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摘要： 目的研究降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)在Caco-2细胞模型中的吸收机制。方法用体外培养的Caco-2细胞单层模型,考察时间、pH值、药物浓度、吸收抑制剂及促进剂对VLPVP吸收的影响。用HPLC法检测VLPVP的浓度。结果VLPVP在pH7.4时转运量最大,且与浓度和时间呈正相关。肽转运载体竞争性抑制剂Gly-Pro、arphamenine A和细胞内吞抑制剂氧化苯胂对VLPVP的转运没有显著的抑制作用,而旁路转运促进剂去氧胆酸钠、多药耐药蛋白抑制剂MK-571和能量抑制剂叠氮化钠对VLPVP从AP侧至BL侧的转运有非常显著的促进作用,而叠氮化钠和MK-571对VLPVP从BL侧至AP侧的转运无显著影响。结论VLPVP以旁路转运为主要方式被小肠上皮细胞吸收,并受到多药耐药蛋白MRP2强烈的外排作用。
关键词: 降血压肽 ；VaI-Leu-Pro-VaI-Pro ；Caco-2细胞 ；旁路转运 ；外排作用
被引量
12
摘要： Caco-2细胞模型为小肠内皮细胞转运模型,本实验构建Caco-2细胞模型并研究抗高血压肽Val-Pro-Pro(VPP)和Ile-Pro-Pro(IPP)的小肠吸收机制。从细胞形态、电阻值和荧光素钠透过率等方面验证了Caco-2细胞模型;通过转运时间、肽浓度、吸收抑制剂和促进剂比较了VPP和IPP的小肠转运途径及外排机制。结果表明:构建的Caco-2细胞模型可用于VPP和IPP的模拟小肠吸收机制研究;VPP和IPP的小肠转运途径是旁路转运,VPP和IPP都存在外排泵的作用,IPP外排作用没有VPP大,所以生物利用度高于VPP。
关键词: 抗高血压肽 ；Val-Pro-Pro ；Ile-Pro-Pro ；Caco-2细胞 ；转运
被引量
27
摘要： 2型糖尿病（T2DM）是一种代谢性疾病,其主要特点是高血糖,并伴随着胰岛素抵抗和其他一系列的代谢问题,并可导致常见的并发症疾病,如心血管疾病、肾功能衰竭和视网膜病变等。T2DM治疗最有效的策略是维持正常的血糖水平。大量研究表明,二肽激肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）是维持正常血糖水平过程中可调控的关键酶之一。通过阻止肠促胰素激素降解和抑制DPP-Ⅳ活性来帮助控制血糖,已被认为是控制T2DM的有效方法。尽管目前已有的降糖药物,作为DPP-Ⅳ活性的抑制剂（如双胍类和磺酰脲类）在一定程度上控制了血糖,但仍有相当一部分T2DM患者未达到目标血糖控制,同时这些药物可能导致腹泻、肝损伤和不同程度的耐药等负面影响。因此,寻找副作用小的天然活性物质来改善T2DM成为近年来的研究热点。鲣鱼（Katsuwonus pelamis）是一种全球可利用的海洋资源,是能够提供高蛋白、低脂肪和热量密集的一种食物。鲣鱼加工会产生许多副产品（约占总重的50-70%）。其中,红肉是其重要副产物之一（约占鱼肉的13%-16%）并富含优质蛋白。目前,已经从鲣鱼红肉中制备出抗氧化肽、降血压肽等活性肽。然而,目前尚未有利用鲣鱼红肉去制备降血糖肽的研究。该篇文章以鲣鱼红肉为原料,通过酶解的方法制备具有DPP-Ⅳ抑制活性的生物活性肽,然后对酶解液进行分离纯化,建立神经网络模型筛选高DPP-Ⅳ抑制活性的肽,然后通过细胞免疫印迹实验对其作用机制进行研究。最终的研究结果如下:
（1）确定了鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽的最佳酶解制备工艺。以单因素试验为基础,按照Box-Behnken试验设计原则,进行响应面实验,对鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽制备过程的酶添加量、酶解温度和酶解时间进行优化。最终结论如下:确定了中性蛋白酶为最适酶解鲣鱼红肉制备DPP-Ⅳ抑制肽的蛋白酶;其最适酶解条件为:酶添加量8160.27 U/g,酶解温度55.40℃,酶解p H 7,酶解时间5.35 h,理论水解度最大值32.57%、DPP-Ⅳ抑制率的理论最大值56.01%。对理论结果进行实验验证,实际水解度为32.19±0.39%,DPP-Ⅳ抑制率为56.00±1.14%,与响应面预测值吻合度较好。
（2）分离纯化鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽。利用膜分离技术对中性蛋白酶水解物（neutrase of protein hydrolysate,NPH）进行分离,超滤得到NPH-1（<1 KDa）,NPH-2（1～3 KDa）,NPH-3（3～10 KDa）和NPH-4（>10 KDa）四个组分。在上述所得到的四个组分当中,<1 KDa的NPH-1具有最高的DPP-Ⅳ抑制活性(65.12±7.94%,在浓度0.5 mg·m L-1时),说明其他大于1 KDa的组分含有DPP-Ⅳ抑制活性的生物活性肽含量相对来说比较低。因此,接下来通过葡聚糖凝胶G-15对NPH-1进行进一步的分离纯化,分离结果显示为四个组分,分别为T1,T2,T3和T4,其中表现出最高的DPP-Ⅳ抑制活性的是组分T2(81.18±1.76%,在浓度0.5 mg·m L-1时),表明分离纯化对提高该活性肽的的活性有一定的作用。
