1表达以改善机体糖尿病的氧化应激状态。
关键词: 糖尿病 ；氧化应激 ；葡萄籽原花青素 ；血红素加氧酶-1
被引量
10
摘要： 目的探讨葡萄籽原花青素提取物(GSPE)通过调控沉默信息调节因子1(SIRT1)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)通路对糖尿病肾脏疾病(DKD)大鼠的保护作用。方法将40只雄性SD大鼠随机分为对照组、对照治疗组、模型组和治疗组,每组10只。腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型,对照治疗组和治疗组灌胃GSPE,对照组和模型组灌胃等量生理盐水,连续给药12周,检测大鼠血糖、血肌酐和尿微量白蛋白;过碘酸希夫(PAS)染色观察肾组织病理学变化;透射电镜观察肾组织超微结构;采用Tunel染色法评估肾组织细胞凋亡水平;采用免疫组化法和Western blotting法检测肾组织中线粒体生物合成SIRT1/PGC-1α通路相关分子SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子1(NRF1)和线粒体转录因子A(TFAM)的表达水平。结果模型组血糖[(39.38±4.18)mmol/L vs(8.21±3.57)mmol/L]、血肌酐[(55.83±3.72)μmol/L vs(40.00±2.49)μmol/L]和尿微量白蛋白[(10.98±3.36)mg/L vs(1.22±0.23)mg/L]水平较对照组升高(P<0.05)。模型组肾组织损伤严重,线粒体碎片化增多,细胞凋亡[(31.81±8.84)%vs(0.50±0.35)%]多于对照组(P<0.05);同时肾脏中线粒体生物合成相关分子SIRT1(0.34±0.13 vs 0.66±0.06)、PGC-1α(0.32±0.03 vs 0.71±0.13)、NRF1(0.05±0.01 vs 0.21±0.02)和TFAM(0.06±0.03 vs 0.33±0.06)蛋白表达水平较对照组降低(P<0.05)。经GSPE干预后,治疗组血糖[(27.26±3.93)mmol/L vs(39.38±4.18)mmol/L]、血肌酐[(43.50±1.70)μmol/L vs(55.83±3.72)μmol/L]和尿微量白蛋白[(4.05±2.06)mg/L vs(10.98±3.36)mg/L]水平较模型组下降(P<0.05),细胞凋亡[(4.90±1.62)%vs(31.81±8.84)%]减少(P<0.05),肾脏中SIRT1(0.55±0.05 vs 0.34±0.13)、PGC-1α(0.62±0.14 vs 0.32±0.03)、NRF1(0.16±0.02 vs 0.05±0.01)和TFAM(0.26±0.06 vs 0.06±0.03)蛋白表达水平较模型组升高(P<0.05)。结论GSPE可能通过调控线粒体生物合成SIRT1/PGC-1α信号通路,改善DKD大鼠肾脏线粒体生物合成,从而发挥肾脏保护作用。
关键词: 糖尿病肾脏疾病 ；线粒体生物合成 ；葡萄籽原花青素提取物
被引量
4
摘要： 研究葡萄籽原花青素提取物对链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)致糖尿病小鼠的作用及影响,并探讨相关机制。通过高脂饲喂结合腹腔注射STZ造糖尿病小鼠模型,将造模成功的糖尿病小鼠随机分为模型组,格列本脲组(250 mg/kg),葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)高剂量组(400 mg/kg)、中剂量组(200 mg/kg)、低剂量组(100 mg/kg),连续灌胃8周后通过断尾取血测定糖尿病小鼠空腹血糖;摘眼球取血,分离血清,测定血清中甘油三脂(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇的含量(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C);采用试剂盒测定血清白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)含量、C反应蛋白(C reactive protein,CRP)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、胰岛素(Insulin,INS)含量,丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量;分离胰腺,组织切片法观察胰腺组织学改变。实验结果显示GSPE高、中剂量组能显著降低STZ所导致的糖尿病小鼠的血糖;GSPE高、中剂量组的TG、TC含量比模型组的显著降低(P<0.05);GSPE高剂量组的HDL-C比模型组显著提高(P<0.05);GSPE高、中剂量组能显著降低血清中IL-6和CRP含量(P<0.05);GSPE高剂量组的INS含量与模型组比较显著性增加(P<0.05);GSPE高、中剂量组的SOD活性与模型组相比显著性增高(P<0.05),GSPE高剂量组的MDA含量与模型组比较显著性降低(P<0.05);糖尿病小鼠胰腺病变组织得到修复。综上所述,葡萄籽提取物原花青素对STZ所导致的糖尿病小鼠有明显的降低血糖和改善血脂,修复胰脏病变组织的作用,其作用机制可能与其能提高糖尿病小鼠机体抗氧化能力、降低炎症因子含量有关。
关键词: 葡萄籽原花青素提取物 ；糖尿病 ；血糖 ；抗氧化作用 ；炎症因子
被引量
10
摘要： 目的研究葡萄籽提取物原花青素(GSEP)对糖尿病小鼠抗氧化保护作用的影响。方法以四氧嘧啶小鼠制备糖尿病模型,将造模成功后的小鼠,分为模型组、GSEP低、中、高3个剂量(50、100、150 mg/kg)组,另设正常对照组。连续给药28 d后,空腹12 h后,取全血和肝脏,测定全血和肝组织中超氧歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量。结果经口给予小鼠GSEP 28 d后,高剂量组小鼠全血和肝组织中SOD和GSH-Px活性均明显高于模型组(P<0.05),中、高剂量组小鼠全血和肝组织中丙二醛(MDA)含量均明显低于模型组(均P<0.05)。结论 GSEP对糖尿病小鼠具有明显的抗氧化保护作用。
关键词: 葡萄籽 ；原花青素 ；四氧嘧啶 ；抗氧化 ；超氧化物歧化酶
被引量
17
摘要： 目的:通过检测糖尿病牙周炎大鼠牙周组织中相关炎性因子的表达,探究葡萄籽原花青素提取物(GSPE)对糖尿病牙周炎是否存在影响。方法:选择健康雄性SD大鼠45只随机分为三组:正常对照组(H)、糖尿病牙周炎组(P)和糖尿病牙周炎+GSPE治疗组(G)。采用牙周结扎+高糖高脂饮食+腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病牙周炎大鼠模型,建模后G组给予浓度为100mg/kg GSPE溶液连续灌胃给药40天;检查牙周探诊深度(PD)及附着水平(AL),HE染色观察牙周组织形态,免疫组化染色检测上颌第二磨牙牙龈组织中TNF-α和IL-1β的表达水平。结果:相较H组,P组大鼠牙周组织炎症显著,PD、AL均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),牙龈组织中TNF-α、IL-1β表达均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);而G组牙周炎症好转,PD、AL均低于P组,差异具有统计学意义(P<0.05),同时牙龈组织中TNF-α、IL-1β的表达均低于P组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:GSPE能抑制糖尿病牙周炎大鼠牙龈组织中TNF-α、IL-1β表达,改善其牙周炎症状态及牙槽骨破坏程度,对糖尿病牙周炎具有一定辅助治疗作用。
关键词: 葡萄籽原花青素提取物 ；糖尿病牙周炎 ；TNF-α ；IL-1β
被引量
3
摘要： 目的:铁死亡和炎症反应在糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)的发病机制中起重要作用,本研究将探讨葡萄籽原花青素提取物(Grape Seed Procyanidin Extracts,GSPE)对糖尿病肾病大鼠铁死亡和炎症反应的影响及机制。方法:选取45只SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠,随机选取10只作为对照组,剩余35只高糖高脂饲料喂养并联合链脲佐菌素建立糖尿病肾病模型。将造模成功的大鼠随机分为DN模型组、GSPE(250mg/kg)干预组、Fer-1(2.5μmol/kg)干预组进行干预。全自动生化分析仪检测各组大鼠肾功能指标,试剂盒检测肾组织抗氧化能力。HE染色、PAS染色观察各组大鼠肾组织病理变化;Western Blot检测铁死亡、炎症因子和Nrf2通路相关蛋白表达水平。结果:与正常组比,DN组大鼠肾组织结构破坏,肾小球变大,肾功能指标尿素氮、血清肌酐和尿白蛋白上调,氧化损伤指标MDA和ACSL4水平升高,GSH和SOD水平下调,铁死亡标志蛋白GPX4下降,TfR1水平升高,促炎介质和炎症因子PTGS2、HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达上调,Nrf2通路蛋白表达下调。与DN组比较,GSPE和Fer-1干预后,Nrf2信号通路被激活,铁死亡和炎症反应均显著改善。结论:GSPE抑制铁死亡和炎症反应从而改善DN大鼠肾损伤,其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。
关键词: 糖尿病肾损伤 ；铁死亡 ；炎症反应 ；葡萄籽原花青素 ；核转录因子E2相关因子2
摘要： 目的观察葡萄籽原花青素提取物(GSPE)对糖尿病(DM)大鼠体内氧化应激水平的影响。方法给W istar大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg,制成模型,随机分为DM模型对照组、氨基胍组(150 mg.kg-1.d-1)和GSPE低、中、高三个剂量组(50、150、450 mg.kg-1.d-1),并作正常对照。常规喂养12 w后取大鼠血清用比色法比较各组超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。结果与DM模型对照组比较,GSPE可以显著升高血清SOD、降低MDA。结论GSPE能够降低DM大鼠的氧化应激水平,具有防治DM慢性并发症的作用。
关键词: 葡萄籽原花青素提取物 ；糖尿病模型 ；氧化应激
被引量
7
