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摘要： 天然蛋白来源提取出的活性肽可影响多种生理过程,其中具有抑制血管紧张素转化酶（Angiotensin-ⅠConverting Enzyme,ACE）活性的肽被称为血管紧张素转化酶抑制肽,ACE抑制肽具有安全、温和、无副作用的优点,可起到高血压辅助治疗作用。研究ACE抑制肽与ACE结合的作用机理对于开发应用ACE抑制肽具有重要意义。本文选取由鲣鱼蛋白中提取出的三肽LKP作为研究对象,探索在HEPES、ACES缓冲液体系中LKP对ACE抑制作用的机理,主要包括以下研究内容:以新鲜猪肺为原料,经过匀浆、硫酸铵分级盐析和透析等多步纯化,获得ACE粗酶液,采用DEAE-FF阴离子交换层析-超滤法对粗酶液进一步纯化,最终获得截留液。经过一系列的分离纯化后获得电泳级纯度的ACE,比活达到1.87 U/mg,总的酶活回收率为35.9%,纯化倍数为311.7。确定LKP的抑制类型、IC50值。通过Lineweaver-Buck双倒数作图法,确定LKP的抑制类型为混合型抑制类型。测定抑制肽LKP的IC50值为0.318μmol/L。研究LKP对ACE抑制作用的热动力学,采用等温滴定量热法（Isothermal titration calorimetry,ITC）测得LKP与ACE结合的焓变（ΔH）、熵变（ΔS）、化学计量比（n）以及结合常数（Ka）等热力学参数,判断结合反应的非共价键结合力。实验结果表明LKP与ACE的结合反应是自发进行的放热反应,在HEPES及ACES缓冲液中的结合驱动力都是以熵驱动为主,非共价键结合力主要为疏水作用。LKP主要是通过和ACE氨基酸残基间形成的疏水作用力,改变ACE的空间构象从而抑制ACE的活性。采用紫外吸收光谱法、荧光光谱法以及圆二色谱法进一步研究LKP对ACE空间构象的影响。实验结果表明,LKP可以结合ACE形成新的稳定的复合物,猝灭ACE的内源荧光,猝灭机制为静态猝灭,LKP与ACE结合达到饱和后,再继续加入LKP,ACE的空间结构依然会发生改变,说明游离的LKP虽然不再和ACE结合,但仍然可以影响ACE的空间构象。圆二色谱结果显示,LKP能够导致ACE的二级结构发生改变,蛋白质结构会先变松散后折叠紧密,HEPES缓冲液中ACE最终结构比未加入LKP时要松弛,ACES缓冲液中,ACE最终结构比无LKP时更加紧密。利用分子对接技术研究LKP与ACE的结合模型。结果显示,在HEPES体系中,结合最佳构象是LKP在ACE活性中心结合,ACES体系中最佳结合构象是LKP与ACE表面非活性部位结合,LKP与ACE氨基酸残基都是通过疏水作用以及氢键结合。
关键词: 血管紧张素转化酶 ；纯化 ；ACE抑制肽 ；光谱法 ；抑制机理
被引量
4
摘要： 血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)在血压调控中发挥着重要作用。从食源蛋白中筛选具有ACE抑制活性的多肽已经成为研究热点。螺旋藻作为最早被食用的藻类,目前其蛋白质含量在藻类食物中最高,因此该研究利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解螺旋藻蛋白制备ACE抑制肽。首先,通过水解度、DPPH清除率、ACE抑制率筛选得到最佳水解酶为碱性蛋白酶。联合肽组学与计算模拟发现水解组分中2条新型ACE抑制肽分别为His-Ile-Ile-Ala-Arg-Pro-His(HIIARPH,IC_(50)=461.5μmol/L)和Leu-Arg-Leu-Lys-Glu(LRLKE,IC_(50)=155.8μmol/L),其酶抑制动力学表现形式为非竞争抑制模式。进一步采用分子对接分析其非竞争性抑制的分子机制,发现HIIARPH和LRLKE与ACE的S_(1)、S_(2)口袋形成氢键发挥抑制作用,此外,LRLKE能与S_(3)口袋以及Zn^(2+)结合,表现出更佳的抑制活性。最后,评价了HIIARPH和LRLKE的稳定性和细胞毒性。其中,LRLKE具有较好的热稳定性,在酸性和弱碱性条件下都能保持较高的活性。HIIARPH和LRLKE在≤1 mmol/L时对HUVEC细胞无明显毒性。综上,该研究提供了一种快速筛选ACE抑制肽的方法,为开发螺旋藻源降血压肽提供理论参考。
关键词: 螺旋藻蛋白 ；血管紧张素转化酶 ；肽 ；分子对接 ；稳定性
被引量
11
摘要： 目的:研究豌豆蛋白酶解寡肽(Val-Glu-Pro-Gln,VGPG)对饮食引起的高血压(hypertension,HTN)的调节效果,阐明VGPG对HTN的作用机理。方法:在VGPG与血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)分子对接作用机制研究的基础上,对其调节HTN模型大鼠血压、血清中ACE活性、血脂指标浓度以及肠道菌群相关指标进行了测定,分析VGPG在HTN调节过程中与ACE活性、肠道菌群之间的关系。结果:VGPG对大鼠HTN具有显著的调节效果,并可缓解由HTN所引起的肥胖。VGPG对HTN的调节机制为:1)通过氢键作用以及与Zn^(2+)的配位作用与ACE活性位点相结合,对其活性产生竞争性抑制从而达到降压的作用;2)通过调节肠道微环境,使菌群丰富度和多样性维持在正常范围,避免因肠道微生物紊乱对大鼠血压造成不良影响,同时提高菌群对糖类物质的分解能力,从而减少对糖类物质消化吸收,控制体质量,降低因体质量过高而导致血压升高的可能性。纯度为98%、质量浓度为25 mg/mL的VGPG具有最佳的HTN模型调节效果,而且VGPG相比于其他降压药物对器官及肠胃环境无明显不良影响。结论:VGPG对大鼠HTN具有明显的降压效果。本研究为将VGPG用作调节HTN的功能性因子、制备相关功能性食品提供了参考。
关键词: 豌豆寡肽 ；高血压 ；血管紧张素转换酶 ；分子对接 ；肠道菌群
被引量
11
摘要： 血管紧张素转化酶(ACE)是一种含锌离子的羧二肽酶,通过肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统进行血压调节。食源血管紧张素转化酶抑制肽(ACEIP)可抑制ACE的活性对高血压控制有利。以鲣鱼蛋白分离出的ACE抑制肽Leu-Lys-Pro(LKP)为原料,采用荧光光谱法、紫外-可见光谱法、圆二色谱法、等温滴定量热法(ITC)以及分子对接技术研究了LKP对ACE的抑制机理。荧光光谱结果表明,LKP能够有效猝灭ACE的内源荧光,猝灭机制为静态猝灭,两者结合可形成较稳定的复合物,ACE中色氨酸和酪氨酸残基所处的微环境疏水性减小,导致极性增强。紫外、圆二色谱结果表明,LKP与ACE结合会导致ACE构象发生改变,ACE与LKP结合后二级结构比未结合时松散,为紧密-松散-稍紧密的变化过程。ITC测得LKP与ACE结合的焓变(ΔH)、熵变(ΔS)、化学计量比(n)以及结合常数(Ka)等热力学参数,结果表明两者结合反应是由熵驱动的自发吸热过程,结合力主要为疏水作用,确定LKP与ACE相互作用的结合位点数约为1,且随温度升高而增加。LKP与ACE的结合常数K_(a)分别为2.2×10^(3),0.9×10^(3)和5.3×10^(3),说明两者亲和力较小。分子对接结果表明,ACE活性中心的S_(1)口袋的氨基酸残基Gln281,Lys511与LKP形成氢键相互作用,His353,His513与LKP具有疏水作用,LKP主要通过疏水作用与ACE结合,氢键稳定蛋白空间结构。该研究对了解ACE抑制肽与ACE的作用机制提供了一定的帮助,为开发新的治疗高血压药物建立一定的理论基础。
关键词: 血管紧张素转化酶 ；抑制肽 ；光谱法 ；等温滴定量热 ；分子对接
被引量
8
摘要： 利用分子柔性对接方法模拟研究4种较典型的血管紧张素转化酶Ⅰ(ACE)抑制肽KVLPVP(Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro)、YKVPQL(Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu)、VYPFPG(Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly)、IASGQP(Ile-Ala-Ser-Gly-Gln-Pro)与ACE相互作用的分子机理,确定它们的作用位点、作用力类型及相互作用能。结果表明:4种ACE抑制肽与ACE的活性口袋之间存在氢键、疏水、亲水、静电力、配位键等相互作用力,它们共同维持了肽与ACE复合物构象的稳定。ACE活性口袋中的关键氨基酸残基为:His353、Ala354、Ser355、Ala356、Glu384、Glu411、Pro519、Arg522、Tyr523,小肽分子中的关键基团为:氮端氨基、肽键羰基、碳端羧基;KVLPVP、YKVPQL、VYPFPG、IASGQP与ACE之间的结合能呈由低到高的趋势,表明它们与ACE之间的结合依次减弱,这与它们的IC50值依次增大的趋势相一致。
关键词: ACE抑制肽 ；血管紧张素转化酶 ；分子模拟
被引量
6
【会议论文】 •
会议时间： 2019-08-03
摘要： 为从灵芝菌丝体中分离鉴定获得降压肽,并研究其抑制机理,采用超滤膜截留、高效液相色谱分离、电喷雾质谱鉴定等技术,对灵芝菌丝体血管紧张素转化酶抑制肽进行分离鉴定。根据氨基酸序列合成该活性肽,通过人脐静脉内皮细胞降血压模型评价其降血压功效。选取效果最强的灵芝菌丝体降压肽,利用Lineweaver-Burk作图法、分子动力学模拟研究其对血管紧张素转化酶的抑制机理。结果表明,从灵芝菌丝体中分离鉴定获得35种血管紧张素转化酶抑制肽,其中Ser-Tyr-Pro和Gln-Leu-Val-Pro的降血压活性最强,均能提高内皮型一氧化氮合成酶的磷酸化水平,降低1型内皮素的蛋白表达及m RNA水平,同时测得其对血管紧张素转化酶的抑制活性IC50分别为62.5μg/mL和58.3μg/mL。Ser-Tyr-Pro属于竞争型抑制剂,通过丝氨酸残基Ser1与血管紧张素转化酶活性区域的赖氨酸残基Lys472形成盐键,同时酪氨酸残基Tyr2、脯氨酸残基Pro3可与血管紧张素转化酶活性区域的赖氨酸残基Lys415、赖氨酸残基Lys472、组氨酸残基His474形成氢键,并与苯丙氨酸残基Phe418、酪氨酸残基Tyr484具有疏水作用,从而影响血管紧张素转化酶的酶活。Gln-Leu-Val-Pro则是一种混合型抑制剂,通过脯氨酸残基Pro4、缬氨酸残基Val3与Lys472、谷氨酸残基Gln242形成盐键和氢键,作用于血管紧张素转化酶的活性及非活性区域而影响其活性。灵芝菌丝体降压肽Ser-Tyr-Pro和Gln-Leu-Val-Pro高效安全,可作为理想的降压药物用于高血压治疗。
关键词: 灵芝 ；降压肽 ；结构鉴定 ；抑制机理
摘要： 在结构信息分析的基础上,选择具有特定作用位点的酶,进行酶解制备血管紧张素转化酶抑制肽(ACEIP)的研究,对以结构信息为基础的定向控制酶解制备模式进行了初步探讨.文中首先通过全略微分重叠计算,对所选择的11种抑制剂的结构信息进行分析,认为当肽链的N端为Asp、Glu,C端为Pro、Trp、Met、Phe、Lys时,对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制效果较好;在此基础上,选择具有特定作用位点的酶,以罗非鱼肉为对象进行酶解制备ACEIP的研究,并对酶解产物进行分离和分析,发现其中含有Thr-Cys、Asp-Trp和Glu-Met,所得结果与理论分析结果相符,初步说明了以结构信息为基础的定向控制酶解制备模式的可行性.