（3）鉴定、筛选和合成鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽。利用四极杆飞行时间质谱技术鉴定分析T2组分的多肽序列,通过神经网络建立DPP-Ⅳ抑制肽的筛选模型成功筛选出五种DPP-Ⅳ抑制肽,并通过固相合成法合成所筛选出的DPP-Ⅳ抑制肽。通过对T2组分进行序列鉴定,然后通过神经网络预测模型的建立,对具有DPP-Ⅳ抑制活性的三肽和四肽进行筛选,最终的结论如下:通过神经网络预测模型筛选出5条具有高DPP-Ⅳ抑制活性的多肽,分别是:Ala-Pro-Pro（APP）,Pro-Pro-Pro（PPP）,Asp-Pro-Leu-Leu（DPLL）,Glu-Ala-Val-Pro（EAVP）和Glu-Ala-Iie-Pro（EAIP）;成功合成了具有纯度98%以上的DPP-Ⅳ抑制肽。
（4）探讨APP、PPP、DPLL、EAVP和EAIP对IR-Hep G2细胞葡萄糖代谢的影响及作用机制。通过地塞米松诱导Hep G2细胞并以细胞对葡萄糖的消耗能力为指标成功建立胰岛素抵抗模型。实验结果表明,这五种多肽可能是通过激PI3K/AKT和AMPK信号通路缓解胰岛素抵抗产生的高血糖,通过这样的作用达到降血糖的目的。
关键词: 酶解 ；鲣鱼红肉 ；DPP-Ⅳ抑制肽 ；神经网络 ；信号通路
摘要： 本研究隶属于国家自然科学基金面上项目《基于Caco-2细胞模型的蛋清肽结构与完整吸收关系研究》（31271907）和《基于Caco-2细胞膜和大鼠外翻肠囊模型的蛋清源活性寡肽完整吸收途径及机制研究》（31771985）。食源性生物活性肽因其良好的生物活性及营养、无毒副作用而受到广泛关注,但是,受到小肠吸收与生物利用率的影响,通过体外方法鉴定的食源性生物活性肽并不一定具有体内生物活性。因为,不同于内源性生物活性肽,许多食源性生物活性肽如ACE抑制肽等要在体内发挥生物活性,需要在经口摄入以后克服胃肠道酶降解和小肠上皮吸收渗透屏障,以完整的形式被小肠上皮吸收进入体内,随血液循环到达作用靶点,并累积到一定的量。其中,胃肠道消化酶的降解和小肠上皮的吸收渗透是主要限制因素。目前,鉴定得到的食源性生物活性肽多为含3～10个氨基酸残基的寡肽,而寡肽的小肠上皮吸收特性和吸收机制尚不明确。本文从蛋清源寡肽入手,利用Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊模型,研究蛋清源寡肽的刷状缘膜酶降解与完整吸收特性,通过末端FITC修饰和氨基酸替换,研究末端氨基酸对寡肽完整吸收的影响,并进行系统的构效关系分析,明确寡肽的疏水性参数和分子量与完整吸收的相关关系,阐释寡肽完整吸收的可能机制。主要研究内容和结果如下:（1）利用Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊模型研究蛋清蛋白模拟胃肠道消化水解物混合肽对刷状缘膜酶的降解与完整吸收情况,利用Q Exactive质谱对蛋清源刷状缘膜酶降解肽和完整吸收肽进行结构鉴定,并对鉴定得到的肽序列进行统计分析。结果发现,外翻大鼠肠囊对蛋清肽的降解作用大于Caco-2细胞单层膜,但是,分别有56条和28条分子量低于1000 Da且主要来自于卵白蛋白和卵转铁蛋白的蛋清肽能够被Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊完整吸收,表明能被Caco-2细胞单层膜完整吸收的蛋清源寡肽数量要远大于外翻大鼠肠囊。另外,分析发现,有LGAKDSTRT、VNDLQGKTS、DGSRQPVDN、GKKDPVLKD共4条蛋清源寡肽能同时被Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊2种模型完整吸收。（2）利用模拟胃肠道消化体系和Caco-2细胞单层膜模型,研究蛋清源ACE抑制肽TNGIIR在胃肠道消化酶和刷状缘膜酶作用下的降解以及完整吸收情况。结果发现,分别有5.87%±1.92%和17.17%±0.64%的TNGIIR被模拟胃肠道消化酶和刷状缘膜酶降解。但是,TNGIIR仍能被Caco-2细胞单层膜完整吸收,其正向吸收和反向外排的Papp值分别为（4.92±0.40）×10-6 cm/s和（5.99±0.27）×10-6cm/s,且只有细胞松弛素D能够显著改变TNGIIR的吸收率,说明TNGIIR在Caco-2细胞单层膜的完整吸收机制可能为受紧密连接调控的细胞旁路途径。