摘要： 糖尿病及高脂血症已成为影响人类生命健康的两大疾病,长期药物治疗后会产生副作用甚至毒性,寻找高效低毒的药食同源植物备受关注。本文采用超声波辅助10种不同极性溶剂对沙棘渣中活性成分进行提取,研究沙棘渣活性成分提取效果及体外降血糖、降血脂活性,确定适宜的提取溶剂并采用超高效液相色谱联用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）进行成分鉴定分析;通过四氧嘧啶诱导建立糖尿病小鼠模型,评价沙棘果渣和籽渣提取物的体内降血糖、降血脂活性。以成型率,溶化率和吸湿率为评价指标,研制沙棘籽渣降糖降脂颗粒,为沙棘渣提取物降糖降脂功能性食品的开发提供理论依据。具体研究结果如下:（1）溶剂极性对沙棘渣提取物组成及体外降糖降脂活性影响。采用10种不同极性溶剂对沙棘果渣和籽渣中活性成分进行提取,溶剂极性不同对沙棘果渣、籽渣中活性成分含量和体外降血糖、降血脂活性有显著影响,其中60%乙醇提取物具有最高的粗提物得率,果渣的60%乙醇提取物中总酚含量（11.08 mg/g）、总黄酮含量（6.49 mg/g）和原花青素含量（6.18 mg/g）最高。籽渣的80%乙醇提取物中总酚含量（25.70 mg/g）最高,丙酮提取物中总黄酮含量（14.23 mg/g）和原花青素含量（16.87 mg/g）最高。沙棘果渣和籽渣丙酮提取物具有更好的α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶活性抑制能力。籽渣80%乙醇提取物、果渣60%乙醇提取物具有更好的甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合能力。对不同溶剂提取物活性成分进行分析,丙酮是提取沙棘籽渣中没食子酸、儿茶素的有效溶剂,其余酚类化合物在60%乙醇溶液提取物中的含量显著高于其他溶剂（P＜0.05）。从沙棘渣提取物中共鉴定出37种化合物,主要为黄酮和萜类化合物。对沙棘渣提取物活性成分与体外降血糖降血脂效果相关性进行分析。结果表明,总多酚、没食子酸、原花青素和儿茶素是籽渣提取物体外降血脂活性主要贡献者,原花青素和儿茶素与体外降血糖活性具有显著相关性（P＜0.05）。果渣提取物中的槲皮素与α-淀粉酶抑制活性显著相关（P＜0.05）,总多酚与降血脂能力具有显著相关性（P＜0.05）。（2）沙棘渣提取物对糖尿病小鼠的降血糖降血脂作用。通过建立糖尿病小鼠模型,研究沙棘渣提取物对糖尿病小鼠的降糖降脂作用。结果表明,与模型组相比,沙棘渣提取物可显著降低小鼠体重,改善糖尿病小鼠多饮多食症状,对肝脏和肾脏有一定的保护作用。且有明显的降糖效果,能够显著提高糖尿病小鼠糖耐量（P＜0.05）,降低糖化血清蛋白水平,增加胰岛素分泌,提高糖尿病小鼠肝脏中肝糖原水平。经沙棘渣提取物治疗后,糖尿病小鼠血清中总胆固醇、总甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低（P＜0.05）,高密度脂蛋白胆固醇水平显著增加（P＜0.05）,谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平显著降低（P＜0.05）。此外,沙棘籽渣和果渣提取物可显著升高糖尿病小鼠肝脏中的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平（P＜0.05）,降低丙二醛水平,减轻糖尿病小鼠肝脏组织损伤。籽渣提取物中剂量组的作用效果与二甲双胍组接近,两者无显著差异。（3）沙棘籽渣降糖降脂颗粒制备研究。筛选制备沙棘籽渣降糖降脂颗粒的适宜辅料配方和润湿剂,并对沙棘籽渣降糖降脂颗粒进行质量评价以及功能性评价。结果表明,沙棘籽渣降糖降脂颗粒的适宜制备条件为以提取物:麦芽糊精:木糖醇质量配比为3:2:1,体积分数为80%的乙醇为润湿剂时,制备颗粒效果最佳。颗粒均匀,吸湿率为11.50%,且成型率达到93.90%,溶化率为90.34%。对颗粒质量和功能性进行评价,结果表明,休止角为34.2°,临界相对湿度为69.55%。沙棘降糖降脂颗粒对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制能力的IC
关键词: 沙棘渣 ；活性成分 ；提取 ；降血糖 ；降血脂 ；沙棘籽渣降糖降脂颗粒
被引量
2
摘要： 目的:通过病例对照研究,探讨血清铁蛋白（Serum ferritin,SF）与2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）之间的联系;揭示铁死亡与β细胞功能损伤之间的关联,探讨原花青素是否通过铁死亡保护β细胞功能以及核因子红系2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）信号通路在β细胞铁死亡中的作用,明确原花青素保护效应可能的靶点。方法:（1）人群研究:选取石河子市人民医院符合T2DM纳入标准及排除标准的患者81例为病例组,按照年龄进行匹配的81例健康人为对照组。使用ELISA试剂盒检测SF浓度,同时测量被检者的身高、体重、血压及相关的生化指标。相关分析采用Pearson及Spearman相关,根据SF水平按照性别特异性四分位法将对照组分为4组,T2DM组采用对照组相同截点值进行分组,回归采用二元logstic回归分析。（2）动物实验:为研究铁死亡与β细胞功能损伤之间的关联,大鼠分为对照组、T2DM组、T2DM组+Fer-1（铁死亡抑制剂）组,为研究葡萄籽原花青素提取物（Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE）对β细胞铁死亡的保护效应及机制,将大鼠分为6组,分别为对照组、对照组+GSPE（250mg/kg）组、T2DM组、125mg/kg GSPE组、250mg/kg GSPE组和500mg/kg GSPE组。记录大鼠的饮水、尿量、体重和血糖;ELISA试剂盒测量Hb A1c和胰岛素水平;根据血糖和胰岛素水平计算HOMA-IR;HE染色观察胰腺组织病理改变;透射电子显微镜观察β细胞线粒体超微结构改变;试剂盒检测胰腺组织谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）水平;免疫组化染色观察4-羟基壬烯醛（4-Hydroxynonenal,4-HNE）的含量;ELISA试剂盒、Lillie染色测量各组胰腺组织中铁水平;WB检测各组中铁死亡关键蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）、半胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（cysteine/glutamate transporter,XCT）、酰基辅酶A合成酶长链家族4（acyl-Co A synthe-tase long-chain family 4,ACSL4）、Nrf2通路相关蛋白Nrf2、血红素加氧酶-1（Heme Oxygenase 1,HO-1）、醌氧化还原酶1(NAD（P）H Quinone Dehydrogenase1,NQO1)的表达水平;RT-qPCR对铁死亡特异性基因前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS2）、GPX4、XCT及Nrf2通路相关基因进行定量分析;（3）细胞实验:小鼠胰岛瘤细胞株MIN6细胞根据实验目的分为三部分:（1）对照组、Erastin组、高葡萄糖+高棕榈酸钠损伤组（HG/SP）、HG/SP+Fer-1组、HG/SP+DFO组、HG/SP+Erastin组;（2）对照组、HG/SP组、HG/SP+GSPE-low（10mg/L）、HG/SP+GSPE-mid（20mg/L）和HG/SP+GSPE-high（30mg/L）组;;（3）对照组、对照组+siNrf2、HG/SP组、HG/SP+siNrf2组、HG/SP+siNrf2+GSPE组、HG/SP+siNrf2+Fer-1组。用CCK8检测细胞存活;PI染色检测细胞死亡;显微镜观察细胞形态;免疫荧光观察Nrf2的表达及分布;试剂盒检测GSH、MDA、SOD、荧光素酶;WB及RT-qPCR检测内容和胰腺组织检测内容相同。结果:（1）在人群中T2DM组的收缩压、空腹血糖、球蛋白和SF高于对照组,血红蛋白、高密度脂蛋白、白蛋白、总胆红素、直接胆红素和间接胆红素低于对照组,差异均具有统计学意义（P<0.05）;经相关性分析可得,在T2DM组中SF与舒张压成负相关,r=-0.2855,SF与空腹血糖成正相关,r=0.216（P<0.05）。在调整高密度脂蛋白、总胆红素、空腹血糖和血红蛋白后,SF OR=3.7（1.1～12.2）(P<0.05)。（2）与对照组大鼠相比,T2DM组大鼠饮水、尿量、血糖显著增加,体重减少（P<0.05）;胰岛素显著降低,HOMA-IR显著增加（P<0.05）;HE染色显示胰岛出现病理改变;转铁蛋白显著提升,Fe2+沉积明显（P<0.05）;GSH和SOD的水平显著降低,而MDA的水平显著升高（P<0.05）;4-HNE的蛋白质水平升高;β细胞线粒体出现膜破裂、嵴消失的现象,正常线粒体占比减少;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达显著降低,而ACSL4的蛋白和PTGS2的mRNA水平上调（P<0.05）;Fer-1处理能显著逆转这些结果。细胞实验也得到了相似的结果:与对照组相比,在使用Erastin、HG/SP、HG/SP+Erastin之后,均显著减少细胞的存活（P<0.05）;细胞出现铁死亡的形态特征且细胞死亡增加（P<0.05）;Fe2+沉积明显（P<0.05）;GSH和SOD的水平显著降低,而MDA和ROS的水平显著升高（P<0.05）;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达显著降低,PTGS2的mRNA水平上调（P<0.05）;而Fer-1和DFO处理能逆转这些损伤。（3）与T2DM组相比,GSPE可以降低大鼠饮水、尿量、血糖,增加体重（P<0.05）;胰岛素显著升高,HOMA-IR显著降低（P<0.05）;HE染色显示胰岛病理改变得到改善;转铁蛋白含量显著降低,Fe2+沉积减少（P<0.05）;GSH和SOD的水平显著上升,而MDA的水平降低（P<0.05）;4-HNE的蛋白质水平降低;β细胞线粒体损伤减轻,正常线粒体占比增加（P<0.05）;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达升高,而ACSL4的蛋白和PTGS2的mRNA水平下调（P<0.05）。细胞实验也得到了类似的结果,与HG/SP组相比,不同剂量组的GSPE处理后,细胞的存活增加（P<0.05）,细胞死亡减少（P<0.05）;Fe2+沉积降低（P<0.05）;GSH和SOD的水平升高,而MDA和ROS的水平显著下降（P<0.05）;GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达升高,PTGS2的mRNA水平下调（P<0.05）;（4）动物和细胞实验结果都发现,与正常大鼠,T2DM大鼠以及细胞的对照组和HG/SP组相比,GSPE处理提高了Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白和mRNA水平（P<0.05）;在细胞实验中,免疫荧光显示GSPE促进了Nrf2的核转位（P<0.05）,核Nrf2蛋白显著提升（P<0.05）,且GSPE进一步提高ARE的活性（P<0.05）。在siNrf2细胞实验中发现,与对照组相比,siNrf2组、HG/SP组及siNrf2+HG/SP组的细胞活力下降（P<0.05）,细胞出现铁死亡的形态特征且细胞死亡增加（P<0.05）,GSH和SOD均降低,而MDA和ROS升高（P<0.05）,细胞内Fe2+沉积明显（P<0.05）,GPX4和XCT的蛋白和mRNA表达显著降低,PTGS2的mRNA上调（P<0.05）;然而GSPE和Fer-1的处理在一定程度上逆转了这些情况（P<0.05）。结论:（1）T2DM患者体内存在铁过载状态,升高的SF与T2DM的发生具有相关性,且SF与FBG之间也具有相关关系,提示SF可能参与T2DM的发生和发展。（2）T2DM大鼠胰岛β细胞和高糖高脂损伤的MIN6细胞中存在铁死亡;（3）GSPE增加铁死亡关键蛋白GPX4和XCT的表达,降低PTGS2和ACSL4的表达,是一种有效的铁死亡抑制剂,可改善T2DM;（4）GSPE在体内和体外通过Nrf2通路显著减少β细胞铁死亡,通过体外siRNA技术对Nrf2进行沉默,进一步验证了Nrf2信号通路在拮抗β细胞铁死亡中的作用,为T2DM的防治提供新的启示。