关键词: 血管紧张素转化酶抑制肽 ；酶解 ；结构信息 ；全略微分重叠计算
被引量
1
摘要： 本课题以单环刺螠（Urechis unicinctus）为原料,运用可控酶解技术,以血管紧张素转化酶（ACE）的抑制率为筛选指标,制备具有降压活性的生物活性肽。样品原料经过脱脂,烘干,酶解,超滤、Sephadex G-15凝胶柱层析、反相高效液相色谱（RP-HPLC）及质谱测序等一系列分离纯化和鉴定技术得到7条具有ACE抑制活性的寡肽,并在化学水平与细胞水平上研究其降压活性及其与之相关的氧化应激保护活性。通过酶动力学与计算机模拟分子对接技术,探讨活性多肽与ACE之间的作用方式。主要研究内容与结果如下:（1）ACE抑制肽的制备:以ACE抑制率为指标,对蛋白酶及酶解条件进行筛选。首先,将脱脂之后的单环刺螠粉末分别在胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适条件下进行酶解,得到的中性蛋白酶酶解液有较高的ACE抑制率;通过单因素实验进一步优化酶解条件,最终确定最佳酶解条件为:中性蛋白酶,45℃、pH 7.0、加酶量4%、料液比1:30、酶解时间4 h。在最佳酶解条件下进行酶解,并进行超滤分段,活性评价结果显示<1 kDa的酶解液组分的ACE抑制率最佳,对该组份依次通过Sephadex G-15凝胶层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行分离纯化,得到7条寡肽（F1-F7）。经质谱和氨基酸序列分析确定其序列为:Gln-Pro-Met-Thr-Phe（F1）、Ile-Val-Lys-His-Phe（F2）、Phe-Pro-Tyr-Lys-His（F3）、Trp-Pro-Gly-Lys-Ala（F4）、Gly-Leu-Thr-Lys-Pro（F5）、Met-Pro-Gln-Gly-Ile-Val-Val（F6）、Ile-Val-Met-Arg-Ile（F7）。（2）单环刺螠多肽对ACE的抑制活性:对寡肽F1-F7进行ACE抑制率筛选,结果表明F2、F3、F4、F5以及F7具有较好的ACE抑制活性且明显高于其余多肽,其IC50值分别为0.47 mg/mL、0.71 mg/mL、0.32 mg/mL、0.29 mg/mL和0.38 mg/mL,并对其进行了构效关系分析。通过酶动力学与计算机模拟分子对接技术发现,多肽F2、F4、F5、F7与ACE是竞争性抑制,而F3则是非竞争性抑制。（3）单环刺螠ACE抑制肽对血管内皮细胞中血压调控因子的影响:选择ACE抑制活性较好的F2、F3、F4、F5和F7作用于HUVEC细胞,实验结果表明:F2、F3、F4、F5和F7在一定浓度范围内（50-200μM）对HUVEC细胞无毒副作用;此5条寡肽,不仅能够抑制内源性收缩因子内皮素（ET-1）的生成,促进舒张因子一氧化氮（NO）的释放,还可以一定程度的激活内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）,抑制诱导型一氧化氮合酶（induced nitrogen monoxide synthase,iNOS）的活性,从而释放更多的NO,改善由去甲肾上腺素引起的内皮细胞功能障碍。（4）单环刺螠ACE抑制肽对氧化损伤的HUVEC细胞的保护作用:以超氧阴离子（O2.-）清除率为指标,筛选出清除活性较好的F4和F5进行后续实验。采用H2O2诱导HUVEC建立氧化损伤模型,结果表明:双氧水浓度为700μM,损伤4 h时建模成功;两种肽均能促进细胞NO的释放,提高细胞内SOD和CAT活力,并降低MDA与细胞外培养液中LDH的含量。通过DCFH-DA染色观察显示单环刺螠多肽（F4和F5）能减少H2O2诱导的HUVEC细胞活性氧的增加,且活性呈浓度依赖性。因此,F4与F5对双氧水诱导的HUVEC细胞氧化损伤具有一定程度的保护作用。综上,中性蛋白酶酶解的单环刺螠多肽经超滤、凝胶色谱和高效液相色谱纯化后,通过ESI-MS鉴定出7条肽,通过细胞实验发现肽F2、F3、F4、F5和F7具有较好的ACE抑制作用,并且肽F4和F5具有保护氧化损伤的HUVEC细胞的作用。
关键词: 单环刺螠 ；寡肽 ；ACE抑制 ；酶动力学 ；分子对接 ；氧化应激
被引量
5
摘要： 高血压是危害人类健康的一种慢性疾病。哺乳动物的血压是由肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）通过两种主要蛋白酶——肾素和血管紧张素转化酶（ACE）来调节的。肾素作为该系统的初始限速酶,可调控血管紧张素原生成血管紧张素Ⅰ的速度,因此抑制肾素的活性可从源头控制血压升高。肽具有可调控血压的活性已被证实,食源性降压肽因其安全,副作用小而被人们广泛研究。苦荞是一种药食同源农作物,已有报道从苦荞蛋白水解液中鉴定出高活性ACE抑制肽,而苦荞蛋白肽对肾素的活性抑制及其作用机理未见研究。本论文以苦荞为原料,提取四种分级蛋白后水解,分析水解液结构及其与肾素抑制活性之间的关系,选取活性较高的清蛋白和谷蛋白水解液进行分离纯化、鉴定肽序列、筛选出具有肾素抑制活性的肽;体外验证化学合成肽的肾素抑制活性并研究其结构特征;探究苦荞蛋白肾素抑制肽和肾素的相互作用方式和具体结合位点及其对肾素二级结构和三级结构的影响,为苦荞蛋白作为肾素抑制肽的来源和应用提供一定的理论基础和参考依据。主要研究内容和结果如下:
首先从苦荞中提取四种分级蛋白,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行水解,检测分级蛋白水解液的肾素抑制活性,通过氨基酸分析、内源荧光光谱和SDS-PAGE等解析水解液结构,分析水解液结构与肾素抑制活性的关系。苦荞清蛋白和谷蛋白水解液的肾素抑制率和肽得率较高;清蛋白和谷蛋白富含疏水性氨基酸和带电荷氨基;蛋白质内部疏水基团暴露,荧光值增加;清蛋白和谷蛋白的大分子量蛋白消失,小分子量蛋白增多。因此,清蛋白和谷蛋白是肾素抑制肽的良好来源。
其次采用阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对苦荞清蛋白和谷蛋白水解液进行分离纯化后检测肾素抑制活性。清蛋白水解液经过阴离子交换色谱分离纯化后,得到五个组分（QF1、QF2、QF3、QF4和QF5）,QF4的肾素抑制活性最高,抑制率为27.02%,然后采用凝胶过滤色谱分离QF4,得到4个组分（QF4-1、QF4-2、QF4-3和QF4-4）,QF4-1的肾素抑制活性最高,抑制率为37.61%,最后通过RP-HPLC得到三个组分（QF4-1-1、QF4-1-2和QF4-1-3）,QF4-1-3的肾素抑制活性最高,抑制率为45.12%。谷蛋白水解液经阴离子交换色谱分离纯化后得到五个不同的组分（GF1、GF2、GF3、GF4和GF5）,GF5的肾素抑制活性最高,达到32.74%,GF5组分经过RP-HPLC分离后,得到4个组分（GF5-1、GF5-2、GF5-3和GF5-4）,GF5-4的抑制率最高为28.32%,但低于GF5,肽组分间可能存在协同作用。鉴定清蛋白QF4-1-3和谷蛋白GF5-4中肽序列,并通过生物信息学手段筛选出10条多肽。
然后化学合成10条多肽,测定体外肾素抑制活性。在2 mmol/L的浓度下,LFFR和LGLLPYFR的肾素抑制率最高,分别为46.67%和38.88%,IC50分别为5.00 m M和10.19 m M。其余八条多肽VEVFRPF,VVPQGF,SLRTFF、GFLVQFR、SFLFR,FFLLGPR、IQPGGLLLPSY和VPQGFA在2 mmol/L时抑制率分别为6.32±1.00%,16.55±0.11%,19.35±0.89%,37.57±2.26%,26.68±3.02%,33.88±0.54%,22.46±5.54%,31.01±0.08%。LFFR和LGLLPYFR的氨基端均含有亮氨酸（L）,羧基端均含有精氨酸（R）。体外模拟消化实验表明LFFR和LGLLPYFR在胃肠消化过程中较为稳定。
最后利用酶抑制动力学和分子对接研究多肽对肾素的作用方式。酶抑制动力学显示LFFR对肾素可能为混合型抑制,LGLLPYFR的Vmax随多肽浓度的增加而降低,Km几乎不变,可能是非竞争性抑制。分子对接结果表明,LFFR和LGLLPYFR与肾素活性中心的Asp32,Asp215通过氢键和疏水相互作用连接,疏水相互作用为主要作用力。圆二色谱结果表明多肽与肾素的相互作用诱导了肾素二级结构的改变,无规则卷曲增多。荧光光谱显示LFFR和LGLLPYFR对肾素为静态猝灭,多肽与肾素的相互作用以疏水相互作用为主,与分子对接的结果一致。
关键词: 苦荞分级蛋白 ；高血压 ；肾素抑制肽 ；分离纯化 ；抑制机理
被引量
1