（3）测定了末端FITC修饰对RVPSL、RVPSP和VPP在Caco-2细胞单层膜完整吸收的影响。结果发现,FITC-RVPSL和RVPSLK-FITC的Papp值分别为（0.88±0.11）×10-6 cm/s和（1.43±0.15）×10-6 cm/s,FITC-RVPSP和RVPSPK-FITC的Papp值分别为（0.66±0.10）×10-6 cm/s和（2.37±0.01）×10-6 cm/s,而FITC-VPP和VPPK-FITC的Papp值分别为（4.68±0.08）×10-6 cm/s和（3.25±0.08）×10-6 cm/s,说明RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰后在Caco-2细胞单层膜的吸收率大于其N末端FITC修饰肽,而VPP的C末端FITC修饰后在Caco-2细胞单层膜的吸收率小于其N末端FITC修饰肽。RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰后对刷状缘膜酶的降解率小于其N末端FITC修饰肽,而VPP的C末端FITC修饰后对刷状缘膜酶的降解率却大于其N末端FITC修饰肽。渥曼青霉素能显著降低RVPSL和RVPSP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收,却对VPP的N末端和C末端FITC修饰肽均无显著影响,细胞松弛素D能显著增大RVPSL和RVPSP的N末端FITC修饰肽和VPP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收率,但对RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰肽无显著影响,说明RVPSL和RVPSP的N末端修饰肽可能是通过细胞旁路和胞吞作用两种途径被吸收,而C末端修饰肽则可能主要通过胞吞途径被吸收。但是,不同于RVPSL和RVPSP,VPP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收机制均为细胞旁路。另外,圆二色谱结果显示,寡肽的二级结构与其在Caco-2细胞单层膜的完整吸收无关。（4）利用氨基酸替换法人工设计了78条以Ala为基本骨架但具有不同N末端或C末端氨基酸残基的四肽和五肽,固相合成后,测定其在Caco-2细胞单层膜的完整吸收情况。结果发现,根据吸收率的大小,可以将78条寡肽分成良好吸收肽、中等吸收肽、低吸收肽和难吸收或不能吸收肽4个等级。其中,N末端为Leu、Pro、Ile、Cys、Met、Val和C末端为Val的四肽,以及N末端或C末端为Tyr的五肽,都具有非常高的吸收率,其Papp值均大于10×10-6 cm/s,N末端为Glu、Asn、Thr或C末端为Lys、Asp、Arg的四肽或五肽的吸收率也较高,其Papp值范围为1×10-6 cm/s10×10-6 cm/s。另外,N末端氨基酸残基替换后的四肽和五肽的吸收率普遍高于C末端氨基酸替换肽,说明N末端氨基酸残基对寡肽在Caco-2细胞膜的吸收的影响作用更大。（5）统计分析了40条具有不同N末端氨基酸残基寡肽的疏水性参数log D和分子量MW与表观渗透系数之间的关系。结果发现,除去吸收率为零的寡肽,依据log D和MW对寡肽吸收率的影响,可以将寡肽分成良好吸收肽、中等吸收肽和低吸收肽3个等级。其中,在良好吸收肽中,Papp值范围为5×10-6 cm/s40×10-6 cm/s,log Papp与log D呈正向线性关系,与log MW呈负向线性关系;在中等吸收肽中,Papp值范围为0.25×10-6 cm/s5×10-6 cm/s,log Papp与log D及log MW均呈负向线性关系;而在低吸收肽中,Papp值范围为0～0.25×10-6 cm/s,log Papp与log D及log MW均呈正向线性关系。另外,经过分析发现,寡肽在Caco-2细胞单层膜可能存在两种或三种吸收途径,其中一种为受紧密连接调控的细胞旁路途径,另一种或两种则为寡肽转运载体或者胞吞途径。
关键词: 蛋清 ；寡肽 ；吸收 ；构效关系 ；吸收机制
被引量
22