关键词: 2型糖尿病 ；铁死亡 ；GSPE ；氧化应激 ；Nrf2
摘要： 近年来,随着人们生活水平的不断提高,糖尿病的发病率逐年上升。预防糖尿病的关键在于干扰体内淀粉的消化和葡萄糖的吸收,α-淀粉酶是催化淀粉水解的关键酶,是治疗糖尿病的关键靶点。研究表明,长期的药物摄入会导致腹泻、腹胀和肝损伤等毒副作用,因此,寻找更新、更有效、副作用更小以及成本更低的α-淀粉酶抑制剂成为一个值得探索的研究领域。大量食物来源的天然多酚类化合物具有α-淀粉酶抑制活性,但目前还没有一套完整的筛选流程对食物来源的天然多酚类化合物的α-淀粉酶抑制活性进行系统的分析和研究,相关作用机制研究也尚不完善。本研究旨在通过虚拟筛选、酶抑制机制研究和体外模拟消化模型,对多酚类化合物的降糖活性进行全方面评估,并将评估结果应用于降糖果冻产品的研发。主要研究内容和结果如下: 利用Hiphop药效团模型结合CDOCKER和Lib Dock两种分子对接技术,构建α-淀粉酶抑制剂综合计算筛选方法,并成功应用于Phenol-Explorer数据库,筛选结果表明原花青素B2具有较高的α-淀粉酶抑制活性。分子对接数据显示原花青素B2与α-淀粉酶的结合能为-9.8 kcal/mol,主要作用于α-淀粉酶活性中心的His305,Val163和Trp59。光谱学研究表明原花青素B2可以通过疏水作用静态淬灭α-淀粉酶。 通过Englyst法进一步分析不同来源的原花青素提取物对淀粉消化率的影响,结果表明葡萄籽原花青素的体外模拟消化抑制能力显著。淀粉-碘结合实验表明葡萄籽原花青素可以由非共价键驱动与直链淀粉形成V型配合物,这一结果与XRD和FT-IR分析一致。SEM观察表明葡萄籽原花青素能够促进淀粉的聚集,阻碍淀粉酶对淀粉的水解。 采用单因素与正交试验设计对葡萄籽原花青素降糖果冻的配方和工艺进行优化,得到最佳的制作条件为葡萄籽原花青素提取物0.3%、复合胶3.0%、柠檬酸0.03%、甜菊糖苷0.04%;最佳制作工艺为煮胶时间6 min、煮胶温度90℃、灭菌时间15 min、灭菌温度85℃。最终得到的葡萄籽原花青素降糖果冻α-淀粉酶抑制率为(82.25±1.49)%,理化指标符合相关国家标准,口感清爽,酸甜适中,可以作为糖尿病患者的辅助食品,为未来果冻市场的天然化和功能性提供了新思路。
关键词: α-淀粉酶抑制剂 ；多酚 ；虚拟筛选 ；淀粉消化 ；果冻研发 ；葡萄籽原花青素
摘要： 心肌梗死是世界上最严重的致命性疾病之一，它是由冠状动脉急性闭塞引起的。葡萄籽原花青素提取物（GSPE）是从葡萄籽中提取的具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用的活性成分。天然产物价格便宜，易得，用途广泛，并且效果显著。目前它已被用于治疗多种疾病，如癌症、脑损伤和糖尿病并发症。然而，关于其在小鼠心肌梗死中的作用及相关机制的研究还很有限。基于课题组前期研究，本实验通过体内实验建立小鼠急性心肌梗死模型和体外试验建立细胞糖氧剥夺模型，研究葡萄籽原花青素产生的影响以及可能的信号通路的变化。为心肌梗死的治疗提供可循的依据，也为天然产物的深入研究发展奠定一定的实验基础。 研究目的 经过本课题组大量的文献调研综述出葡萄籽原花青素具有减轻缺血再灌注损伤、调节机体代谢、抗氧化损伤、降低炎症因子等多种功效。基于课题组前期研究，本实验通过结扎小鼠心脏冠状动脉建立急性心肌梗死的小动物模型模型，探讨PI3K/AKT相关通路与急性心肌梗死之间的关系，并研究葡萄籽原花青素对心肌梗死小鼠心脏功能和心脏病理变化产生的影响。除此之外，本实验还使用H9C2细胞建立糖氧剥夺模型，探讨葡萄籽原花青素对心肌细胞凋亡产生的影响以及PI3K/AKT相关通路与H9C2细胞凋亡之间的关系。通过我们的研究，希望能够为人类心肌梗死后心脏病理性改变提供新的治疗靶点，并且有可能为葡萄籽原花青素针对心肌梗死慢性损伤的临床治疗提供实验依据。 研究方法 第一部分葡萄籽原花青素对急性心肌梗死引起的心功能损伤的影响及机制研究 12只雄性C57BL/6J小鼠，根据体重随机选择6只作为正常组。其余6只小鼠经心脏左边冠状动脉结扎，建立急性心肌梗死模型。在将正常组和模型组各分为两组，一组采用GSPE灌胃喂养14天，一组采用等量生理盐水灌胃喂养14天。7d时测量一次体重，14d时测量体重，及使用多普勒超声仪器测量各项心功能指标。灌胃结束后，对小鼠实施安乐死。取腹主动脉血、心脏组织，检测各组小鼠血清中超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量;TTC染色观察心脏梗死面积;HE染色和Masson染色观察心脏组织形态变化;HE染色主要显示细胞心肌组织细胞炎症情况，Masson染色主要展示心肌组织细胞纤维化情况。WesternBlot检测Bcl-2和Bax蛋白含量，以及Col-1,Col-3和a-SMA的蛋白含量。免疫荧光染色检测a-SMA含量。按照以上分组，检测不同组PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。 第二部分阐述葡萄籽原花青素是通过PI3K/AKT信号通路缓解急性心肌梗死引起的心功能损伤 再重新分组，分为：正常组，模型组，MI+GSPE组，MI+GSPE+LY294002组。7d时测量一次体重，14d时测量体重，及使用多普勒超声仪器测量各项心功能指标。灌胃结束后，对小鼠实施安乐死。灌胃结束后，对小鼠实施安乐死。取心脏组织，HE染色和Masson染色观察心脏组织形态变化;HE染色主要显示心肌组织细胞炎症情况，Masson染色主要展示心肌组织细胞纤维化情况。WesternBlot检测Bcl-2和Bax蛋白含量，以及Col-1,Col-3和a-SMA的蛋白含量。免疫荧光染色检测a-SMA含量。同时检测不同组PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。 第三部分阐述体外葡萄籽原花青素通过PI3K/AKT信号通路减弱糖氧剥夺条件下的心肌细胞凋亡 H9C2细胞在缺氧环境（95%N2，5%CO2）下培养于无葡萄糖和无血清DMEM中。CCK8筛选最佳造模作用时间，建立稳定的H9C2细胞糖氧剥夺模型。CCK8检测葡萄籽原花青素对H9C2细胞增殖情况，确定给药浓度及时间。流式细胞术检测GSPE对细胞凋亡情况的影响。WesternBlot检测葡萄籽原花青素对凋亡的影响以及各组细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达。 重新分组，分为：正常组，模型组，OGD+GSPE组，OGD+GSPE+LY294002组。流式细胞术检测GSPE对细胞凋亡情况的影响。WesternBlot检测葡萄籽原花青素对凋亡的影响以及各组细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达。 研究结果 第一部分 1.心功能情况：与模型组相比，葡萄籽原花青素治疗组的心脏重量/体重比显著降低，LVEF和FS显著增加，而LVIDd和LVIDs显著降低（P＜0.05）。 2.心肌梗死面积：TTC结果显示，与模型组相比，葡萄籽原花青素治疗组的梗死面积明显小于MI组（P＜0.05）。 3.血清SOD、MDA情况：与正常对照组比较，模型对照组SOD水平明显降低（P＜0.05）、MDA水平明显升高（P＜0.05）;与模型对照组比较，葡萄籽原花青素治疗组SOD水平显著升高（P＜0.05），MDA水平显著降低（P＜0.05）。 4.心脏HE染色及Masson染色结果显示：葡萄籽原花青素一定程度上能改善心肌梗死小鼠的心脏病理改变。 5.WesternBlot结果及免疫荧光结果显示：葡萄籽原花青素显著增加心肌梗死后心肌组织中Bcl-2的表达，降低Bax的表达（P＜0.05）。此外，降低了Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和a-SMA的表达（P＜0.05）。免疫荧光也显示葡萄籽原花青素治疗组的a-SMA积分光密度显著低于MI组。WesternBlot结果显示：GSPE处理增强了PI3K/AKT信号通路。心肌梗死组p-PI3K和p-AKT表达增加，GSPE处理增强了这种激活。 第二部分： 1.与MI+GSPE组相比，LY294002治疗组的LVEF和FS显著降低（P＜0.05），而LVIDd和LVIDs显著增加（P＜0.05）。 2.心脏HE染色及Masson染色结果显示：Masson三色染色也显示MI+GSPE+LY294002组心肌纤维化胶原沉积面积明显高于MI+GSPE组（P＜0.05）。Hamp;E染色显示，与MI+GSPE组相比，MI+GSPE+LY294002组心肌坏死、炎性浸润和间质水肿增加（P＜0.05）。 3.WesternBlot结果及免疫荧光结果显示：施用PI3K抑制剂LY294002后，在MI造模后，LY294002治疗组的p-PI3K和p-AKT水平低于GSPE组。与GSPE组相比，LY294002升高了Bax蛋白水平，降低了Bcl-2水平，增加Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA水平。换言之，与MI+GSPE组相比，LY294002显著增加了细胞凋亡和纤维化。此外，免疫荧光显示，LY294002治疗组α-SMA的积分光密度高于MI+GSPE组。 第三部分： 1.最适宜的糖氧剥夺时间约为24小时，建立糖氧糖氧剥夺模型成功。 2.流式细胞术显示，在40μg/ml的葡萄籽原花青素可以显著减少H9C2细胞的凋亡（P＜0.05）。 3.WesternBlot结果显示，葡萄籽原花青素可以减弱凋亡，增加Bcl-2表达（P＜0.05），降低Bax表达（P＜0.05）。同时可以显著激活PI3K/AKT通路。 4.流式细胞术显示，PI3K/AKT抑制剂可以逆转葡萄籽原花青素的抗细胞凋亡作用（P＜0.05）。 5.WesternBlot结果显示，PI3K/AKT抑制剂能够抑制PI3K/AKT通路。逆转葡萄籽原花青素的抗凋亡作用，减少Bcl-2表达（P＜0.05），增加Bax表达（P＜0.05）。 研究结论 体内，体外实验均结果表明，葡萄籽原花青素可通过激活PI3K/AKT信号通路来减轻心肌细胞凋亡及纤维化改变，改善心脏功能及减缓心脏病理性进展。因此，葡萄籽原花青素可能是一种治疗心肌梗死的有前景的天然制剂。这个研究发现还有待临床试验来进一步验证。