摘要： 蛋白质在人体生命活动中承担着许许多多的作用,对其结构和功能的研究对促进人体健康具有重大意义。理论计算的快速发展促进了当前蛋白体系的研究。本文针对食品科学领域所面临的与人体健康密切相关的复杂体系问题,以血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting enzyme,ACE）与抑制肽和甜味受体（Taste Receptor Type Member 2/3,T1R2/T1R3）与甜味剂的作用为对象,展开系统研究。ACE体系其复杂性在于拥有成千上万个配体。ACE在血压调节中发挥重要作用,该蛋白过量表达会形成高血压。当前高血压药物大多存在不同程度副作用,食源性ACE抑制肽因具有来源广泛、安全性好等特点而备受关注。但目前尚没有一套系统且有效的方法实现ACE抑制肽的筛选,并且缺乏对抑制肽的特征及相关作用机理的认知。因此本文通过分子对接首次系统完成了160000个四肽对ACE抑制效果的评估,并通过统计分析发现位点上具有W、Y、F、H或R残基的四肽可能具有更好的抑制效果,前10及最后2个ACE-四肽复合物的结合自由能计算及IC50实验验证了这一结论,并发现抑制效果最好的为YYWK(IC50=19.98±8.19μM),为后续ACE抑制肽的筛选提供方向指导。T1R2/T1R3体系其复杂性在于受体为膜蛋白,体系大、结构复杂且尚未解析。T1R2能与大部分甜味剂结合,了解甜味受体的作用机制对新型健康甜味剂的设计很重要。然而,目前对该受体及相关蛋白的结构和识别机制知之甚少。本文通过同源建模构建其结构,采用分子对接评估了28种主要甜味剂,选择8种典型甜味剂构建甜味剂-T1R2-膜体系,分析受体与甜味剂之间的相互作用。计算结果表明低甜度天然甜味剂,如果糖和木糖醇,在约30 ns时从结合口袋中释放出,位移>50?;而人工甜味剂,纽甜和爱德万甜与受体稳定结合,位移在5?内。范德华力在高强度甜味剂体系中作用显著。这些结果提供了对甜味剂作用机制更深入的理解,并为甜味剂的设计提供了新的方向。
关键词: 分子动力学模拟 ；ACE ；四肽 ；T1R2 ；甜味剂
被引量
3
摘要： 目的:以阿拉斯加鳕鱼皮为原料,筛选制备胶原多肽的最优工艺,对酶解液进行分离纯化,获得对血管紧张素转化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)抑制活性较好且较稳定的活性肽。方法:采用酶解法制备得到鳕鱼皮酶解液并对其进行了工艺优化,得到的酶解液借助氨基酸分析仪和液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)等进行结构分析。再将酶解液依次利用分子截留量分别为3k Da和10k Da的超滤管、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)分子层析和高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)进行分离纯化,得到纯度较高的ACE抑制肽。借助液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)和傅里叶变换红外色谱仪(fourier transform infrared spectrometer,FTIR)等对其进行了结构表征,同时研究了各组分的ACE抑制活性,并利用Auto Dock软件分析了ACE抑制肽与ACE的结合方式与作用位点。结果:(1)采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶等6种不同的蛋白酶对阿拉斯加鳕鱼皮进行酶解,并以ACE抑制率为评价标准,筛选得到酶解阿拉斯加鳕鱼皮制备ACE抑制肽的最优酶。考察料液比、酶与底物质量比、pH、酶解温度和时间等要素对ACE抑制肽的ACE抑制活性的影响。经多个单因素试验和正交试验确定了制备阿拉斯加鳕鱼皮ACE抑制肽的最优条件为:水解温度为40℃,反应2 h,料液比为1:7,酶与底物质量比为3%,pH为7。最优工艺的酶解液ACE抑制率为79.62%,分子量在500 Da以下的占总体的70.74%;酶解液中甘氨酸含量占比最高,为29.41%,脯氨酸含量次之,为16.11%。酶解液中还含有Ile、Leu、Met、Val、Phe、Lys、Thr 7种人体必需氨基酸,总的氨基酸含量占比为83%。(2)将阿拉斯加鳕鱼皮酶解液分别经分子截留量为3kDa和10k Da的超滤管分离后,获得小于3k Da、3k Da-10k Da和大于10k Da三种不同分子量的酶解液。体外对ACE的抑制作用结果表明:小于3k Da组分的ACE抑制率最高,50%抑制浓度(inhibit-concentration for50%,IC50)为 1.59±0.008 mg/mL。利用Sephadex G-25凝胶过滤色谱法对小于3k Da组分进一步纯化,获得6个不同的组分,其ACE抑制结果表明层析柱分离组分3(F3)活性最强,IC50值为0.25±0.012 mg/mL。再利用RP-HPLC对F3进一步纯化得到纯度较高的单一组分(纯化肽)。通过高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用技术(high performance liquid chromatography--Q-TOF-mass spectrometer,HPLC-Q-TOF-MS)对纯化肽进行序列分析,以纯化肽序列与ACE抑制活性之间的关系为基础,筛选得到4条ACE抑制肽序列,分别为GPLGVP、VLYPVK、VFLENVLR和FEEF。并利用固相合成法进行了从头合成,研究发现:GPLGVP的ACE抑制活性最强,分子量为538.31 Da,IC50值为105.8 μM。且通过BIOPEP数据库搜索后发现该序列为新型序列。FT-IR光谱显示纯化肽具有无规卷曲结构和β-折叠。Lineweaver-Burk图表明该肽为非竞争性抑制机制,说明抑制肽能够在其结合位点之外与酶结合。对胃肠蛋白酶稳定性的研究发现纯化肽在酶解前后抑制率分别为70.94%±0.37%和69.64%±0.25%,说明纯化肽对酶的敏感性较低。(3)以ACE的晶体结构(PDB:ID 108A)和ACE抑制肽GPLGVP分别为受体和配体分子,使用Auto Dock软件对其进行分子对接,研究发现:纯化肽GPLGVP可成功地对接在ACE的活性位点上。其中,GPLGVP的七个ACE残基(Gln281,Lys511,Tyr520,Glu162,His353,Cys370 和 Asp377)可与 ACE形成氢键。GPLGVP还能够与两个ACE活性口袋(S2和S10)中的至少一个残基相互作用。此外,纯化肽GPLGVP主要通过范德华力和氢键作用力结合ACE的活性位点。结论:海洋生物是提取生物活性肽的新来源,采用各种分离方法相结合的方式可获得纯度较高活性显著的活性肽。
关键词: 阿拉斯加鳕鱼皮 ；ACE抑制肽 ；分离纯化 ；结构鉴定 ；分子对接
被引量
1
摘要： 高血压是最常见的心血管疾病之一,直接影响和损害人身体健康。血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme,ACE,EC 3.4.15.1）在调节血压和控制心血管疾病中起重要作用。ACE有两个活性结构域,其中C-结构域是血压调控的主要作用位点,而N-结构域对血压调节没有显著效果。生物活性小肽类ACE抑制肽因其毒副作用小,易吸收而受到广泛关注。因此,明确ACE两个结构域与生物活性小肽的作用机理,进而有效抑制ACE十分必要。本文以含酪氨酸残基的ACE抑制二肽为研究对象。对其ACE结构域选择性抑制活性、稳定性、与ACE相互作用方面进行研究。主要研究内容及结果如下:（1）筛选对ACE的C-结构域具有选择性抑制作用的含酪氨酸二肽。结果表明:C端为酪氨酸,N端为酸性、碱性、芳香族、羟基类氨基酸的二肽,对ACE的C结构域为非选择性抑制;N端为脂肪族类氨基酸的二肽对ACE C-结构域的抑制活性显著高于其对ACE N-结构域的抑制活性。考察ACE抑制肽末端含酪氨酸残基对ACE结构域抑制活性的影响。结果表明:N端为酪氨酸残基的二肽Tyr-Ala（YA）、Tyr-Leu（YL）、Tyr-Ile（YI）对ACE的C-结构域和N-结构域抑制活性无显著差异。而C端为酪氨酸残基的二肽AY、LY、IY对ACE的C-结构域选择性抑制效果显著。ACE抑制剂C端为酪氨酸残基的结构对于抑制ACE的C结构域是一个有利结构。通过高效液相色谱对C端含酪氨酸残基的二肽Ser-Tyr（SY）、Ala-Tyr（AY）、Leu-Tyr（LY）、Arg-Tyr（RY）、Ile-Tyr（IY）、Phe-Tyr（FY）、Glu-Tyr（EY）、Val-Tyr（VY）抑制类型进行测定。结果表明:N端为脂肪族氨基酸的含酪氨酸二肽IY和LY为竞争性抑制、AY和VY为混合型抑制,N端为酸性、碱性、芳香族、羟基氨基酸时则为非竞争性抑制。