摘要： 灵芝作为我国传统名贵药食用真菌,是创新性天然药物的重要来源。现有的灵芝天然产物研究主要集中于多糖类和三萜类化合物,蛋白类化合物研究相关较少。寡肽是由2～10个氨基酸组成的小分子蛋白类化合物,具有组织透过性好、免疫原性弱等优点,开发潜力较大。本课题采用液态发酵培养灵芝菌丝体,从其中分离筛选获得血管紧张素转化酶抑制肽(Angiotensin converting enzyme inhibitory peptide,ACEIP),评估其体内降血压功效,并分析该活性寡肽的降血压分子机制,为进一步开发灵芝创新药物、保健食品提供理论依据,也可为其它来源的活性寡肽开发应用提供借鉴。1.灵芝发酵菌丝体ACEIP分离与结构鉴定利用液相质谱联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)从灵芝(Ganoderma lingzhi,G.lingzhi)发酵菌丝体中分离鉴定获得32个ACEIP,并利用现代层析技术从另一灵芝(Ganoderma lucidum,G.lucidum)品种中分离纯化获得 3 个寡肽,分别为 Gln-Leu-Val-Pro(QLVP)、Gln-Asp-Val-Leu(QDVL)和Gln-Leu-Asp-Leu(QLDL)。根据ACE抑制活性和得率,选择源自G.lingzhi的Ser-Tyr-Pro(SYP)、Glu-Gln-Val-Leu(EQVL)、Asp-Leu-Gln-Leu-Val-Pro(DLQLVP)、Pro-Leu-Glu-Leu-Val-Pro(PLELVP)、Gln-Arg-Val-Cys-Glu(QRVCE)、Ala-Phe-Gly-Ser-Asn-Ala-Leu-Pro-Val(AFGSNALPV)这 6 个活性较强(≥50%)的寡肽,进一步比较分析其与ACE结合自由能和ACE抑制活性IC50,发现SYP与ACE结合的自由能高达34.4 kcal/mol,并表现出很强的ACE抑制活性,其IC50为62.50±1.81μg/mL。因此,SYP可作为理想的降血压药物进行开发利用。2.寡肽SYP抑制ACE活性的机理分析与结构改性由双倒数作图法测定米氏常数可知,SYP属于非竞争性抑制模型。分子对接结果显示,SYP通过Serl氨基与ACE的Asp507形成盐键/离;通过Serl羟基与Lys511、Tyr2酚羟基与Gln281、Pro3羧羟基与Lys454形成3个氢键;通过Tyr2苯环、Pro3闭环与Phe457、Tyr520和Phe524产生疏水作用,结合位点中的Gln281、Lys511、Tyr520等氨基酸残基是ACE活性区域的S2 口袋,预示SYP通过与ACE结合,改变其构象,最终导致其失活。为验证分子对接结果,利用氨基乙酰化、羧基酰胺化、氨基酸替换等结构改性手段,单一或多重解除SYP与ACE形成的盐键、氢键及疏水作用,比较分析其改性前后的ACE抑制活性,并利用圆二色谱(Circular dichroism spectrum,CD)探究ACE构象的改变情况。研究发现,当SYP与ACE分子间相互作用被单一或多重解除时,其ACE抑制活性均被显著消弱,且影响活性的强弱顺序为:盐键>氢键>>疏水作用。此外,CD分析进一步发现,SYP与ACE结合后,ACE的α-螺旋结构含量上升、自由卷曲结构含量下降,或β-转角结构含量上升,预示ACE构象发生改变。而当单一或多重解除盐键、氢键、疏水作用等相互作用时,SYP与ACE的结合受到影响,ACE构象改变也随之被影响。由此可知,SYP的抑制活性取决于其与ACE的分子间相互作用,其中盐键最为关键;SYP通过与ACE结合,改变其α-螺旋、β-转角、自由卷曲等二级结构,最终使ACE失活。3.寡肽SYP生物稳定性与生物利用率探究经人体胃肠液消化体外模拟实验发现,SYP可被胃蛋白酶降解,但在肠道内能保持稳定。此外,SYP对肠上皮细胞、血管内皮细胞毒性较小,体现其良好的安全性。采用静脉注射、腹腔注射、灌胃等不同给药方式,通过自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rat,SHR)动物模型评价SYP的短期降血压功效,由于SYP经灌胃能被胃蛋白酶降解,因而静脉注射和腹腔注射SYP的降血压效果明显好于灌胃组。经静脉注射,SYP在1 h内可快速降低舒张压37.5 mmHg,收缩压30.5 mmHg。然而,1h后血压却逐渐回升,通过血药残留浓度与血清降解实验发现,SYP进入血液1h后,可能被蛋白酶或氨肽酶降解而失效,从而影响其发挥降血压功效。因此,提高活性寡肽生物利用度,是今后活性寡肽在降血压应用中亟待解决的关键问题。4.寡肽SYP在SHR体内的降血压功效与分子机制研究建立SHR动物模型评价SYP的长期降血压功效,并通过基因表达谱分析SYP在体内的降血压分子机理。相较于生理盐水组和失活肽Ac-AAA-NH2(ACE抑制活性为8.91±0.33%)对照组,SHR经SYP静脉注射28天后,SHR收缩压和舒张压均被明显降低(P<0.05)。血流动力学和病理切片结果显示,SYP可有效改善SHR心肺功能。取SHR胸主动脉,通过基因芯片分析筛选SYP治疗引起的差异表达基因,从SHR胸主动脉27777个基因中筛选获得115个下调基因,103个上调基因。由基因本体论(Genetic ontology,GO)和 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析可知,差异基因涉及resin-angiotensin system(RAS)、cGMP-PKG信号通路。