关键词: 心肌梗死 ；葡萄籽原花青素 ；分子机制 ；PI3K/AKT信号通路
摘要： 研究背景糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最严重的微血管并发症之一,目前已超过肾小球肾炎跃居我国慢性肾脏病首位病因。DKD发病机制复杂,治疗费用高昂,药物不良反应发生率高,亟需寻找新的治疗靶点。线粒体是细胞的能量代谢中心,是众多致病因素首先作用的靶点。肾脏正常生理活动高度依赖线粒体供给能量,肾脏的线粒体含量在人体器官中位居第二,其中肾小管上皮细胞因其高代谢、高耗能的特性,拥有的线粒体数量明显高于肾脏其他细胞。此外,线粒体功能障碍一般在DKD早期出现且往往早于临床症状的发生。因此探讨线粒体损伤在DKD发病机制中的作用十分必要。线粒体生物合成和线粒体动力学稳态对维持线粒体功能具有重要意义。在正常生理条件下,线粒体生物合成和动力学相互依存,处于动态平衡之中;而DKD状态下,线粒体生物合成与融合减少,分裂增加,出现大量小的、碎片化的、无功能的线粒体,线粒体呼吸链复合物发生电子逃逸,生成大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),引发细胞凋亡。葡萄籽原花青素提取物(grape seedproanthocyanidin extract,GSPE)是一种从葡萄籽中提取的天然多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理作用。GSPE可有效减少DKD大鼠内质网应激,减缓肾损伤;在骨骼肌细胞中,GSPE可通过激活沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)及其下游分子过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅助活化因子 1α(peroxisomeproliferator-activatorreceptor ycoactivator-1α,PGC-1α)改善线粒体功能。而GSPE在DKD中的肾脏保护作用是否也能通过SIRT1/PGC-1α通路促进线粒体生物合成,改善线粒体功能,目前仍不明确。此外,在调节衰老和代谢紊乱中发挥重要作用的ShcA衔接蛋白家族成员p66Shc,能够调控细胞氧化应激和细胞信号转导途径,调节线粒体结构与功能。已有研究证实p66Shc与线粒体生物合成和动力学密切相关。而GSPE在DKD中的肾脏保护作用是否也能抑制p66Shc表达,调控线粒体生物合成和动力学稳态,保护线粒体功能,尚需进一步研究。因此,本论文假设p66Shc为GSPE的潜在治疗靶点,以此探索GSPE对DKD线粒体的保护作用,并设计相关实验加以验证。研究目的1.明确GSPE对DKD大鼠肾损伤的治疗效应,并阐明GSPE促进线粒体生物合成发挥肾脏保护作用的分子机制。2.明确GSPE能否维持高糖诱导下人近端肾小管上皮细胞(human kidney proximal tubular cells,HK-2)的线粒体生物合成和动力学稳态,能否减轻线粒体功能障碍。3.探讨高糖诱导下的HK-2细胞中p66Shc的表达变化及其在细胞氧化应激损伤和细胞凋亡过程中的作用。4.探讨p66Shc对HK-2细胞线粒体生物合成及动力学稳态的影响,及GSPE与p66Shc表达间的关系。研究方法1动物实验1.1将40只雄性SD大鼠均分为对照组、对照治疗组、模型组、治疗组。腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)制备糖尿病大鼠模型,对照治疗组和治疗组灌胃GSPE,对照组和模型组灌胃等量生理盐水,连续给药12周。1.2 12周后测量大鼠体质量,检测大鼠血糖、血肌酐和尿微量白蛋白水平;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和过碘酸希夫(periodic acid Schiff,PAS)染色观察肾组织病理学变化;透射电镜观察肾组织超微结构;原位末端转移酶标记技术评估肾组织细胞凋亡水平。1.3免疫组化及免疫蛋白印迹检测肾组织中线粒体生物合成相关蛋白:SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子 1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)和线粒体转录因子 A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)表达。2细胞实验2.1体外培养HK-2细胞,转染质粒或si-RNA实现p66Shc的过表达或缺失。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)和免疫蛋白印迹评估转染效率。2.2采用荧光探针检测HK-2细胞内和线粒体的ROS水平。流式细胞术检测线粒体膜电位的变化和各组别细胞凋亡率。2.3免疫蛋白印迹检测HK-2细胞中线粒体生物合成相关蛋白(SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM),线粒体动力相关蛋白1(dynamin-relatedprotein 1,Drp1)和线粒体融合蛋白1(mitofusins 1,MFN1)表达水平。研究结果1.GSPE能降低DKD大鼠血糖、血肌酐和尿微量白蛋白水平。2.GSPE能减轻DKD大鼠系膜细胞增生,减少肾小管结构破坏,减缓足细胞足突融合和基底膜增厚;改善肾小管上皮细胞中线粒体碎片化程度。3.GSPE能促进DKD大鼠线粒体生物合成,保护线粒体功能,减少肾脏细胞凋亡。4.GSPE能下调高糖诱导的HK-2细胞中p66Shc的表达,减少细胞凋亡。5.GSPE能减少HK-2细胞内和线粒体ROS产生,减少氧化应激损伤。6.GSPE能提升HK-2细胞线粒体膜电位,提高线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ和Ⅲ的活性,提升线粒体质量。7.GSPE能促进HK-2细胞线粒体生物合成,维持线粒体动力学稳态。研究结论本实验结果表明,天然抗氧化剂GSPE能通过下调p66Shc,促进线粒体融合及生物合成相关蛋白的表达,维持线粒体动力学稳态,减少氧化应激损伤,保护线粒体功能,减少细胞凋亡,减缓DKD的疾病进展。
关键词: 葡萄籽原花青素提取物 ；糖尿病肾脏疾病 ；线粒体生物合成 ；线粒体动力学 ；p66Shc
摘要： 当代人们不合理的食物摄入、较快的生活节奏以及较大的生活压力,导致Ⅱ型糖尿病患者人数一直处于增加的状态。一些降血糖药物或保健品虽然可以防治糖尿病,但是这些药物不仅昂贵,且其对糖尿病并发症的治疗效果不显著。因此,寻求价格便宜、且能较好地治疗糖尿病及其相应症状的保健产品意义重大。近年来,抗性淀粉(RS)由于其特殊生理功能和对Ⅱ型糖尿病及其并发症的显著疗效引起人们的极大关注,已成为淀粉行业、保健品行业、医药行业和营养科学等的前沿和热点。RS在人体内的功能类似于膳食纤维,在小肠中不被利用,进入大肠被发酵利用,进而在调节血糖、改善血脂、调节体重和糖尿病等方面发挥积极作用,将RS用于开发保健产品具有很好的前景。然而,目前国内外有关RS基功能性片剂的系统研究还未见报道。本研究采用压热-复合酶改性对籼米淀粉进行结构改性以制备抗性淀粉含量高的籼米淀粉。其次,将抗性淀粉制成方便携带和可食用的功能性口服片剂。最后,研究了片剂功能性成分对Ⅱ型糖尿病小鼠生理指标的影响。研究结果如下:(1)压热/复合酶修饰的大米淀粉(autoclaving/sequential triple enzymes-modified starch,A/STE-MS)蒸煮前后RS含量分别为46.6%和37.7%。A/STE-MS淀粉颗粒结构非常致密,短链比例显著提高,表观直链淀粉含量和热稳定性显著提高,晶体类型为显著的Ⅴ型。A/STE-MS也较易溶胀,溶解度增加,同时其表观粘度降低。(2)为研究葡萄籽原花青素提高抗性淀粉基片剂降血糖功效的可能性,本文以抗性淀粉和葡萄籽原花青素(GSPAs)作主要功能性成分,采用湿法制粒进行了抗性淀粉基功能性片剂的制备和工艺参数优化。片剂辅料筛选,单因素试验和响应面优化试验结果表明,片剂平均片重为400 mg/片时,各主辅料配比如下:抗性淀粉51%,葡萄籽原花青素(GSPAs)9%,微晶纤维素33.75%,交联聚乙烯吡咯烷酮5.25%,聚乙烯吡咯烷酮溶液浓度9%,硬脂酸镁1%。对所得片剂的外观性状和片重差异的研究结果表明,本研究确定的片剂主辅料配比是可行的。此外,该片剂的临界相对湿度为78.3%。(3)本文研究了片剂中功能性成分抗性淀粉(RS)和葡萄籽原花青素(GSPAs)在Ⅱ型糖尿病小鼠体内的生理功效。实验结果显示,RS和GSPAs共同处理可改善糖尿病小鼠精神状态及体重减轻现象,可增加血清中的胰岛素含量,改善血糖,调节血脂,减轻脏器相对重量,可改善机体肠道pH值,减缓糖尿病小鼠肝脏病变,减轻肝脏炎症,且效果优于单一的RS处理。本研究为制备高抗性淀粉含量的改性淀粉提供了思路,并证实了将抗性淀粉基功能性片剂应用于Ⅱ型糖尿病防治的可行性,为抗性淀粉基保健品的开发和Ⅱ型糖尿病的防治提供了新的视角,具有非常重要的意义。
关键词: 抗性淀粉 ；压热改性 ；复合酶改性 ；降血糖片剂 ；Ⅱ型糖尿病
被引量