（2）测定含酪氨酸残基ACE抑制二肽AY、IY、LY、SY的热稳定性、抗消化性能,优化了AY、IY、LY、SY的定量检测分析方法。结果表明:AY、IY、LY、SY含量在0.01～2 mg/mL的浓度范围内均具有良好的线性关系,回收率在98.41%100.29%,准确度及精密度的RSD均小于1%,其检出限为2-3μg/mL。该检测方法可准确定量样品中AY、IY、LY、SY的含量,方便快捷,且准确性高。在37℃、50℃、70℃条件下6 h内IY、LY、AY、SY均有较好的热稳定性,其中IY稳定性较好。AY、IY、LY、SY具有较好的抗胃蛋白酶消化能力,人工胃液反应2 h后,肽损失率均小于10.00%。AY、IY、LY、SY具有好的抗胰蛋白酶消化能力,肽损失率范围在12.73%16.01%,SY的抗消化能力相对低于IY、LY、AY。含酪氨酸残基ACE抑制二肽AY、IY、LY、SY具有较好的热稳定性和良好的抗胃肠道消化能力。（3）通过核磁共振技术,研究具有ACE C-结构域选择性抑制作用的IY、非结构域选择性抑制作用的SY在水、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇三种溶剂中的构象变化。两者在水溶液中均以柔顺自由伸展的构象存在,在甲醇溶液中是以伸展状态为优势构象并伴有折叠构象存在,在DMSO溶液则处于折叠蜷缩的状态。通过圆二色光谱、紫外可见光谱、红外光谱技术手段,研究AY、IY、SY、LY与ACE相互作用后ACE的构象变化。四种二肽均使ACE构象发生改变,主要使ACE的α-螺旋、β-折叠发生改变;具有C-结构域选择性抑制作用、竞争性抑制的IY对ACE的构象改变最为显著。通过分子模拟手段对含酪氨酸残基的ACE抑制二肽与ACE结构域相互作用进行研究。AY、IY、LY对ACE C-结构域具有好的亲和力,其中IY、LY对ACE C-结构域有较高的亲和力。二肽的N端氨基酸,在与ACE C-结构域结合中相比其与ACE N-结构域结合中作用更大。本文研究结果可为含酪氨酸残基二肽ACE选择性抑制机理提供理论基础。为研究含酪氨酸的ACE抑制肽的生物口服利用度、针对性设计ACE C-结构域选择性抑制肽提供理论依据。
关键词: 酪氨酸 ；血管紧张素转化酶 ；构效关系 ；结构域 ；稳定性 ；二肽
被引量
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摘要： 核桃作为我国重要的经济作物,含有丰富的油脂和蛋白质,营养价值较高,深受消费者的喜爱。本研究以核桃粕为原料,采用超声对蛋白进行预处理,研究超声时间和功率对核桃蛋白性质和核桃多肽ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性的影响,然后分离纯化ACE抑制肽,并研究其抑制机理和药代动力学特性,最后分析特定氨基酸种类对ACE抑制肽性质的影响。研究具体内容和结果如下:
(1)对核桃蛋白进行超声预处理,研究超声时间和功率对核桃蛋白粒径和电位、粒径分布、荧光光谱、表面疏水性和多肽ACE抑制活性的影响。结果表明,在最佳的超声时间和功率条件下,蛋白的粒径分别减小约60.8%和71.37%;溶解度分别增加约15.4%和22.1%;荧光强度分别增加约13.7%和13.6%;表面疏水性分别增加约23.8%和31.4%;酶解经超声处理后的蛋白得到的酶解液的ACE抑制活性也增加约17.9%和16.5%。实验结果表明超声可以改善核桃蛋白的性质和功能。
(2)对超声预处理后的核桃蛋白酶解液中的ACE抑制肽进行分离纯化和鉴定。首先酶解液经过超滤分离得到W-1(MW<5 k Da)、W-2(5-10 k Da)和W-3(MW>10k Da)三个组分;由于W-1组分的ACE抑制率最高为85.57±0.42%,故将W-1组分通过离子交换色谱进一步分离得到W-1-1、W-1-2、W-1-3和W-1-4四个组分,其中W-1-1组分的抑制活性最高为86.22±1.01%。然后对W-1-1组分的多肽进行质谱鉴定得到1025条肽序列,其中四肽有296条,占比最高。最后经过多肽的毒性、ACE抑制活性、水溶性和抗消化能力的预测,从所有肽段中筛选得到IYQ和YIQ两条ACE抑制肽。
(3)合成筛选得到的多肽IYQ和YIQ,测定其ACE抑制活性并对抑制机理和物理化学性质进行表征。首先合成了纯度分别为99.95%和99.98%的抑制肽IYQ和YIQ,测定其两条肽段的ACE抑制率分别为95.5±0.1%和82.12±1.7%。然后分子对接分析发现YIQ与ACE形成7条氢键,全部位于ACE活性中心,而IYQ与ACE活性位点的结合有限,在体外IYQ也表现为反竞争性抑制。最后分析了YIQ和IYQ参与人体内药物代谢的情况和温度稳定性,结果表明YIQ和IYQ与ACE在人体内结合概率较小。IYQ在4°C和25°C温度条件下稳定,但在50°C和80°C条件下会出现抑制活性下降的现象。
(4)对已报道ACE抑制肽进行分析,基于BIOPEP数据库对IYQ中间氨基酸进行替换,并对替换得到的多肽性质进行表征。首先经过数据库分析,发现Pro、Leu和Lys等是ACE抑制肽中常见的氨基酸,然后对IYQ中的氨基酸进行替换得到IPQ、ILQ和IKQ三条新的ACE抑制肽。最后测定了替换肽的各项性质,结果表明替换肽的ACE抑制率分别为89.5±0.1%、68.5±0.1%和98.12±1.7%,抑制活性变化明显;且IKQ与ACE活性中心形成的氢键数量增加,同时与人体内ACE的结合概率提高到21.7%,温度稳定性也显著增强。
关键词: 超声 ；核桃蛋白 ；ACE抑制肽 ；生物信息学 ；分子对接
摘要： 血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme,ACE）是人体内血压调控系统的关键酶,活性过高,会引起人体血压升高。ACE抑制肽通过抑制ACE的活性来达到降血压的作用。ACE抑制肽通常采用酶解法制备,得到的酶解液成分十分复杂,需要进行分离纯化才能得到具有高抑制活性的组分。传统的分离方法步骤繁琐、耗时长,因此急需开发一种能快速筛选ACE抑制肽的方法。本文采用原位包埋法制备了具有高活性、高稳定性的固定化ACE,并将其作为亲和分离介质,用于蛋白酶解液中ACE抑制肽的快速分离纯化。主要研究内容及结果如下:
（1）以2-甲基咪唑（2-Me IM）、Zn（NO3）2和猪肺ACE粗提液为原料,采用原位包埋法制备固定化血管紧张素转化酶ACE@mZIF-8。为解决ACE@mZIF-8使用过程中ACE的泄露问题,利用多巴胺的自聚合反应,在其表面包裹聚多巴胺层,制备得到固定化酶—ACE@mZIF-8/PDA（AmZP）。以酶活回收率为考察指标,通过单因素实验确定AmZP的最佳制备工艺条件:2-Me IM浓度为20 mmol·L-1,Zn（NO3）2浓度为10 mmol·L-1,反应时间为30 min,pH为7.3,温度为30℃,ACE粗提液蛋白浓度为4 mg·m L-1,多巴胺聚合时间为4 h。制备得到的AmZP能有效降低酶的泄露,酶活回收率为36.75%,酶固定化率为89.74%。采用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、红外光谱（FITR）、X-射线衍射（XRD）和N2吸附-解吸等温线实验对AmZP进行表征,结果表明AmZP成功包裹ACE,呈表面粗糙的球形,粒径为100～200 nm,具有无定型结构,孔径为3～4 nm。对AmZP的酶学性能进行研究。结果表明,ACE固定化后,最适催化条件发生偏移,最适pH为8.8,最适温度为47℃。与游离酶相比,AmZP具有良好的pH稳定性、热稳定性、抗化学试剂变性和储存稳定性,重复使用10次后,仍保持82.29%的酶活,说明具有良好的操作稳定性。
（2）采用分子对接、紫外光谱、荧光光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱,对ZIF-8前体(2-Me IM、Zn（NO3）2)与ACE之间的相互作用进行研究,探讨ACE@mZIF-8的合成机理。研究结果表明,2-Me IM和Zn2+在ACE上存在多个结合位点,通过氢键、疏水作用、π-阳离子作用和π-堆积作用与ACE结合,诱导介孔ZIF-8在ACE周围结晶,最终形成ACE@mZIF-8。结合过程引起ACE构象的变化。
（3）采用“grafting to”策略将DA-PEGx-DA聚合物锚定到ACE@mZIF-8/PDA表面,制备了对ACE抑制肽具有高特异性吸附的复合材料——ACE@mZIF-8/PDA/DA-PEGx-DA（AmZPPx）。以牛血清白蛋白（BSA）为非特异性吸附蛋白模型,研究了AmZPPx的抗非特异性吸附效果。结果表明,当PEG分子量为5000,DA-PEG5000-DA浓度为0.2 mmol·L-1,改性时间为30 min,制备得到的AmZPP5000具有良好的抗非特异性吸附性,对BSA的吸附量为12.19 mg·g-1,仅为AmZP的26.11%。以VPP（ACE竞争性抑制肽）和GF-6（ACE非竞争性抑制肽）为特异性吸附多肽模型,对AmZPPx的特异性吸附性能进行研究。结果表明AmZPP5000对VPP和GF-6具有良好的选择性吸附,最大吸附量分别为43.63 mg·g-1和227.1 mg·g-1,吸附过程属于物理单分子层吸附,颗粒内扩散是主要的控制过程。