在SYP长期给药情况下,RAS通路中ACE、AT1R基因下调,而CMA1、ACE2、AP-A、PREP等基因上调,从而激活起血管舒张作用的AT2R、MAS1等受体。此外,cGMP-PKG信号通路中的eNOS、PKG、RhoA、ROCK等关键基因上调,预示SYP通过激活eNOS/NO/cGMP通路,进而激活PKG,促进细胞内游离Ca2+向胞外释放,实现血管舒张目的。5.寡肽SYP对HEAC细胞的降血压作用与分子机制分析基于基因芯片结果,建立AngⅠ诱导的HAEC细胞模型,从mRNA和蛋白表达水平分析SYP发挥降血压功能的信号通路调控分子机理,研究表明SYP通过抑制ACE活性,阻断Ang Ⅱ生成,进而激活eNOS/NO/cGMP信号通路,发挥舒张血管功能。同时,由于Ang Ⅱ减少,Ang Ⅱ/NOX2/ROS旁路也受到影响,导致NOX2蛋白/酶活水平下降,从而阻断ROS产生,由于舒张因子NO未被ROS转化成ONOO-而失活,因而在体内不断积累,发挥有效的血管舒张作用。
关键词: 灵芝菌丝 ；寡肽 ；ACE抑制机理 ；降血压 ；基因芯片 ；分子机理
被引量
14
摘要： 绿豆（Vigna radiata）是一种营养价值和药用价值较高的经济作物,具有低脂肪、中淀粉、高蛋白的特点。绿豆蛋白的氨基酸种类全面,配比均衡,是一种优质的植物蛋白来源。生物活性肽在机体内有独特的吸收机制、致敏性低、无毒副作用,且具有抗氧化、降血压、免疫调节等多种生物活性,因此受到人们广泛的关注。本课题采用碱提酸沉的方法提取绿豆蛋白,利用酶解技术水解绿豆蛋白,通过单因素和响应面试验优化酶解参数,随后采用不同机理的体外化学抗氧化方法和H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤模型来评价绿豆肽（MBPs）的抗氧化活性,最后利用色谱技术对MBPs进行分离纯化,和质谱技术对目标组分进行结构鉴定,具体结果如下:（1）采用碱性蛋白酶Alcalase 2.4L FG酶解绿豆蛋白制备MBPs,以水解度（DH）为指标,利用优化试验研究底物质量浓度、酶解温度、pH值、酶用量及酶解时间等对DH的影响。Design Expert.V8.0.6.1软件确定绿豆蛋白的最优酶解工艺参数为:底物质量浓度为4.90%,pH值9.0,酶用量5.06%,酶解温度50℃,酶解时间4 h,所得水解度为30.24%。（2）制备的MBPs分子量小,含有高含量的碱性和疏水性氨基酸,且表现出一定的体外抗氧化能力。MBPs共有17种氨基酸,其中人体的8种必需氨基酸具有34.18%的占比,非极性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸和酸性氨基酸占比也分别为35.27%、11.91%、19.40%、33.43%。高效液相色谱显示MBPHs主要由分子量小于3000 Da的肽段组成（95.36%）,其中小于2000 Da的肽段的比例为85.98%。FI-TR图谱表明MBPs中含有二级结构中的α-螺旋和β-折叠结构,除此之外还有多种不饱和基团存在。体外自由基清除试验表明MBPs对DPPH和ABTS自由基的清除能力均较强,浓度为10.0 mg/mL和2.0 mg/mL时,清除率就分别达到60.47±4.41%和77.76±1.42%。（3）MBPs能够保护HepG2细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。结果表明,MBPs对HepG2细胞无毒性,且与模型组相比,经过MBPs预保护的细胞存活率显著上升（P<0.01）。除此之外,MBPs能够显著降低HepG2细胞内ROS和MDA的含量,增加SOD的活性,从而具有保护HepG2细胞免受H2O2诱导氧化损伤的能力。（4）利用凝胶色谱（Sephadex G-25）和UPLC-Q-TOF-MS/MS对MBPs进行分离纯化和结构鉴定。结果显示,Sephadex G-25将MBPs共分离出6个组分:F1、F2、F3、F4、F5、F6,其中分子量最小的组分F6显示出最强的DPPH自由基清除的能力。组分F6通过质谱技术共被鉴定出8条肽段,其氨基酸序列分别为:Cys-Val-Val-Gly-Phe-His（846.37 Da）、Ala-Ser-Phe-Ala-Ser-Met-Pro-His（846.37Da）、Arg-Pro-Lys-Pro-Pro-His（730.42 Da）、Gly-Asn-Trp-Gly-Pro-Leu（642.3 Da）、Gln-Pro-Ala-Asn-Val-Phe（675.32 Da）、Ala-Pro-Ala-Pro-Ile-Tyr（630.33 Da）、Ala-Arg-Phe-Pro-Ala（560.31 Da）、Leu-Ala-Ala-Cys-Gly-Glu-Phe-His（846.37 Da）。8条肽段不仅分子量均小于1000 Da,且与抗氧化肽相关的疏水性和碱性氨基酸在肽段中的占比也较高。
关键词: 绿豆蛋白 ；抗氧化肽 ；分离纯化 ；构效关系 ；HepG2细胞