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摘要： 研究背景随着人口老龄化程度加重,2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)的发病率和患病率逐年升高,已成为威胁人民健康的重大社会问题。而糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)这一最常见、最严重的糖尿病慢性微血管并发症,又在很大程度上容易进展为终末期肾脏病(endstage renal disease,ESRD)。当前现代医学治疗DN的主要策略是在血糖和血压控制良好的前提下,提倡低蛋白饮食,并主张积极降低血脂和应用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂等药物进行干预。此类疗法确实能延缓糖尿病患者进展到DN的进程,但是仍较局限,不能完全阻断DN的疾病进展。因此,我们有必要进一步探讨DN发病过程中的分子生物学机制,为找到更理想的治疗方案打下基础。有研究认为,机体长期处于较高的血糖水平以及因此而导致的氧化应激和炎症反应是导致DN的重要机制。因此,积极探索阻断氧化应激,阻断活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的继发损害,及抑制炎症反应是延缓及阻止DN进展的重要思路和方法。葡萄籽原花青素提取物(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)具有多种生物学活性。在GSPE中,葡萄籽原花青素B2(grapeseed proanthocyanidin B2,GSPB2)具有最强大的对抗炎症反应、减少细胞凋亡和减弱氧化应激等作用。GSPB2对2型糖尿病小鼠多个脏器有明确的保护作用,这一点我们已经在前期的实验中得到证明,但其对2型DN小鼠肾脏的保护作用及药理机制尚未完全阐明。本课题组前期应用 iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)定量标记蛋白质组学(proteomics)技术,探讨了 GSPB2干预后肾脏蛋白质组的质和量的变化。在蛋白质组学结果中,我们发现mimecan蛋白在DN中表达下调,GSPB2治疗后表达回调,提示该蛋白可能在DN发展中发挥一定作用。骨生成诱导因子(osteoinductive factor,OIF),是从牛的骨基质中提取出来的一种分泌蛋白,也被称为mimecan或osteoglycin(OGN),广泛表达于人体血管基质、心脏、卵巢、肺、肾脏等组织中。该因子已被证明具有调节胶原纤维形成以及癌细胞再生和分化等方面的作用。细胞外基质中的mimecan主要参与I型胶原的代谢调节,能够促进I型胶原的降解。因此我们推测,mimecan有可能参与DN疾病进展过程中血管病变,特别是微血管病变的发生发展,还有可能成为GSPB2治疗此类病变的药物作用靶点。研究表明,mimecan基因的第一个内含子中有核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)的结合序列。NF-κB已被证明在引起炎症反应、调节机体免疫应答等方面发挥重要作用。我们推测NF-κB可能通过与mimecan基因上特异位点结合,导致血管内皮受损,加重对糖尿病肾脏的损害。这一理解可能为DN的防治提供新的方向和策略。在前期工作基础之上,我们提出科学假设:GSPB2可能通过影响NF-κB信号通路的活性改善DN的炎症反应及纤维化状态,从而对糖尿病肾脏起到保护作用。因此,本项目利用实验性DN动物模型,采用免疫印迹(western blot)技术方法,就mimecan蛋白的表达情况进行验证,并观察NF-κB蛋白的活性。应用免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察小鼠肾脏组织中纤维化因子及炎症因子的表达情况,初步探讨GSPB2治疗DN的作用是否与NF-κB通路有关,推测mimecan在DN发病中发挥作用的可能通路,及探求GSPB2对DN发挥治疗作用的可能机制,为GSPB2对DN的防治提供新的实验依据,为DN的临床及实验研究提供可靠的理论依据。研究目的1.验证GSPB2干预能否对db/db小鼠早期肾脏功能改变和组织病理改变产生良性影响。2.应用iTRAQ蛋白质组学技术鉴定db/db小鼠与正常小鼠、db/db小鼠GSPB2治疗组与非治疗组肾脏差异表达的蛋白质,发现mimecan蛋白在DN中表达下调,GSPB2治疗后表达回调,证明该蛋白在DN的调节机制中可能发挥一定作用。3.应用western blot技术方法对差异蛋白mimecan的表达情况进行验证。4.应用western blot方法观察正常小鼠组、db/db小鼠组,及GSPB2治疗组小鼠的肾脏组织NF-κBp65蛋白表达情况,以揭示GSPB2对小鼠肾脏组织发挥保护作用的机制。5.应用免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察小鼠肾脏组织中促纤维化因子及炎症因子的表达情况。研究方法选取7周龄雄性C57BLKS/J db/db小鼠24只及7周龄雄性C57BLKS/Jdb/m小鼠12只进行实验。C57BLKS/Jdb/m小鼠12只作为正常对照组(CC),随机选取12只C57BLKS/Jdb/db小鼠作为DM组(DM),每日予生理盐水灌胃10周;12只为GSPB2干预组(DMT),以30mg/kg/d GSPB2灌胃10周。每周测小鼠体重。实验结束时,采用ELISA法测定小鼠24 h尿白蛋白排泄量。实验结束后,采下腔静脉血测定空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三醋(TG)、血浆糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)等指标;小鼠禁食12 h处死后,留取各组小鼠肾脏组织,部分进行PAS染色,观察病理变化,部分肾脏用于iTRAQ蛋白质组学分析和western blot分析。提取各组小鼠肾脏的组织总蛋白样本,进行差异蛋白的功能和定位分析以及生物信息学分析;另一部分提取到的组织总蛋白使用western blot的方法进行验证各组小鼠中mimecan蛋白的表达情况。一部分肾脏组织用于提取组织核蛋白,提取到的核蛋白用westernblot的方法检测各组小鼠肾脏组织中NF-κBp65蛋白表达情况。免疫组化法、RT-PCR法及westernblot法观察小鼠肾脏组织中促纤维化的转化生长因子(transforming growth factor β,TGF-β)、胶原 I(collagen I,COL I)、αα-血管平滑肌肌动蛋白(αα-Smooth muscleαctin,α-SMA)及炎症因子IL-6、TNF-α的表达。研究结果1.一般观察:CC组小鼠状态良好,毛发光亮,性情好动,活动灵敏,反应迅速。DM组小鼠多食、多饮、多尿,体重明显增加,皮毛蓬松,毛光暗淡,反应慢,动作缓。GSPB2治疗后db/db小鼠上述表现较DM组小鼠有所减轻。GSPB2治疗2周后糖尿病小鼠的体重开始降低(p<0.05),但仍高于CC组(p<0.05)。2.GSPB2对小鼠FBG、TG、TC、AGEs、24h尿白蛋白定量的影响:实验结束时,DM组小鼠FBG、TG、TC、AGEs水平及24h尿白蛋白排泄量显著高于CC组小鼠,GSPB2治疗后显著降低db/db小鼠的TG、TC、AGEs水平及24h尿白蛋白排泄量(p<0.05),但是对FBG无明显影响(p>0.05)。3.GSPB2干预对db/db小鼠的肾脏病理形态的影响:与正常小鼠肾脏组织相比,DM组小鼠肾小球体积明显增大,系膜区显著增宽,系膜细胞增生,系膜基质聚集,肾小球基底膜呈弥漫性增厚;GSPB2治疗后,肾小球肥大、系膜区增宽及肾小球基底膜增厚程度均改善。4.小鼠肾脏iTRAQ蛋白质组学分析结果:mimeCan表达水平在DM组明显下降,经GSPB2治疗后,表达量较DM组小鼠明显上升。5.免疫印迹法检测小鼠肾脏组织中mimecan蛋白表达的结果:与正常对照组小鼠比较,mimecan在DM组表达明显下降(p<0.05),应用GSPB2治疗后,mimecan的表达上升(p<0.05),该结果与iTRAQ鉴定结果一致。6.GSPB2对db/db小鼠肾脏NF-κBp65蛋白表达的影响:提取各实验小组小鼠的肾脏组织,并对细胞核蛋白进行western blot检测,发现与正常组小鼠相比,DM组db/db小鼠肾脏NF-κBp65的蛋白表达明显上调,两组之间有明显差异(p<0.05)。GSPB2治疗后,肾组织NF-κBp65蛋白表达下调(pp<0.05),但未恢复到正常水平(p<0.05)。7.免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察到糖尿病肾病小鼠肾脏组织中促纤维化因子TGF-β、COLI、α-SMA及炎症因子IL-6、TNF-α的表达升高,GSPB2治疗后表达回调。结论1.GSPB2治疗10周可明显改善db/db小鼠的一般状态,减轻db/db小鼠的体重,降低db/db小鼠的血清甘油三酯、胆固醇水平,改善脂质代谢紊乱。GSPB2显著降低db/db小鼠的血清AGEs水平,减少24h尿白蛋白量,减轻糖尿病所致的肾脏损害,并改善db/db小鼠的肾功能。从微观角度来看,GSPB2能抑制糖尿病小鼠肾小球病态肥大、减缓基底膜异常增厚和系膜区过度扩张,改善糖尿病所致的肾组织病理损害,且效果均十分显著。2.iTRAQ蛋白质组学技术鉴定出的小鼠肾脏表达的差异蛋白经定量分析,发现,mimecan表达水平在DM组明显下降,经GSPB2治疗后,表达量较DM组小鼠明显上升。经免疫印迹法验证小鼠肾脏组织中mimecan蛋白表达的情况与蛋白质组学分析结果一致。并且通过免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察到糖尿病肾病小鼠肾脏组织中促纤维化因子TGF-β、COLI及α-SMA的表达升高,GSPB2治疗后表达回调,提示GSPB2的抗纤维化作用。3.Mimecan可能通过调控NF-κB的信号通路参与DN的发生发展。GSPB2可能通过抑制db/db小鼠肾脏NF-κBp65的蛋白表达来改善糖尿病小鼠肾脏的纤维化及炎症状态。4.免疫组化法、RT-PCR法及western blot法证实糖尿病肾病小鼠肾脏组织中炎症因子IL-6、TNF-α的表达升高,GSPB2治疗后表达回调,再次验证GSPB2的抗炎症作用。意义本研究采用国内外公认的C57BLKs/Jdb/db鼠作为2型DN的动物模型。研究发现,GSPB2能明显减轻体重,降低血脂,减轻尿白蛋白排泄,减少体内AGEs的含量,明显改善糖尿病肾脏病的病理损害,提示GSPB2具有保护糖尿病小鼠肾功能的作用,其机制可能与GSPB2提高糖尿病小鼠体内抗氧化能力,降低机体氧化水平有关。我们课题组采用iTRAQ蛋白质组学技术鉴定出的糖尿病肾脏差异蛋白质中,发现mimecan蛋白在db/db小鼠肾脏中表达水平明显降低;GSPB2治疗10周后,mimecan蛋白的表达水平明显增加。本研究用western blot的方法检验了各实验组小鼠的肾脏中mimecan蛋白的表达特点,与iTRAQ结果一致。本研究中蛋白质组学、免疫组化、RT-PCR及western blot分析结果均提示在DN小鼠中,降低的mimecan蛋白加重了肾功能的恶化,并引起小鼠的肾小球体积增大,系膜细胞增多伴系膜基质增生,肾小球基底膜弥漫增厚,提示糖尿病时降低的mimecan蛋白对I型胶原的降解下降,加重了肾脏的纤维化状态。GSPB2治疗后,回调的mimecan蛋白可增加对I型胶原的降解,减轻肾小球基底膜的增厚,减轻肾小球体积的增大,同时减低纤维化因子的表达,起到保护肾脏的作用,与我们的病理结果一致。许多研究已经证实炎症在DN的发病机制中起着关键的作用,然而,NF-κB与DN之间的关系,以及经GSPB2治疗的糖尿病小鼠肾脏中NF-κB的水平至今尚未见报道。我们的研究提示,在db/db小鼠的肾脏细胞核中,NF-κB p65的水平升高,提示核因子NF-κB是被激活的,并且激活的NF-κB进入细胞核内参与了高糖诱导的小鼠肾脏纤维化,同时检测到糖尿病肾病时炎症因子IL-6、TNF-α的表达是升高的。经过GSPB2治疗后,NF-κB p65、IL-6、TNF-α的水平下降,