（4）采用酶解法对短吻鲾鱼肉蛋白进行水解,制备ACE抑制肽,并对酶解工艺进行研究,得到最佳的酶解工艺条件:选用碱性蛋白酶进行酶解,酶解时间为3 h、温度为45℃、pH为9.5、酶/底物为4000U/g,水解度控制在25%左右,得到的酶解液具有最高的ACE抑制活性,IC50值为0.623mg·m L-1。
（5）以AmZPP5000为亲和介质对短吻鲾鱼肉蛋白酶解液中的ACE抑制肽进行快速分离,并利用MALDI-TOF/TOF质谱仪对洗脱液的组分进行鉴定,最终解析得到4种新型的ACE抑制肽:Val-Thr-Met-Phe-Thr-Cys（VC-6）,His-Pro-Arg-Ala-Trp-Phe（HF-6）,Arg-Ser-Glu-Val-His-Tyr-Arg-Met（RM-8）,Ala-Asp-Thr-Arg-Arg-Pro-Ala-His-Arg-Glu（AE-10）,IC50值分别为:341.19、44.67、30.06、17.70μmol·L-1,即0.239、0.036、0.032、0.021 mg·m L-1。
（6）对VC-6、HF-6、RM-8和AE-10的抑制类型进行研究,发现VC-6和HF-6为混合型抑制,RM-8和AE-10为竞争性抑制剂。采用Autodock Vina研究4种多肽与ACE之间的相互作用位点和相互作用力。结果发现四种多肽均能以不同的作用力与ACE结合,形成稳定的复杂结构,从而达到抑制ACE的目的。其中HF-6和RM-8能与ACE活性位点的关键氨基酸残基结合。利用在线工具Toxin Pred和ADMETlab预测VC-6、HF-6、RM-8和AE-10的ADMET性质。结果表明这四种多肽的ADMET参数都在可接受的范围之内,可作为活性物质参与功能食品的开发。
关键词: 介孔ZIF-8 ；固定化血管紧张素转化酶 ；ACE抑制肽 ；亲和分离
被引量
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摘要： 灵芝作为我国传统名贵药食用真菌,是创新性天然药物的重要来源。现有的灵芝天然产物研究主要集中于多糖类和三萜类化合物,蛋白类化合物研究相关较少。寡肽是由2～10个氨基酸组成的小分子蛋白类化合物,具有组织透过性好、免疫原性弱等优点,开发潜力较大。本课题采用液态发酵培养灵芝菌丝体,从其中分离筛选获得血管紧张素转化酶抑制肽(Angiotensin converting enzyme inhibitory peptide,ACEIP),评估其体内降血压功效,并分析该活性寡肽的降血压分子机制,为进一步开发灵芝创新药物、保健食品提供理论依据,也可为其它来源的活性寡肽开发应用提供借鉴。1.灵芝发酵菌丝体ACEIP分离与结构鉴定利用液相质谱联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)从灵芝(Ganoderma lingzhi,G.lingzhi)发酵菌丝体中分离鉴定获得32个ACEIP,并利用现代层析技术从另一灵芝(Ganoderma lucidum,G.lucidum)品种中分离纯化获得 3 个寡肽,分别为 Gln-Leu-Val-Pro(QLVP)、Gln-Asp-Val-Leu(QDVL)和Gln-Leu-Asp-Leu(QLDL)。根据ACE抑制活性和得率,选择源自G.lingzhi的Ser-Tyr-Pro(SYP)、Glu-Gln-Val-Leu(EQVL)、Asp-Leu-Gln-Leu-Val-Pro(DLQLVP)、Pro-Leu-Glu-Leu-Val-Pro(PLELVP)、Gln-Arg-Val-Cys-Glu(QRVCE)、Ala-Phe-Gly-Ser-Asn-Ala-Leu-Pro-Val(AFGSNALPV)这 6 个活性较强(≥50%)的寡肽,进一步比较分析其与ACE结合自由能和ACE抑制活性IC50,发现SYP与ACE结合的自由能高达34.4 kcal/mol,并表现出很强的ACE抑制活性,其IC50为62.50±1.81μg/mL。因此,SYP可作为理想的降血压药物进行开发利用。2.寡肽SYP抑制ACE活性的机理分析与结构改性由双倒数作图法测定米氏常数可知,SYP属于非竞争性抑制模型。分子对接结果显示,SYP通过Serl氨基与ACE的Asp507形成盐键/离;通过Serl羟基与Lys511、Tyr2酚羟基与Gln281、Pro3羧羟基与Lys454形成3个氢键;通过Tyr2苯环、Pro3闭环与Phe457、Tyr520和Phe524产生疏水作用,结合位点中的Gln281、Lys511、Tyr520等氨基酸残基是ACE活性区域的S2 口袋,预示SYP通过与ACE结合,改变其构象,最终导致其失活。为验证分子对接结果,利用氨基乙酰化、羧基酰胺化、氨基酸替换等结构改性手段,单一或多重解除SYP与ACE形成的盐键、氢键及疏水作用,比较分析其改性前后的ACE抑制活性,并利用圆二色谱(Circular dichroism spectrum,CD)探究ACE构象的改变情况。研究发现,当SYP与ACE分子间相互作用被单一或多重解除时,其ACE抑制活性均被显著消弱,且影响活性的强弱顺序为:盐键>氢键>>疏水作用。此外,CD分析进一步发现,SYP与ACE结合后,ACE的α-螺旋结构含量上升、自由卷曲结构含量下降,或β-转角结构含量上升,预示ACE构象发生改变。而当单一或多重解除盐键、氢键、疏水作用等相互作用时,SYP与ACE的结合受到影响,ACE构象改变也随之被影响。由此可知,SYP的抑制活性取决于其与ACE的分子间相互作用,其中盐键最为关键;SYP通过与ACE结合,改变其α-螺旋、β-转角、自由卷曲等二级结构,最终使ACE失活。3.寡肽SYP生物稳定性与生物利用率探究经人体胃肠液消化体外模拟实验发现,SYP可被胃蛋白酶降解,但在肠道内能保持稳定。此外,SYP对肠上皮细胞、血管内皮细胞毒性较小,体现其良好的安全性。采用静脉注射、腹腔注射、灌胃等不同给药方式,通过自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rat,SHR)动物模型评价SYP的短期降血压功效,由于SYP经灌胃能被胃蛋白酶降解,因而静脉注射和腹腔注射SYP的降血压效果明显好于灌胃组。经静脉注射,SYP在1 h内可快速降低舒张压37.5 mmHg,收缩压30.5 mmHg。然而,1h后血压却逐渐回升,通过血药残留浓度与血清降解实验发现,SYP进入血液1h后,可能被蛋白酶或氨肽酶降解而失效,从而影响其发挥降血压功效。因此,提高活性寡肽生物利用度,是今后活性寡肽在降血压应用中亟待解决的关键问题。4.寡肽SYP在SHR体内的降血压功效与分子机制研究建立SHR动物模型评价SYP的长期降血压功效,并通过基因表达谱分析SYP在体内的降血压分子机理。相较于生理盐水组和失活肽Ac-AAA-NH2(ACE抑制活性为8.91±0.33%)对照组,SHR经SYP静脉注射28天后,SHR收缩压和舒张压均被明显降低(P<0.05)。血流动力学和病理切片结果显示,SYP可有效改善SHR心肺功能。取SHR胸主动脉,通过基因芯片分析筛选SYP治疗引起的差异表达基因,从SHR胸主动脉27777个基因中筛选获得115个下调基因,103个上调基因。由基因本体论(Genetic ontology,GO)和 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析可知,差异基因涉及resin-angiotensin system(RAS)、cGMP-PKG信号通路。在SYP长期给药情况下,RAS通路中ACE、AT1R基因下调,而CMA1、ACE2、AP-A、PREP等基因上调,从而激活起血管舒张作用的AT2R、MAS1等受体。此外,cGMP-PKG信号通路中的eNOS、PKG、RhoA、ROCK等关键基因上调,预示SYP通过激活eNOS/NO/cGMP通路,进而激活PKG,促进细胞内游离Ca2+向胞外释放,实现血管舒张目的。5.寡肽SYP对HEAC细胞的降血压作用与分子机制分析基于基因芯片结果,建立AngⅠ诱导的HAEC细胞模型,从mRNA和蛋白表达水平分析SYP发挥降血压功能的信号通路调控分子机理,研究表明SYP通过抑制ACE活性,阻断Ang Ⅱ生成,进而激活eNOS/NO/cGMP信号通路,发挥舒张血管功能。同时,由于Ang Ⅱ减少,Ang Ⅱ/NOX2/ROS旁路也受到影响,导致NOX2蛋白/酶活水平下降,从而阻断ROS产生,由于舒张因子NO未被ROS转化成ONOO-而失活,因而在体内不断积累,发挥有效的血管舒张作用。