被引量
14
摘要： 肽的完整吸收是指某些肽可以不被水解，通过一定方式直接透过小肠进入体内，以完整的形式被机体所吸收。目前二肽与三肽的完整吸收已经为人们所接受，但是氨基酸残基数大于3的肽的完整吸收性还没有得到广泛的认同，这也成为了食源性肽，特别是食源性功能肽研究中一个亟待解决的问题，因为目前相当一部分依据体外活性评价方法所鉴定出的功能肽段的氨基酸残基数都要大于3，这些肽的完整吸收是发挥人们所预期的功能的前提，如果不能证明这部分肽的完整吸收，那么对食源性功能肽的更深层次研究将缺乏实际应用的理论依据。
本文主要研究基于Caco-2（the human colon adenocarcinoma cell lines）细胞模型的蛋清源ACE抑制肽的完整吸收性以及ACE（Angiotensin convertingenzyme）抑制肽的结构与其完整吸收之间的关系。通过建立Caco-2细胞膜模型，测定蛋清源ACE抑制肽基于Caco-2细胞膜的表观渗透系数Papp （apparentpermeability coefficient），评价蛋清源ACE抑制肽的完整吸收性及其完整吸收途径，并通过结构改造方法制备一系列肽序列，进行蛋清源ACE抑制肽的结构与完整吸收之间关系的研究。全文研究内容主要分为以下三个部分：
1. Caco-2细胞膜模型的构建及完整性评价。将Caco-2细胞以1×105细胞/孔的密度接种到12孔transwell培养小室半透膜上，连续培养21～23天，分别通过测定细胞膜跨膜电阻TEER（transepithelial electrical resistance）、细胞膜两侧碱性磷酸酶活力及共聚焦激光扫描显微镜观察细胞膜分布形态三种方法评价Caco-2细胞膜的完整性。结果表明，Caco-2细胞膜的跨膜电阻值TEER在第19天至23天开始出现稳定，基本维持在400cm2左右，说明细胞紧密连接程度较好，形成了致密的细胞层结构；碱性磷酸酶测定结果显示，在第21天，AP（apicalside）侧碱性磷酸酶活力是BL（basolateral side）侧的13.66倍，表现出较大的细胞极性，说明Caco-2细胞膜已经出现了明显的极性分化，形成了具有明显极性的膜结构；FITC-phalloidin和DAPI双染色共聚焦激光扫描显微实验结果显示，Caco-2细胞分布均匀且紧密连接，整个Caco-2细胞膜的完整性较好。因此，本实验中构建的Caco-2细胞膜完整性良好，能够用来体外模拟小肠上皮细胞层，进行蛋清源ACE抑制肽的完整吸收研究。
2.蛋清源ACE抑制肽的完整吸收研究，由于ACE抑制肽对胃肠道尤其是小肠上皮刷状缘膜酶的稳定性的不同，将ACE抑制肽分为两类，即对刷状缘膜酶稳定的ACE抑制肽和对刷状缘膜酶敏感的ACE抑制肽，因此，分别选取一条ACE抑制肽QIGLF（IC50:75μM）和RVPSL（IC50:20μM）研究其完整吸收性及完整吸收途径：
（1）对胃肠道消化酶稳定的蛋清源ACE抑制肽QIGLF的完整吸收研究：
结果表明，QIGLF与Caco-2细胞膜共培养2h后，QIGLF的稳定性>96%；QIGLF对Caco-2细胞膜的完整吸收率随着吸收时间和初始肽浓度的增加而增加，吸收动力学参数Km为32.37±12.59mM，Vmax为1.23±0.49uM/min cm2，当QIGLF初始浓度为1mM，吸收时间为2h时，具有最大吸收速率，表观渗透系数Papp为(9.11±0.19)×10-7cm/s；吸收机制研究结果显示，细胞旁路渗透可能是QIGLF完整吸收的最主要途径。
（2）对胃肠道消化酶敏感的蛋清源ACE抑制肽RVPSL的完整吸收研究：结果表明：RVPSL与Caco-2细胞膜共培养2h后，约有36.31%的RVPSL可能被Caco-2细胞膜上分布的膜肽酶所降解，而膜肽酶DPPIV（dipeptidyl peptidaseIV）的抑制剂diprotin A可以将膜肽酶对RVPSL的降解率降低至23.49%；RVPSL对Caco-2细胞膜的双向吸收转运实验结果显示，吸收渗透系数Papp (AP-BL)为(6.97±1.11)×10-6cm/s，外排渗透系数Papp (BL-AP)为(2.52±0.08)×10-6cm/s，说明RVPSL对Caco-2细胞膜的吸收显著大于其外排，但使用了diprotin A之后，Papp(BL-AP)增大到(6.53±0.08)×10-6cm/s，与其吸收渗透系数Papp (AP-BL)(7.29±0.81)×10-6cm/s相比，并无显著性差异，说明RVPSL对Caco-2细胞膜的吸收转运是被动的和非极性的；吸收机制研究结果显示，细胞旁路渗透可能是RVPSL完整吸收的最主要途径。