关键词: 葡萄籽原花青素B2 ；mimecan ；核因子-kappaB ；db/db小鼠 ；糖尿病肾病肾脏纤维化 ；miRNA-204 ；Bcl-2 ；糖尿病肾病 ；足细胞
被引量
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摘要： 骨折延迟愈合或骨折不愈合一直是骨科医生面临的严重困扰之一。闭合性胫骨干骨折及股骨干骨折不愈合的发生率,在应用了髓内钉等治疗技术后,约为4.6-8%。在开放性骨折中,其发生率更高。肥胖是明确的影响骨折愈合率的独立危险因素。在全美人群中,肥胖的患者已达到了 34%,且这数字还在未来数十年中,还在不断攀升。因此,由肥胖引起的骨折延迟愈合问题,正在成为影响患者生活质量的严重因素,会给社会和经济带来了严重的不良影响。尽管如此,肥胖影响骨折愈合的具体机制,目前尚未明确,亟待进一步的研究,为开发新的治疗途径和方法奠定基础。研究表明,在骨折愈合过程中,骨痂中形成的大量脂肪沉积,是肥胖影响骨折愈合的可能机制之一。而葡萄籽原花青素提取物因其在多种肿瘤、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、尿路结石及肥胖等多种疾病的防治过程中的重要作用,一直是研究的热点之一。在本次研究中,我们发现葡萄籽原花青素提取物可以通过调节PPARy的表达,抑制3T3-L1细胞的成脂肪分化。且发现了具体机制是通过microRNA-483-5p的调控,从而抑制PPARγ的表达。我们的动物实验也表明,在对小鼠喂食高脂饮食后,与低脂饮食对照组相比,其骨折术后的X-ray,microCT及生物力学实验,均显示高脂饮食组小鼠的胫骨干骨折愈合能力明显下降,骨折延迟愈合。组织学研究也发现,在高脂饮食组小鼠的骨痂中,有大量的脂肪细胞形成。但在同时喂食高脂饮食及葡萄籽原花青素提取物的实验组中,X-ray,microCT及生物力学实验均显示其骨折愈合能力,均显著优于高脂饮食组;且与低脂饮食对照组相比,无显著性差异。组织学研究也显示,其骨痂中的脂肪沉积明显减少。综上所述,本研究的结果表明,葡萄籽原花青素提取物通过调控microRNA的表达,进而调控PPARγ的表达,抑制骨痂形成中的成脂肪分化,可明显降低肥胖对骨折愈合的不良影响,具有显著地治疗肥胖引起的骨折延迟愈合的作用。
关键词: 葡萄籽原花青素提取物 ；肥胖 ；骨折延迟愈合 ；microRNA ；PPARγ
被引量
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摘要： 本研究出发点和目的：针对该课题的研究方向，我们将着眼于介导VEC增殖和凋亡的两条关键信号通路的共同调控作用，寻找它们之间可能存在的关联，以及可能平衡这两条信号通路的共调控关键位点。尽管现在有许多研究证明VEGFR2与TNFR1介导的细胞内信号转导对VEC的增殖和凋亡具有重要的调控作用，然而这两条主要信号通路介导产生的生物信息传递是如何从生理应激状态下的动态平衡转化成病理生理状态下的失平衡，最终导致VEC功能障碍和凋亡的具体机制目前尚未明了。我们从许多血管受累性疾病的发病机制当中看到了它们发病机制中一个重要交汇点。我们希望以糖尿病和深静脉血栓形成等临床常见病作为切入点，探讨VEGFR2与TNFR1介导信号通路共调控VEC增殖与凋亡的作用机制。本课题设计旨在通过体外和体内实验，包括体外培养细胞、构建糖尿病和DVT动物模型来观察研究VEC的病理生理改变，探索其内在的机制，深入分析导致VEGFR2与TNFR1介导的细胞增殖和凋亡信号通路调控失平衡的可能因素。同时希望通过具有抗氧化应激、抗炎作用的原花青素及其低聚物调控VEGFR和TNFR的失平衡来保护VEC。
本课题研究内容包括如下三部分：第一部分，高浓度葡萄糖损伤人脐静脉内皮细胞的机制研究;第二部分，结扎糖尿病大鼠肾下段下腔静脉诱导深静脉血栓形成与血管内皮细胞损伤的作用及其机制研究;第三部分，原花青素及其低聚物治疗糖尿病大鼠合并深静脉血栓形成的初步研究。
第一部分高浓度葡萄糖损伤人脐静脉内皮细胞的机制研究
[目的]探索高浓度葡萄糖损伤VEC的高糖时间和浓度效应，阐述VEGFR和TNFR共调控失衡是糖尿病血管并发症和内皮细胞损伤的重要因素，高糖对VEGFR通路和TNFR通路的调控影响内皮细胞增殖和凋亡的作用。
[材料与方法]以原代培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，分别用不同浓度的葡萄糖加入培养基中(5mmol/L，15mmol/L，30mmol/L，60mmol/L)，应用Griess化学发光法检测一氧化氮(NO);RT-PCR检测内皮性一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达;分子探针检测ROS;western blot检测蛋白eNOS，iNOS，VEGF，TNF-α，VEGFR2，p-AKT，RIP，TRADD，TRAF-2，FAP-1，PTEN和NF-κB;免疫荧光检测NF-κB核内转移介导细胞凋亡;MTT法检测内皮细胞的活性试验;Annexin-v-FITC/PI双标记流式细胞仪检测细胞凋亡。
[结果]高糖早期(24h)即升高HUVEC的NO、eNOS、VEGF、VEGFR2、TNF-α、ROS等表达。HUVEC在48h内无明显的细胞活性下降和细胞凋亡发生。然而随着高糖的持续刺激，ROS的产生在72小时升高达到峰值，同时细胞内表达iNOS，PTEN，RIP，TRADD，TRAF-2和NF-κB上调，而与抗细胞凋亡信号相关的因子NO、eNOS、p-AKT的表达明显下调，MTT试验和流式细胞仪结果提示，在72-96h，高糖组的HUVEC开始出现明显的细胞活性下降和细胞凋亡增加。
[结论]高糖早期没有引起HUVEC的凋亡和活性下降，然而随着高糖时间的持续，氧化应激产生的氧自由基和细胞毒性物质的积累，使VEGFR2介导的细胞增殖与TNFR1介导的细胞增殖和凋亡信号的平衡失调，最终导致HUVEC的功能障碍和细胞凋亡。
第二部分结扎糖尿病大鼠肾下段下腔静脉诱导深静脉血栓形成与血管内皮细胞损伤的作用及其机制研究
[目的]探讨糖尿病(DM)合并深静脉血栓形成(DVT)对血管内皮细胞的损伤作用，观察糖尿病合并静脉血栓形成过程中VEC的VEGFR和TNFR共调控通路的失平衡，细胞因子和细胞粘附分子表达异常，以及可能加剧内皮损伤的因素。
[材料与方法]以Spraque-Dawley大鼠为研究对象，用STZ诱导建立糖尿病大鼠模型。正常饮食一个月后，按随机原则分成5组(A：空白对照;B：下腔静脉结扎(IVC-ligated);C：IVC-ligated+/低分子量肝素(LMWH);D：DM+/IVC-ligated;E：DM+/IVC-ligated+/LMWH)，B～E组大鼠均予以肾下段IVC结扎建立DVT模型。通过测量血栓大小，在电镜下观察内皮细胞形态学变化，应用免疫组化、免疫荧光、western blot，ELISA检测VEGFR2、TNFR1、CD34、vWF、IL-6、TNF-α和ICAM-1的表达。
[结果]结扎肾下IVC可导致糖尿病大鼠快速形成深静脉血栓，我们观察到血栓形成早期即可有静脉内皮细胞的脱落和坏死。同时伴随着静脉内皮细胞的VEGFR2，CD34表达下调，TNFR1，vWF表达上调;血清细胞因子IL-6和TNF-α释放增加;血栓的ICAM-1表达上调。
[结论]持续高糖损害内皮细胞，内皮功能障碍可能是合并静脉血栓形成和血栓性炎症反应的主要原因之一，血栓形成又进一步加剧血管损伤。
第三部分原花青素及其低聚物治疗糖尿病大鼠合并深静脉血栓形成的初步研究
[目的]应用原花青素及其低聚物治疗糖尿病大鼠合并深静脉血栓形成。探索原花青素及其低聚物的抗血栓形成作用。
[材料与方法]以第二部分的动物模型构建和分组为基础，添加葡萄籽原花青素提取物(GSPE)400mg/Kg/d灌胃治疗组。通过测量血栓大小，在电镜下观察内皮细胞形态学变化，应用免疫组化、免疫荧光、western blot，ELISA检测VEGFR2、CD34、vWF、ADAMTS13、IL-6、TNF-α、P-选择素、VCAM-1和ICAM-1的表达。
[结果]GSPE减少血栓形成，保护内皮细胞结构的完整性，上调内皮细胞的VEGFR2、CD34、ADAMTS13表达，下调vWF、IL-6、TNF-α、P-选择素、VCAM-1和ICAM-1的表达。
[结论] GSPE具有抗血栓形成的作用。其作用机制可能在于保护内皮细胞，减少血小板激活和凝集，减少白细胞粘附损害静脉内皮细胞，对抗促血栓性炎症介质产生释放。结果提示GSPE的抗血栓形成作用，可能对维持内皮细胞增殖和凋亡信号通路的平衡有重要的调控作用。
关键词: 血管内皮细胞 ；血管内皮生长因子受体 ；肿瘤坏死因子受体 ；细胞增殖 ；细胞凋亡 ；糖尿病 ；深静脉血栓形成 ；原花青素
被引量
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摘要： 目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病的常见并发症，是引起终末期慢性肾功能衰竭（chronic kidney disease, CKD）的主要原因之一。肾小管间质纤维化和肾小管萎缩是糖尿病CKD进展过程中的重要病理变化，而肾小管上皮细胞的表型转化和凋亡与糖尿病肾脏肾小管间质纤维化和肾小管萎缩密切相关。 大量研究已证实，在糖尿病时，肾脏存在大量活性氧簇（reactiveoxygen species, ROS）的蓄积，破坏了肾脏组织内氧化还原动态平衡，造成肾组织的氧化应激状态，参与肾损伤的发生与发展。在哺乳动物细胞内存在多种抗氧化系统来清除ROS，修复氧化的分子及其他氧化损伤。其中，硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）系统在对抗细胞的氧化应激上起着重要作用。硫氧还蛋白系统包括TRX、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductase, TrxR）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，是一个有效的蛋白还原系统。TRX是细胞内最重要的二硫键还原酶，维持细胞内蛋白质的还原状态及细胞正常功能的发挥。 硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interaction protein，TXNIP）或硫氧还蛋白结合蛋白-2（thioredoxin binding protein-2，TBP-2），又称维生素D3上调蛋白1（vitamin D3-upregulated protein1，VDUP-1）最初发现于1,25-（OH）2-维生素D3治疗过的HL-60白血病细胞。