关键词: 灵芝菌丝 ；寡肽 ；ACE抑制机理 ；降血压 ；基因芯片 ；分子机理
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摘要： 食品源ACE抑制肽是一种具有治疗高血压病潜力的功能食品资源。越来越多食源性ACE抑制肽被研究,但大多数ACE抑制肽高活性结构并没有得到确定,其结构特性和构效关系还需进一步研究。高血压等疾病在最近几年来全世界范围内呈上升趋势,成为威胁生命刻不容缓的问题。因此,防治这种疾病是一项艰巨的任务。血管紧张素转化酶在血压调节中起着重要的作用,它可以促进血管紧张素的形成和舒缓激肽的降解,引起血压升高。目前血管紧张素转化酶抑制剂己成为临床上治疗高血压的重要药物。本文收集了粮谷中包括大米、大豆、小麦、玉米等来源的ACE抑制肽的序列,分析了不同原料的最佳制备方法以及制备条件。得到大豆、米糠和玉米均是不错的ACE抑制肽来源。通过对制备方法的归纳,发现酶解法以其突出的优点,成为粮谷源ACE抑制肽制备较好的方法之一。同时,经过分析发现碱性蛋白酶的酶解效果较为出色,若在超声辅助下酶解,可进一步提高制备效率。对已发现粮谷中ACE抑制肽的氨基酸序列的分子量、肽链长度、末端氨基酸等结构特征进行分析,总结出粮谷中的ACE抑制肽大多为2～7肽,分子量大多在300～1500Da,C-端多含有芳香族氨基酸(Phe、Trp或Tyr)、或Pro、Leu、Gly。N-端多含Leu、Ile、Val、Tyr或Ala等疏水性氨基酸。从收集到的粮谷源ACE抑制肽中,选择活性高且符合前文结构特点的肽,与ACE进行全柔性分子对接研究,考察与抑制肽的相互作用方式,确定影响多肽活性的关键氨基酸残基,希望可以为抑制剂先导化合物的设计提供更多的结构信息。全柔性分子对接模拟结果表明,ACE抑制肽可以和血管紧张素转化酶分子的活性口袋形成氢键作用力,同时存在较强的疏水、亲水等作用力。因此氢键、疏水作用力是维持两者结合的主要作用力。当多肽C-端出现Tyr、Pro或Phe,且Leu或Ile出现在N-端时,该多肽通常表现较高的ACE抑制活性。
关键词: 高血压 ；ACE抑制肽 ；粮谷源 ；构效关系 ；分子对接
被引量
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摘要： 高血压是导致心血管疾病的主要危险因素之一,血管紧张素转化酶（Angiotensin-I-converting enzyme,ACE）抑制剂是治疗高血压的主要药物。化学合成的ACE抑制剂,如赖诺普利、卡托普利等由于其副作用使其应用受限,从海洋食源生物中筛选ACE抑制肽成为众学者研究的热点。ACE抑制肽在酶解活性肽组分中存在含量相对较少、分离纯化步骤繁琐等问题,且有关抑制肽作用机理的研究相对较少。本文以裙带菜为研究对象,基于“蛋白改性-亲和介质制备-生物亲和纯化”的思路,运用超声预处理改性裙带菜蛋白,采用磁性金属有机骨架（Magnetic metal-organic framework,MOF）材料固定化ACE构建亲和介质,亲和分离获得新颖ACE抑制肽,研究抑制肽与ACE的相互作用,以解决亲和材料制备复杂、使用前仍需活化等问题。主要内容如下:（1）采用超滤、凝胶过滤柱层析和反相高效液相色谱（reversed high performance liquid chromatography,RP-HPLC）等对裙带菜蛋白酶解产物进行分离纯化,获得高抑制ACE活性组分,经质谱仪鉴定其氨基酸序列为:Tyr-Lys-Tyr-Tyr（YKYY）,IC50=71.88±1.43μM,经检索为已报道的抑制肽。实验纯化步骤相对较少,用于酶解的菠萝蛋白酶更安全、经济。（2）运用超声预处理对蛋白进行改性,改性蛋白酶解后产物具有更高水解度（Degree of hydrolysis,DH）和ACE抑制率:在超声功率200 W、超声时间15 min、超声工作间歇比1:2（s/s）的条件下,裙带菜蛋白(4.0mg·m L-1)酶解产物的ACE抑制率由41.2±2.0%提高至88.1±2.1%,DH由9.2±0.2%提高至15.6±0.3%,肽含量由13.6±0.2%提高至19.5±0.2%。运用紫外、红外、荧光光谱等分析其原因,结果表明超声预处理可诱导裙带菜蛋白结构由α-螺旋转向β-折叠,蛋白结构变得松弛,酶解产物中疏水性氨基酸含量增加;同时,显著提高了蛋白的溶解度、乳化活性、表面疏水性等性质。（3）采用磁性MOF材料（Fe3O4@ZIF-90）吸附-交联猪肺ACE,最佳固定化条件为:蛋白浓度为10.0 mg·m L-1,固定化pH值为8.0,温度为45℃,时间为2.0 h,Fe3O4@ZIF-90-ACE活力可达0.028±0.006 U·g-1。酶学性质研究结果表明固定化酶的最适pH为8.3,最适温度为45℃,与游离酶相比,固定化ACE增强了对温度的抵抗力,提高了酶的最适温度。稳定性研究结果表明固定化ACE具有较好的热、pH和储存稳定性,重复使用6次后的相对酶活保留率为54.05%,具有良好的操作稳定性。采用密度泛函理论和光电子能谱等方法从结合能、金属离子亲和层析、成键等方面探讨了Fe3O4@ZIF-90分离、固定化ACE机理,结果表明Zn2+可与ACE中的咪唑基（His）、硫醇基（Trp）和吲哚基（Cys）等配位结合亲和分离猪肺ACE,ACE通过物理吸附和共价结合固定在Fe3O4@ZIF-90上。（4）采用Fe3O4@ZIF-90-ACE磁性亲和分离结合RP-HPLC从裙带菜蛋白酶解液中分离纯化获得具有较高抑制ACE活性组分,经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪鉴定为未报道的ACE抑制肽:Lys-Asn-Phe-Leu（KNFL）,IC50=225.87±2.7μM。与传统分离纯化方法相比,亲和纯化时间短,过程简化,亲和介质Fe3O4@ZIF-90-ACE的制备无需活化,且固定化粗提ACE具备成本低、稳定性高、可操作性强的优点。（5）运用初始速率法、等温滴定量热法、紫外、荧光、圆二色谱和分子对接等方法,解析抑制肽KNFL与ACE的作用机理。抑制肽KNFL对ACE的抑制类型为混合型抑制模式;KNFL与ACE多位点结合,且结合为自发的放热反应;二者相互作用的热力学模式为熵、焓双驱动模式,KNFL可与ACE的活性中心和非活性中心发生氢键相互作用,使ACE分子直径增加;KNFL对ACE产生荧光猝灭效果,影响ACE的Trp-、Tyr-残基周围的微环境;使ACE的α-螺旋和无规则卷曲结构向β-折叠结构转变,引起肽链重排,导致ACE空间构象发生变化,ACE活性下降。采用分子动力学模拟对对接复合物进行稳定性考察,通过根均方偏差、均方根涨落和回旋半径的分析结果表明对接复合物在模拟条件下是稳定的,最终建立KNFL与ACE相互作用模型,KNFL与ACE通过多步的诱导契合和构象选择形成相对稳定的复合物。
关键词: ACE抑制肽 ；裙带菜 ；磁性MOF ；固定化
被引量
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摘要： 目前研究发现,干酪不仅富含多种营养组分,在成熟过程中,干酪中的酪蛋白会被凝乳酶和乳酸菌的蛋白酶水解成大肽、游离氨基酸以及功能活性短肽,如抗氧化肽、ACE（血管紧张素转化酶）抑制肽以及免疫调节肽等,使干酪富含特殊的生理功能,这也引起了学者密切的关注。干酪中不仅含有原料乳中的乳酸菌,还含有外源添加的发酵剂乳球菌和非附属发酵剂乳酸菌,其中有一些乳酸菌被证实为益生菌。但干酪成熟期较长,有的可达数年之久,在前期产生的活性肽有可能会被进一步水解,同时为了促进干酪中生物活性肽的生成,也需要添加高水解活性的益生菌等非附属发酵剂,但人为干预添加外源性的益生菌,可能会使干酪菌群结构发生变化,从而影响干酪蛋白水解度和活性肽的生成,并且影响干酪质地,导致品质下降。因此,掌握干酪成熟期间菌群结构变化、活性肽的生成机理及结构特性,对获得高生物活性的干酪具有重要意义。本论文主要研究了干酪活性肽中的抗氧化肽和ACE抑制肽。首先,筛选了具有水解酪蛋白产肽潜力的益生菌,并研究了其水解系统中代表性蛋白酶的酶学特性,然后将具有产肽潜力的益生菌添加到契达干酪中,研究了成熟过程中益生菌对干酪菌群结构、氨肽酶活性、蛋白水解程度、抗氧化性及ACE抑制活性的影响,建立益生菌与干酪抗氧化性及ACE抑制活性的相关性,通过超滤、Sephadex G-25凝胶色谱和液质联用（LC-MS）对益生菌干酪抗氧化肽及ACE抑制肽进行分离鉴定,确定了益生菌水解干酪酪蛋白产肽的作用位点及两种肽的结构与活性。