3.蛋清源ACE抑制肽的结构与完整吸收关系研究。通过对蛋清源ACE抑制肽RVPSL进行结构改造得到一系列肽序列，并进行完整吸收实验，结果表明：Pro替换RVPSL的C端氨基酸残基后其表观渗透系数Papp的变化无明显规律，但Pro替换RVPSL的N端氨基酸残基后表观渗透系数Papp的变化呈一定规律分布，Papp值的大小顺序为PPP-X-X> RPP-X-X> PVP-X-X> RVP-X-X （X代表Pro、Leu或者Ser），说明N端Pro残基比Val残基和Arg残基都更有利于肽的完整吸收；四肽RVPS的Papp值大于先导序列五肽RVPSL，但是VPSL的Papp值却显著小于RVPSL甚至本实验中所有的肽；二肽RV和SL、三肽RVP和PSL的Papp值均大于先导序列五肽RVPSL，且二肽的Papp值大于三肽，二肽和三肽的高Papp值可能是由于其完整吸收途径与四肽和五肽不同，四肽和五肽可能主要由细胞旁路途径被完整吸收，而二肽和三肽则可能主要以载体介导的主动转运形式被完整吸收，且载体介导的主动转运比细胞旁路渗透具有更高的吸收转运效率。
关键词: 蛋清 ；ACE抑制肽 ；完整吸收 ；构效关系 ；Caco-2细胞膜
被引量
16
摘要： 本文以大米为原料，碱法提取大米蛋白，再通过碱性蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解的方法从大米蛋白中获得大米肽（rice peptide，RP）。测定其绝对分子质量分布、氨基酸组成、肽含量、体外血管紧张素转化酶（angiotensin-I convertingenzyme，ACE）的抑制活性及抗氧化活性。以原发性高血压大鼠（spontaneouslyhypertensive rats，SHR）和正常对照组大鼠（wistar kyoto，WKY）为研究对象，进行大米肽一次灌胃和长期灌胃实验，以进行体内降血压机制的研究。并利用人结肠癌细胞（the human colon carcinoma cell line，简称Caco-2细胞）单层细胞模型模拟研究大米活性肽与合成三肽在人肠道的转运摄取。
本研究通过酶法得到的大米肽，它的绝对分子质量主要分布范围在549～1158之间；氨基酸组成丰富，必需氨基酸含量为35.610g/100g，疏水氨基酸含量为45.200g/100g，氨基酸组成中谷氨酸含量最高，含量为16.100g/100g；大米肽的含肽量为83.84±1.44%；大米肽具有较强的抗氧化能力，清除DPPH自由基IC50为1.170mg/mL，ORAC值为1568.006μmol Trolox/g；大米肽同时也具有较高的ACE抑制活性，其IC50为0.057mg/mL。
本研究体内大米肽降血压结果表明，在一次灌胃实验中，SHR中大米肽所有剂量组在灌胃后，SBP开始下降，在6h时达到最低，且下降幅度随大米肽质量浓度的增大而提高，在100mg/ml达到最大，而阳性对照（卡托普利）组降压幅度最大；SHR口服RP（100mg/kg）和卡托普利后，SBP存在显著的下降（P<0.05），但SHR口服RP（20mg/kg）后SBP下降不明显（P>0.05）；此外，WKY大鼠口服卡托普利后，SBP显著地下降（P<0.05），RP（100mg/kg）对WKY大鼠无降压作用。SHR和WKY一次灌胃的降压效果比较短暂，24小时后恢复到初始水平。长期灌胃实验结果显示，SHR灌胃RP（100mg/kg）和卡托普利6周后，SBP明显下降（P<0.05）；SHR的阳性对照组的下降幅度最高，为18.8mmHg，其次是RP（100mg/kg）剂量组17.1mmHg，RP（50mg/kg）剂量组8.2mmHg；WKY大鼠口服卡托普利6周后，SBP显著地下降（P<0.05），而RP（100mg/kg）对WKY大鼠无降压作用。
本研究在大米肽降血压效果基础上，对其长期灌胃降血压机制进行了探讨。结果表明，长期灌胃6周后，SHR和WKY各组间Renin含量差异不明显（P>0.05）；与阴性对照组相比，SHR灌胃卡托普利（10mg/kg）6周后，血浆中ACE含量下降非常显著（P <0.01），而RP（100mg/kg）和RP（50mg/kg）剂量组的ACE含量也显著下降（P <0.05）；同时，SHR阳性对照组大鼠血浆中Ang II显著下降（P<0.05），RP组Ang II随着剂量的增大而逐渐降低，但是差异不明显；长期灌胃卡托普利（10mg/kg）、RP（100mg/kg）和RP（50mg/kg）后，SHR血浆中NO含量显著上升（P<0.01），ACE活力显著下降（P <0.01）；WKY灌胃卡托普利（10mg/kg）6周后，血浆中NO含量的上升非常显著（P<0.01），Ang II含量和ACE活力下降显著（P<0.05），ACE含量差异不明显；SHR和WKY不同剂量组间左心室指数的变化表明，卡托普利和RP（100mg/kg）能够显著降低大鼠收缩压，在一定程度上抑制了左心室肥厚。血浆Renin、ACE、AngⅡ、NO含量和ACE活力的测定结果表明，大米肽降压机制很可能与RAS系统和NO的调节有关。