现已证实，TXNIP是TRX的一种内源性抑制蛋白，TXNIP能通过与TRX活性位点结合而抑制后者的活性。因此，通过调节TXNIP的表达，就能够间接调节TRX的活性，从而达到调控细胞内氧化应激状态的目的。 前期的研究显示，TXNIP在糖尿病患者、糖尿病动物以及体外高糖培养的肾小管细胞表达明显升高。也有研究表明，敲低TXNIP的表达能够抑制糖尿病小鼠心肌细胞的凋亡。神经酰胺能够通过上调细胞TXNIP的表达，进一步激活ASK1, p38MAPK以及JNK信号通路，促进白血病细胞的凋亡。TXNIP能够介导葡萄糖对胰岛β细胞的凋亡作用，TXNIP低表达能够抑制糖尿病状态下胰岛β细胞的凋亡，保持胰岛β细胞的功能。本课题组的前期研究也提示：高糖能够诱导TXNIP蛋白和mRNA在体外培养的小鼠系膜细胞中表达明显升高，并且p38MAPK信号通路参与了此过程；高糖能够明显增加系膜细胞ROS的产生，降低TRX活性；敲低TXNIP表达能够增加高糖条件下细胞TRX活性、减少细胞内ROS含量，同时抑制p38MAPK信号激活以及TGF-1和fibronectin的分泌。以上研究提示：TXNIP可能在DN发病过程中发挥一定作用。 目前，有关TXNIP在糖尿病肾损伤中作用的研究较少见。因此，本课题拟在我们原有工作基础上进一步观察TXNIP在糖尿病肾小管损伤中的作用，探讨其在糖尿病肾病发生、发展中的作用机制以及TXNIP能否作为糖尿病肾病的治疗靶点。我们的研究结果有望进一步阐明糖尿病肾病的发病机制以及寻找糖尿病肾病治疗的新靶点和开发具有潜在治疗作用的靶向药物提供科学依据。 方法： 1糖尿病肾病患者肾组织TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2及Bax蛋白检测 收集2011年10月2012年10月在河北医科大学第三医院经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为糖尿病肾病患者25例（diabeticnephropathy group），既往无其它肾脏病史，以10例肾肿瘤患者远离肿瘤的瘤旁组织做为对照组（control group）。留取血和尿标本检测血糖（Glu）、糖化血红蛋白（HbA1）、24小时尿蛋白定量（UPE）、肌酐（Scr）、估算肾小球滤过率（eGFR）；采用免疫组织化学检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2及Bax蛋白表达；TUNEL染色检测细胞凋亡；ELISA检测人尿8-OHdG含量。 2TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2和Bax在2型糖尿病db/db小鼠肾组织中的表达及葡萄籽原花青素对db/db小鼠肾脏上述指标表达的影响 6～8周龄雄性db/db小鼠随机分为2组：糖尿病组（db/db group, db/db）、糖尿病+葡萄籽原花青素组（diabetic+grape seed proanthocyanidin extractgroup, db/db+GSPE），相同周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组（db/m）及原花青素灌胃治疗组（db/m+grape seed proanthocyanidin extract, db/m+GSPE）。db/db+GSPE和db/m+GSPE组以葡萄籽原花青素（5mg/kg）灌胃，每天灌胃一次。正常对照组和糖尿病组以等体积生理盐水灌胃，自实验开始持续12周。实验期间每2周一次检测血糖水平。分别于动物周龄的8、12、16、20周每组取6只小鼠，收集血液及24小时尿液，用于生化指标检测，于动物周龄的20周处死动物，切取肾脏4%中性甲醛固定用于组织化学、TUNEL及免疫组织化学染色；部分肾皮质组织用于提取蛋白及RNA，Western blot检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2、Bax、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达，Real-time PCR检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2及Bax mRNA表达，ELISA检测小鼠尿8-OhdG水平。 3敲低TXNIP对高糖诱导的HK-2细胞凋亡及转分化的影响 VDUP-1shRNA Plasmid（h）干扰质粒，使用Lipofectamine2000转染试剂将VDUP-1shRNA Plasmid（h）干扰质粒和对照质粒分别转染人肾小管上皮HK-2细胞，经嘌呤霉素筛选浓度（4μg/mL）筛选稳定的细胞系。HK-2细胞及筛选的敲低TXNIP稳定细胞系在5%CO2，37°C CO2培养箱中，以含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养液培养细胞使其增殖，将实验细胞分组：正常糖对照组（5.5mmol/L glucose, NG）、正常糖+高渗对照组（5.5mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol, M）、高糖组（30mmol/Lglucose，HG）、高糖+NAC组（30mmol/L glucose+N-Acety-L-Gysteine，HG+NAC），高糖+阴性质粒组（30mmol/L glucose+control shRNA plasmid，HG+C），高糖+VDUP-1shRNA质粒组（30mmol/L glucose+VDUP1shRNAplasmid，HG+shRNA），高糖+TGF-β1组（30mmol/L glucose+4ng/mLTGF-β1， HG+T），高糖+SB203580组（30mmol/L glucose+10μMSB203580，HG+SB），高糖+PD98059（30mmol/L glucose+50μM PD98059，HG+PD）。分别经细胞同步化、分组干预刺激0、6、12、24、48、72小时后收集细胞；Western blot检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达；Real-time PCR检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、Bcl-2及Bax mRNA表达；TUNEL和AnnexinⅤ/PI染色检测HK-2细胞凋亡率；流式细胞仪检测ROS；硫氧还蛋白二硫键还原酶活性分析法检测TRX活性。 结果： 1糖尿病肾病患者临床病理表现及相关蛋白检测 ①光镜下观察，对照组肾小球、肾小管及肾间质未见明显异常；糖尿病肾病组肾小球体积增大，基底膜弥漫或不规则增厚，细胞外基质增多，K-W结节形成，部分肾小管上皮细胞出现空泡变性，间质纤维化。②糖尿病肾病组空腹血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白量、尿8-OHdG及肌酐较对照组均明显增多，而肾小球滤过率糖尿病肾病组患者比对照组下降（P<0.05）。③免疫组化显示TXNIP、α-SMA及Bax主要在肾小管表达，糖尿病肾病组较对照组表达增多（P<0.05），E-cadherin、Bcl-2较对照组表达减少（P<0.05）。④TUNEL染色显示在DN组织中观察到凋亡细胞增加，高于对照组（P<0.05）。 2糖尿病db/db小鼠肾组织相关蛋白的表达及葡萄籽原花青素对相关蛋白的影响 ①光镜下观察，糖尿病组小鼠轻微肾小球体积增大，系膜基质增多，基底膜不规则增厚，肾小管上皮细胞出现空泡变性。②与对照组相比，糖尿病组小鼠尿蛋白（Upro）明显升高；糖尿病db/db小鼠空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）、尿8-OHdG、肌酐（Scr）及甘油三酯（TG）比对照组db/m小鼠增加（P<0.05）。给予葡萄籽原花青素治疗后血糖、尿素氮、尿8-OHdG、肌酐、甘油三酯（TG）及尿蛋白与db/db组比较含量明显降低（P<0.05）。③TXNIP、α-SMA、p-p38、p-ERK1/2、Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表达，与对照组比较，在糖尿病组表达明显增加（P<0.05），与db/db组比较，db/db+GSPE组降低，但仍高于对照组（P<0.05）；E-cadherin、Bcl-2在对照组大量表达，在db/db组表达明显减少，给予GSPE后表达升高（P<0.05）。④TUNEL染色显示在db/db组小鼠肾组织中观察到凋亡细胞增加，db/db+GSPE组降低，但仍高于对照组（P<0.05）。 3敲低TXNIP对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响 ①TUNEL和流式细胞术凋亡检测结果显示，与NG组相比，HG组HK-2细胞的凋亡率明显增高（P<0.05），敲低TXNIP及NAC组，高糖诱导的HK-2细胞凋亡比例显著低于HG组（P<0.05）。②与对照组相比，HG组Bax/Bcl-2蛋白和mRNA比值、Cleaved Caspase-3、p-p38蛋白明显升高（P<0.05），NAC及VDUP-1shRNA质粒组能够下调Bax/Bcl-2蛋白和mRNA比值、Cleaved Caspase-3、p-p38蛋白表达，从而抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡。③与对照组相比，HG组ROS水平明显提高，TRX活性抑制（P<0.05）；与HG组相比，NAC及VDUP-1shRNA质粒组能够降低高糖诱导的TRX活性抑制，能够下调高糖诱导的ROS产生（P<0.05），甘露醇及阴性质粒无影响。 4敲低TXNIP对高糖诱导的HK-2细胞转分化的影响 ①与对照组相比，HG组HK-2细胞中TXNIP、α-SMA表达增高，E-cadherin表达减少，ROS水平明显提高（P<0.05）。②与HG组相比，敲低TXNIP及NAC，能够下调TXNIP、α-SMA表达，增加E-cadherin表达，能够抑制高糖诱导的p38蛋白和ERK1/2活化，能够降低高糖诱导的TRX活性抑制，下调高糖诱导的ROS产生（P<0.05）。③HK-2细胞上清TGF-β1浓度明显高于正常对照组，高糖组TGF-β1mRNA明显高于对照组（P<0.05），VDUP-1shRNA组及NAC组HK-2细胞分泌TGF-β1及TGF-β1mRNA明显低于HG组（P<0.05）。④TGF-β1刺激HK-2细胞后，TXNIP蛋白及mRNA表达明显高于正常对照组，ROS明显高于对照组，VDUP-1shRNA组及NAC组HK-2细胞TXNIP、ROS的生成明显低于TGF-β1组（P<0.05）。⑤与NG相比，TGF-β1组E-cadherin表达显著降低，α-SMA表达显著增加，敲低TXNIP与NAC能够降低TGF-β1诱导的α-SMA表达及增加E-cadherin表达（P<0.