主要研究结果如下:（1）通过分析得出,9株益生菌中蛋白水解能力最强的前4株菌分别为瑞士乳杆菌（L.helveticus）1.0614、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）1.0386、瑞士乳杆菌（L.helveticus）1.0618和鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）1.0911,水解力分别为0.507±0.008、0.481±0.006、0.417±0.009和0.320±0.006。再通过复筛得出,L.helveticus 1.0614水解酪蛋白的肽得率、蛋白回收率显著高于其他菌株（P<0.05）,同时上述4株菌的酪蛋白水解产物均具有抗氧化性和ACE抑制活性,并随着水解时间增加而逐渐增强,其中L.helveticus 1.0614和L.rhamnosus 1.0386显著高于其他2株菌（P<0.05）,但两者的水解产物在DPPH清除率、还原能力以及ACE抑制活性上差异不显著（P>0.05）。因此,最终选择L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614作为接下来试验的益生菌。（2）通过分析L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614水解系统中胞壁蛋白酶（CEP）、广谱氨肽酶（Pep N）和X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶（Pep X）的酶学特性得出,两株菌的CEP活力分别为（59.28±1.03）U/mL和（63.57±1.03）U/mL,在三种蛋白酶中活力是最强的,并且L.helveticus 1.0614的CEP活力显著高于L.rhamnosus 1.0386（P<0.05）。通过以酪蛋白溶液为底物,研究蛋白酶与不同浓度底物作用时的酶活力得出,CEP对酪蛋白的亲和力最强。由此得出,CEP对酪蛋白的水解起主要作用。通过分析得出,L.rhamnosus 1.0386的CEP、Pep N和Pep X最适反应温度分别为40℃、45℃和35℃,最适反应pH值分别为6.5、7.0和7.0;L.helveticus 1.0614三种蛋白酶最适反应温度分别为45℃、40℃和45℃,最适反应pH分别为6.5、6.5和6.0。2株菌的蛋白酶在4～40℃,pH5.0～7.0比较稳定。Na+、Ca2+和K+可显著增加蛋白酶的活性（P<0.05）。契达干酪的成熟温度一般为4～12℃,体系pH为5.0左右,同时含有一定量的Na+和Ca2+,因此在一定程度上可促进益生菌蛋白酶的活性。（3）通过对契达干酪组成成分及品质分析得出,两株菌的添加对干酪组成成分不存在显著性影响（P>0.05）,符合契达干酪标准要求。在成熟180 d后添加益生菌的干酪硬度和凝聚性显著低于空白干酪（P<0.05）,但对干酪整体质地的接受性无影响。L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614在新鲜干酪中的活菌数分别为（8.03±0.06）log CFU/g和（7.92±0.13）log CFU/g,活性较高。在成熟期间两株菌的活菌数也一直呈现上升趋势,在240 d时活菌数分别可达（8.93±0.04）log CFU/g和（8.44±0.05）log CFU/g,由此也说明菌株胞壁蛋白酶也可保持较高含量。益生菌的添加使干酪菌群结构更加多样,主要增加了乳杆菌,而对乳酸乳球菌的生长没有影响,由于益生菌与粪肠球菌间存在菌株竞争,因此其显著降低了干酪中粪肠球菌的数量（P<0.05）。通过对干酪氨肽酶活性分析得出,在成熟120 d后,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614干酪的氨肽酶活性显著上升（P<0.05）。两组干酪的Pep N含量分别在150 d和210 d达到最大,Pep X含量均在150 d达到最大。在整个成熟期内,添加益生菌的契达干酪氨肽酶活性显著高于空白干酪（P<0.05）,这表明随着益生菌出现死亡,胞内氨肽酶在120d后逐渐参与到干酪蛋白水解过程中。同时,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614可显著促进干酪初级和二级蛋白水解（P<0.05）,在240 d时pH4.6-SN含量分别为（26.46±1.06）%和（28.37±1.55）%;12%TCA-SN含量分别为（25.64±1.14）%和（26.32±1.32）%,显著高于空白干酪（P<0.05）。在成熟180 d后,益生菌干酪5%PTA含量显著高于空白干酪（P<0.05）。三组干酪中添加L.helveticus 1.0614干酪的水解程度最高。由此可知,益生菌对干酪蛋白质初级水解有一定促进作用,有助于产生更多水溶性蛋白,并对其进行二级水解,产生可溶于12%TCA的多肽,成熟180 d后,在益生菌胞壁蛋白酶和氨肽酶共同作用下产生可溶于5%PTA的短肽和游离氨基酸,且水解能力强的菌株蛋白水解程度越高。（4）通过分析得出,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614干酪的抗氧化性随着成熟时间延长呈现上升趋势,且在240 d达到最大,DPPH清除力分别为（74.05±1.23）%和（80.12±1.53）%;羟自由基清除力分别为（71.2±1.33）%和（72.8±1.29）%;还原力分别为（0.592±0.023）和（0.602±0.124）,显著高于空白干酪（P<0.05）。在成熟0-60 d,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614干酪的ACE抑制率显著增加（P<0.05）,增长率分别为52.2%和57.2%,并在240 d达到最大,ACE抑制率分别为（92.2±1.09）%和（95.1±1.22）%,显著高于空白干酪（P<0.05）,且添加水解能力较强的L.helveticus 1.0614的干酪,其活性最强。通过相关性分析得出,当干酪中添加益生菌后,益生菌的数量与干酪水解程度、抗氧化性及ACE抑制率存在一定相关性,但不显著（P>0.05）。与空白干酪相比,添加益生菌的干酪,其12%TCA-SN和5%PTA-SN与抗氧化性及ACE抑制率体现出显著正相关（P<0.05）,其中添加L.helveticus 1.0614干酪的5%PTA-SN与抗氧化性及ACE抑制率表现出极显著的正相关（P<0.01）。由此说明,干酪的抗氧化性和ACE抑制率主要与二级蛋白水解及产生的短肽含量有关,添加水解能力强的益生菌可显著促进干酪蛋白水解产生小分子活性肽,显著提高干酪抗氧化性及ACE抑制率（P<0.05）,且添加水解能力越强的菌株,产生的短肽越多。（5）通过对干酪不同超滤组分的抗氧化性及ACE抑制率分析得出,添加L.rhamnosus1.0386和L.helveticus 1.0614干酪中小于3 kDa的组分表现出最强的自由基清除力及ACE抑制率,DPPH清除力分别为（82.3±0.93）%和（89.4±0.32）%;羟自由清除力分别为（80.6±0.35）%和（82.3±0.65）%;还原力分别为0.592±0.022和0.501±0.031;ACE抑制率分别为（93.5±1.63）%和（96.7±0.32）%。由此可知,组分的分子量越低,其抗氧化能力及ACE抑制率越强。通过分析得出,益生菌干酪抗氧化肽及ACE抑制肽的结构各不相同,但分子量均小于1000 Da,肽段长度在5～10,主要来源于β-CN,其次为αs1-CN。与L.rhamnosus 1.0386相比,添加水解能力较强的L.helveticus 1.0614所获得的肽段较短。益生菌干酪抗氧化肽与ACE抑制肽在结构上具有一定相似性,即含有较多疏水性氨基酸和芳香族氨基酸,如抗氧化肽中含有Pro（P）、Tyr（Y）;ACE抑制肽的N端含有Val（V）、Ile（I）、Leu（L）,C端含有Val（V）、Ala（A）、Phe（F）或Pro（P）残基等,同时具有抗氧化性的肽段也可能具有ACE抑制活性。肽段活性高低取决于关键氨基酸的位置和肽链长短,一般肽链C-端为捕获自由基和ACE活性部位的结合位点。通常当肽链C-端为脯氨酸且肽段较短时则具有较高的抗氧化性和ACE抑制率。通过水解位点和活性肽的结构特征得出,益生菌的CEP是水解干酪产抗氧化肽和ACE抑制肽的关键蛋白酶,在成熟后期,氨肽酶也会促使干酪生成两种活性肽。
关键词: 契达干酪 ；益生菌 ；抗氧化肽 ；ACE抑制肽 ；结构特征 ；活性
被引量