本研究通过Caco-2细胞模型，探讨大米活性肽与合成三肽在人肠道的转运摄取机制。Caco-2细胞模型建立：细胞培养21天后，细胞跨膜电阻(transepithelialelectrical resistance， TEER)为409Ω/cm2，碱性磷酸酶（bilateral alkalinephosphatase，AKP）多集中于AP侧，荧光素钠的表观渗透系数（apparentpermeability coeffcient，Papp）为1.9810-7cm/s，完全符合要求，可用于模拟小肠吸收的体外模型。VNP（Val-Asn-Pro）和大米活性肽的安全上样浓度分别为1mg/mL、2mg/mL；大米活性肽组和纯品VNP组中VNP在2.5h内随着时间增加，转运量平缓增大且近似线性增加，说明大米肽混合物中不含有抑制VNP转运的物质；同时VNP跨膜转运是浓度依赖型的。VNP的Papp为3.8810-6cm/s，属于吸收中等药物，吸收率为20%-70%。Gly-Pro和wortmannin对BL侧VNP转运无抑制作用，去氧胆酸钠对AP侧VNP转运有极其显著的促进作用。实验结果表明VNP主要以旁路转运的机制被小肠上皮细胞吸收。
关键词: 大米活性肽 ；ACE抑制活性 ；降压效果 ；Caco-2细胞
被引量
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摘要： 目的： 检测基因工程表达生产的降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP)的降血压活性,建立其高效液相色谱(HPLC)检测方法,并对其吸收机理进行研究,为其进入实际应用提供理论基础。 方法： 1) ACE能催化HHL分解产生马尿酸,而降血压肽通过抑制ACE的活性降低马尿酸的产量,采用反向HPLC测定马尿酸在228 nm处的吸收,以此计算目的多肽体外活性;2)通过测量口服降血压肽后SHR老鼠血压的变化确定VLPVP的体内降血压活性;3)利用安捷伦1100液相色谱仪和VYDAC238EV54 C18反向色谱柱确定降血压肽VLPVP的液相检测方法;4)采用MTT比色法研究VLPVP对Caco-2细胞的毒性;5)通过观察Caco-2细胞单分子层的形态,细胞极性研究、标志物渗漏检测和跨膜电阻(TEER)来判断模型是否成功建立;6)采用Caco-2细胞模型来研究VLPVP的细胞吸收转运动力学。考察了pH、浓度、ATP能量抑制剂、竞争性转运载体抑制剂、表面活性剂、P-gp抑制剂、MRP1和MRP2抑制剂以及细胞内吞抑制剂等对VLPVP的转运吸收和分泌的影响。 结果： 1)建立HPLC法测定VLPVP的色谱条件如下,色谱柱:VYDAC238EV54 C18(200 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈:水(22:78),0.05％TFA;流速:1.0 mL/min;检测波长:202nm;柱温:30℃;灵敏度:0.01AUFS;进样量:20μL。日内、日间精密度RSD%均在2%以下,准确度均在99%以上。VLPVP在室温以下及6.0-8.0的pH下贮存相对稳定,可贮存30d。反复冻融3次对其稳定性无影响。 2)研究了降血压肽VLPVP的体内体外降血压活性,其体外对血管紧张素转化酶的抑制活性(IC50)为1.8μM。 3)以800μg/kg·bw剂量口服给药高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat)2 h后,降压幅度达到40.9±15.7mmHg,与空白对照组比较血压降低显著(P<0.01),以400μg/kg·bw剂量口服给药高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat)2 h后,降压幅度达到28.3±23.0mmHg与空白对照组比较血压降低显著(P<0.05),较卡托普利对照组(10mg/kg·bw)相当,其降血压活性可以持续12h以上,而且对正常大鼠的血压无显著的降血压作用。 4)采用MTT比色法研究VLPVP对Caco-2细胞的毒性。实验结果表明,小于14 mmo/L的VLPVP溶液对细胞没有毒性;而大于14mmo/L的VLPVP溶液对细胞呈现毒性。 5)在本实验室的培养条件下,经过21d培养分化后,Caco-2细胞分化形成了具有细胞极性的单分子层结构,符合VLPVP转运实验的要求,因而可以作为考察VLPVP小肠吸收转运的体外实验模型。 6)采用体外Caco-2细胞模型研究VLPVP的细胞吸收转运机制,结果表明VLPVP在Caco-2细胞的转运主要是通过被动扩散和MRP2介导的主动转运。 结论： 通过基因工程表达的VLPVP有着较强的体内体外降血压活性,其转运方式以旁路转运为主要方式被小肠上皮细胞吸收,并受到多药耐药蛋白MRP2强烈的外排作用。
关键词: 降血压肽 ；降血压活性 ；吸收机理 ；高效液相色谱
被引量
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