关键词: 糖尿病肾病 ；db/db小鼠 ；肾小管上皮细胞损伤 ；活性氧簇 ；硫氧还蛋白相互作用蛋白 ；葡萄籽原花青素
被引量
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摘要： 目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病所致的全身微血管病变的肾脏表现,主要以肾小球系膜细胞增生及细胞外基质沉积,肾小管上皮细胞凋亡及转分化,肾小球硬化和间质纤维化为主要病理特征。DN的发病机制非常复杂,一直是国内外肾脏病学领域研究的重点。过去十年的研究发现,肾脏固有细胞的脂质代谢紊乱是糖尿病肾损伤发生的重要病理生理基础。高糖状态下脂质成分在肾细胞内异常沉积,可造成肾细胞的慢性功能紊乱和细胞损伤。用基因学或药学方法干预糖尿病动物模型体内脂质生成基因的表达,如固醇调节因子结合蛋白（sterol regulatory element binding protein,SREBPs）及过氧化物酶增殖活化受体（Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR）,可改善糖尿病引起的肾脏损伤,说明脂质代谢紊乱在DN发病过程中发挥了关键作用。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interaction protein,TXNIP）或硫氧还蛋白结合蛋白-2（thioredoxin binding protein-2,TBP-2）,又称维生素D3上调蛋白1（vitamin D3-upregulated protein 1,VDUP-1）是一种内在的硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）调节蛋白,其可与Trx结合而抑制其功能,从而诱导细胞发生过氧化反应。多项研究提示TXNIP参与了糖尿病肾病的发生,高糖能够显著上调肾脏细胞TXNIP蛋白和mRNA的表达。新近有研究显示,TXNIP在肝脏脂代谢紊乱导致的脂肪肝方面发挥了调节作用。在1型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中,伴随肝脏脂质沉积,TXNIP的表达明显增高,中药槲皮素和别嘌呤醇通过抑制肝脏TXNIP的表达减轻了肝脏的脂质沉积。TXNIP基因敲除小鼠通过抑制PRMT1-PGC-1?信号途径的激活改善了高脂饮食所致的脂肪肝。但TXNIP在糖尿病导致的肾脏脂质沉积中是否也具有调节作用还未见报道。本研究应用1型和2型两种不同的糖尿病小鼠模型和体外培养的肾小管上皮细胞HK-2,从整体、细胞和分子等不同水平,系统全面地观察了TXNIP在糖尿病肾脏脂质沉积中的作用及调节机制,并观察了天然抗氧化剂花青素对高糖条件下肾小管上皮细胞txnip的表达及脂质沉积的影响,为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制及其防治提供理论依据。方法:1糖尿病肾病患者肾组织txnip、srebp-1和ppar?的表达及脂质沉积收集2010年10月2014年10月在保定市第一中心医院肾内科住院,经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为糖尿病肾病患者20例（diabeticnephropathygroup）,既往无其它肾脏病史,以10例肾脏肿瘤患者切除的肾脏远端瘤旁组织做为对照组（controlgroup）。留取血和尿标本检测血糖（glu）、糖化血红蛋白（hba1c）、血胆固醇（tc）、血甘油三酯（tg）、24小时尿蛋白定量（upe）、肌酐（scr）、估算肾小球滤过率（egfr）等。采用油红o染色检测细胞内脂滴形成;免疫组织化学检测txnip、srebp-1及ppar?蛋白表达。2txnip基因敲除对stz诱导的糖尿病小鼠肾组织脂质沉积的影响6～8周龄c57bl/6j背景的野生型小鼠（wildtype）及txnip基因敲除鼠（txnip?/?）为动物模型。将实验动物随机分为4组,野生型c57bl/6j小鼠组（wt）、糖尿病组（wt+stz）、txnip基因敲除组（tko）和txnip基因敲除+糖尿病组（tko+stz）。每组10只,wt+stz和tko+stz组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,stz,溶于0.1mol/l枸橼酸盐缓冲液中,ph值4.5,50mg/kg/day）,连续注射5天;对照组注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,5天后血糖仪测定空腹血糖,血糖≥11.1mmol/l且尿糖阳性者（+++++++）确定为dm模型。实验期间动物自由进食和饮水,每周测一次血糖。dm小鼠成模20周后处死小鼠,收集血尿标本,用于生化指标检测,切取部分肾组织分别置于4%多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定,用于光镜、免疫组织化学和电镜检测;部分肾皮质组织用于提取蛋白及rna,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1、cpt1、p-akt、akt、p-mtor和mtor蛋白表达,real-timepcr检测srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1表达,油红o染色检测小鼠肾组织脂滴形成情况。3敲低txnip对高糖诱导的肾小管细胞hk-2脂质沉积的影响人肾小管上皮细胞hk-2在37°c,5%co2条件下,以含10%胎牛血清的dmem-f12培养基培养。⑴检测高糖对hk-2细胞txnip表达和脂滴形成的影响:细胞分为正常糖对照组（5.5mmol/lglucose,ng）及高糖组（30mmol/lglucose,hg）,刺激细胞,孵育0、6、12、24、48、72h后收集细胞,westernblot及real-timepcr检测细胞txnip的表达,油红o染色检测细胞脂滴形成。⑵检测txnip对高糖诱导的hk-2细胞脂质沉积的影响:使用fugene?hd转染试剂将txnipshrnaplasmid（t）干扰质粒和空白质粒（v）分别转染人肾小管上皮hk-2细胞,经嘌呤霉素筛选浓度（4μg/ml）筛选稳定的细胞系。细胞随机分为正常糖对照组（5.5mmol/lglucose,ng）、高渗对照组（5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m）、高糖组（30mmol/lglucose,hg）、高糖+空白质粒组（30mmol/lglucose+vector,hg+v）、高糖+txnipshrna质粒组（30mmol/lglucose+txnipshrna,hg+t）。细胞分组刺激48h后,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1、cpt1、p-akt、akt、p-mtor和mtor蛋白表达;real-timepcr检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1mrna表达;流式细胞仪检测细胞ros的变化;油红o染色检测细胞脂滴形成;试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。⑶检测pi3k/akt/mtor信号通路在高糖诱导的hk-2细胞脂质沉积中的意义:细胞随机分为正常糖对照组（5.5mmol/lglucose,ng）、正常糖+ly294002组（5.5mmol/lglucose+10μmol/lly294002,ng+ly）、高渗对照组（5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m）、高糖组（30mmol/lglucose,hg）、高糖+ly294002组（30mmol/lglucose+10μmol/lly294002,hg+ly）。检测方法及指标同上。4天然抗氧化剂花青素对高糖诱导的肾小管上皮细胞txnip的表达及脂质沉积的影响①动物实验:16只雄性db/db小鼠随机抽取8只做为糖尿病肾病模型组（db/dbgroup,db/db）、余下8只为葡萄籽原花青素治疗组（grapeseedproanthocyanidinextracttreatmentgroup,db/db+gspe）;16只db/m小鼠随机抽取8只作为正常对照组（db/m）,余下8只为葡萄籽原花青素治疗对照组（grapeseedproanthocyanidinextracttreatmentcontrolgroup,db/m+gspe）。db/db+gspe组和db/m+gspe组给予5mg/kg/day葡萄籽原花青素灌胃,持续8周,对照组和模型组给予相同体积生理盐水。实验期间动物自由进食和饮水,每2周测一次血糖及体重。小鼠15周龄时处死小鼠,收集血尿标本,用于生化指标检测,切取部分肾组织分别置于4%多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定,用于光镜、免疫组织化学和电镜检测;部分肾皮质组织用于提取蛋白及rna,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1蛋白表达,real-timepcr检测srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1表达,油红o染色检测小鼠肾组织脂滴形成情况。②细胞实验:人肾小管上皮细胞hk-2在37°c,5%co2条件下,以含10%胎牛血清的dmem-f12培养基培养。⑴检测花青素对hk-2细胞细胞活力及ros产生的影响:细胞用含10、20、50、100μm的c3g或cy刺激物的培养基培养细胞48h,mtt法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞ros的变化。⑵检测花青素对高糖诱导的hk-2细胞txnip表达及脂质沉积的影响:细胞随机分为正常糖对照组（5.5mmol/lglucose,ng）、高渗对照组（5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m）、高糖组（30mmol/lglucose,hg）、高糖+c3g组（30mmol/lglucose+c3g,hg+c3g）、高糖+cy组（30mmol/lglucose+cy,hg+cy）。细胞分组刺激48h后,westernblot检测txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1蛋白表达;real-timepcr检测srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1mrna表达;流式细胞仪检测细胞ros的变化;油红o染色检测细胞脂滴形成。结果:1糖尿病肾病患者临床病理表现及相关蛋白检测①光镜下观察:对照组肾小球毛细血管袢开放良好,肾小管及间质未见明显异常;糖尿病肾病组肾小球体积增大,基底膜不规则增厚,系膜细胞及系膜基质增生,晚期肾小球硬化;肾小管基底膜增厚,部分小管萎缩,部分小管代偿性肥大,间质纤维化。②糖尿病肾病组患者空腹血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白量、肌酐较对照组均明显增多,而肾小球滤过率糖尿病肾病组患者比对照组下降（p<0.05或p<0.01）。③对照肾组织中未见明显脂质沉积,糖尿病肾病组肾小管上皮细胞内出现大量脂滴,呈红染颗粒状。④免疫组化显示,糖尿病肾病组txnip和srebp-1在肾小管上皮细胞胞浆中表达增多,ppar?在肾小球及肾小管上皮细胞胞浆表达减少,与对照组相比有显著性差异（p<0.01）。2txnip基因敲除对stz诱导的糖尿病小鼠肾组织脂质沉积的影响①光镜下观察,糖尿病小鼠肾小球体积略增大,系膜细胞增生伴系膜基质增多,基底膜不规则增厚,肾小管上皮细胞出现空泡变性;txnip基因敲除明显改善了糖尿病所致的肾脏形态学变化。②与wt小鼠相比,糖尿病小鼠bun、scr、tg及uae均显著升高;txnip基因敲除各项指标明显下降（p<0.05或p<0.01）。③电镜及油红o染色显示糖尿病小鼠近曲小管上皮细胞胞浆内呈现明显的脂滴沉积,肾组织内甘油三酯和胆固醇含量明显高于wt小鼠;txnip基因敲除的糖尿病小鼠小管细胞内脂滴数减少,甘油三酯及胆固醇含量降低（p<0.01）。④与wt小鼠比较,糖尿病小鼠肾组织内txnip、srebp-1、fasn、acc、p-akt及p-mtor表达明显增高,而ppar?、cpt1及acox1的表达减少;txnip基因敲除下调了txnip、srebp-1、fasn、acc、p-akt及p-mtor的表达,上调了ppar?、cpt1及acox1的表达,均有统计学意义（p<0.05或p<0.01）。3敲低txnip对高糖诱导的肾小管细胞hk-2脂质沉积的影响①与ng相比,hg组hk-2细胞中txnip表达明显增高,呈时间依赖性;txnipshrna质粒转染明显降低了hg诱导txnip蛋白的表达。油红o染色显示细胞内脂滴数明显增加,
关键词: 糖尿病肾病 ；硫氧还蛋白相互作用蛋白 ；db/db小鼠 ；基因敲除 ；脂质沉积 ；花青素
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