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摘要： 以干腌脖肉和干腌火腿等为典型代表的干腌肉品具有悠久的历史文化,是肉制品领域极具魅力的瑰宝,其别具一格的加工工艺赋予其独特的风味和丰富的营养物质。内源蛋白酶水解肌肉蛋白生成小分子肽等物质是干腌肉品风味物质和功能活性物质形成的基础。目前大量的研究集中在表征干腌肉品风味物质、鲜味肽、抗氧化肽及血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽,而干腌肉品中内源蛋白酶与关键风味物质的潜在关系及关键内源蛋白酶影响下形成的潜在的血小板活化因子-乙酰水解酶（PAF-AH）抑制肽尚未得到充分阐述。本研究以干腌脖肉为研究对象,对其在加工过程中内源蛋白酶影响下的蛋白降解水平、关键风味物质和潜在PAF-AH抑制肽进行研究,具体研究内容和结果如下:（1）干腌脖肉加工过程中钙蛋白酶仅在原料肉、腌制和干燥阶段保持活性,而在熟化阶段失去活性;后熟结束时,组织蛋白酶B、L、H和D的残留活性分别是初始活性的61.38%、74.14%、32.15%和48.49%;二肽酶Ⅰ（DPPⅠ）和丙氨酰氨肽酶（AAP）残留活性为初始活性的14.24%和40.00%。此时,蛋白降解指数（PI）和肽含量分别为9.63%和5.96%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）结果表明,在腌制和干燥阶段内肽酶强烈水解肌球蛋白重链、肌动蛋白及3-磷酸甘油醛脱氢酶等肌肉蛋白质,致使大量的蛋白片段和肽迅速积累。DPPⅠ和AAP可能在随后的小肽生成过程中起主要作用。（2）终产品中甜味、苦味、酸味及鲜味氨基酸相比于原料肉中增加了2.81倍、4.48倍、3.45倍和3.19倍。其中,Glu、Lys、Val、Ala和Leu的味觉活性值（TAV）大于1,是关键味觉活性氨基酸。在加工过程中共鉴定47种挥发性风味化合物。PLS分析表明终产品中共有18种挥发性化合物的变量投影重要性（VIP）大于1,是关键挥发性化合物,主要包括己醛、壬醛、辛醛、苯甲醛、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸和辛酸乙酯等。控制变量p H、水分活度（Aw）和水分含量,对内源蛋白酶和关键风味物质进行偏相关性分析,结果表明内源蛋白酶与关键风味物质的形成密切相关,如组织蛋白酶B和D、二肽酶Ⅳ（DPPⅣ）及精氨酰氨肽酶（RAP）对味觉活性氨基酸Lys的积累有显著影响。同时,这些内源蛋白酶也强烈影响己醛积累。RAP不仅显著（P<0.05）影响关键活性氨基酸的积累,而且还可以通过调节辛酸和Leu去实现对辛酸乙酯、2,3-戊二酮和2,3-辛二酮的积累影响。（3）以PAF-AH抑制活性和自由基清除能力为评价基础,利用超滤、G-15 Sephadex结合纳米液相色谱-串联质谱（Nano-LC-MS/MS）从干腌脖肉衍生肽中反复追踪、导向分离、鉴定出30条潜在PAF-AH肽。经过计算模拟预测,LTDKPFL、VEAPPAKVP、KVPVPAPK、IPVPKK和PIKRSP是最具有潜力的PAF-AH抑制肽。肽的末端特异性分析表明,RAP、AAP、DPPⅠ和三肽酶（TPPⅠ）是潜在的影响PAF-AH抑制肽形成的关键内源蛋白酶。分子对接结果表明,氢键、盐桥及电荷吸引等是潜在抑制肽与PAF-AH活性中心氨基酸残基相互作用的主要驱动力。
关键词: 干腌脖肉 ；内源蛋白酶 ；蛋白降解 ；风味物质 ；PAF-AH抑制肽
被引量
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摘要： 鲜味肽作为一种新型调味剂,符合“天然、营养和安全”的食品开发理念。鲜味肽除了具有良好的口感外,还具有一定的功能特性。因此,从食源性衍生蛋白中发现和鉴定新型鲜味肽越来越受到人们的关注。大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）作为一种药食兼用的食用菌,其味道鲜美、风味独特、营养丰富。在前期实验中,我们发现大球盖菇干基中的游离肽可达到148.65～167.32 mg/g,优质的多肽含量为鲜味肽的挖掘提供了可靠原料。本研究以实验室前期工作为基础,对前期分离纯化制备的大球盖菇水提鲜味富集组分进行质谱结构鉴定,构建大球盖菇多肽数据库;基于该数据库利用计算机虚拟筛选技术筛选出兼具潜在血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting enzyme,ACE）和二肽基肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ）抑制活性的鲜味肽;化学合成鉴定鲜味肽并系统研究其味觉属性;通过分子对接探究鲜味肽与hT1R1/T1R3鲜味受体的分子作用机制,以揭示合成肽的呈鲜机理;基于hT1R3受体模块,构建仿生味觉传感器,探究合成肽与hT1R3的靶向互作模式,以实现鲜味肽的快速鉴定;并对合成肽的ACE、DPP-Ⅳ抑制活性及作用机制进行进一步探究;实验结果为多功能鲜味肽的快速筛选、鉴定提供了新策略,亦为大球盖菇深加工产品的多维度开发利用提供理论依据。具体研究结果如下:1.大球盖菇多肽库的建立及通过计算机辅助筛选获得潜在多功能鲜味肽通过UHPLC-Q-Orbitrap-MS/MS从大球盖菇水提鲜味富集组分中鉴定得到123条多肽,以此构建了大球盖菇多肽基础数据库。该肽库由19种氨基酸构成,其中Leu、Pro、Ser、Glu、Ala出现频率较高,这为多肽的呈鲜及功能活性挖掘提供了有利条件。基于同源建模成功构建了高质量的人源鲜味受体hT1R1/T1R3蛋白模型;通过在线预测工具和分子对接筛选得到23条兼具ACE和DPP-Ⅳ抑制活性的鲜味肽,根据分子对接能量最低及氨基酸组成相似等特征,从不同肽链长度的多肽中挑选最具潜力的12条多肽进行固相合成。2.合成肽的味觉特性解析及其与鲜味受体的hT1R1/T1R3分子作用机理研究固相合成已鉴定的12条鲜味肽。感官评价结合电子舌结果表明,12条合成肽的鲜味阈值范围为0.105 m M～0.728 m M高于传统鲜味剂MSG,表现为高感受鲜味肽。12种合成鲜味肽对MSG表现出不同程度的增鲜效果,增鲜率为7.50～35.31%,MGPENGV的增鲜作用最强;在减盐12.5%的模型中,与相同质量浓度的Na Cl（0.4%）溶液相比,12条合成肽与Na Cl混合液体系的鲜味、咸味强度均有提升,鲜味强度增长1.91～3.19倍,DGFASD增鲜效果最强,咸味强度增长1.29～2.27倍,EPQDC增咸效果最强。合成肽与等质量比的氨基酸混合物的滋味特性存在明显差异,表明鲜味肽的鲜味强度不是由单一氨基酸的滋味简单叠加形成的,而是由氨基酸通过肽键形成特定序列及结构决定的;鲜味氨基酸、甜味氨基酸及疏水性氨基酸的存在可促进鲜味的表达,且当C端为鲜味氨基酸时,鲜味肽通常拥有较低的鲜味阈值。分子对接结果显示,hT1R3为鲜味肽的主要识别区域,Ala302、Glu45、Ser146和His145为鲜味肽与hT1R3的关键结合位点,氢键和静电相互作用可促进鲜味的呈现。3.基于表面等离子共振技术（Surface plasmon resonance,SPR）探究合成肽与hT1R3的相互作用模式为便于高效筛选鲜味肽,构建了hT1R3生物传感芯片。通过SPR靶向互作分析,合成肽与hT1R3以“快上快下”作用模式结合。12条均被证实与hT1R3具有较强的亲和力,KD值范围为2.283×10-6M～8.066×10-5M,获得的亲和力与鲜味阈值呈现出较好的一致性,进一步佐证了分子对接结果,hT1R3亚基在人类识别鲜味感知中发挥着主要作用。通过动力学参数发现合成肽具有比MSG鲜味更持久的优势。该方法为鲜味肽的高效鉴定提供了新策略。4.合成肽体外ACE、DPP-Ⅳ抑制活性的测定及抑制机理解析体外活性测定结果表明,12条多肽均具有ACE抑制活性,IC50值范围为5.73±0.01μM～2111.49±5.77μM;EAF、EPQDC、EPQCD、SNGNE和MGPENGV同时表现出良好的DPP-Ⅳ抑制活性,IC50值为1099.03±7.59μM～2763.77±9.55μM,其中EAF表现出突出的ACE抑制和DPP-Ⅳ抑制双重活性。根据多肽结构特征发现,当多肽疏水性较高或带末端有负电荷时,可表现出更强的ACE抑制活性;具有N端第二个氨基酸为Ala或Pro结构特征的EAF、EPQDC和EPQCD表现出比SNGNE和MGPENGV更强的DPP-Ⅳ抑制活性。分子对接结果表明,抑制肽主要通过氢键、金属键及静电相互作用力与ACE关键作用位点Ala354、Tyr523、Lys511、His513及Zn2+结合而发挥其ACE抑制作用;DPP-Ⅳ抑制活性主要通过氢键、静电相互作用及疏水相互作用与DPP-Ⅳ关键作用位点His740、Tyr547、Glu205、Tyr662结合而发挥作用。
关键词: 鲜味肽 ；大球盖菇 ；hT1R1/T1R3 ；ACE ；DPP-Ⅳ ；分子对接 ；SPR
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