摘要: 牛大力为豆科崖豆藤属美丽崖豆藤,是我国传统的药食同源草本植物,其营养成分丰富并具有抗炎、抗疲劳等多种功效,因而拥有极高的营养和保健价值。多糖为牛大力中最重要的功能因子之一,但目前关于牛大力多糖分子的精细结构、免疫调节机制以及对帕金森病(PD)模型的保护作用仍不明确。此外,关于牛大力多糖的其他理化和功能性质,如界面活性和乳化性能,目前知之甚少,相关研究处于空白。针对此现状,本论文首先通过水提-醇沉法制备牛大力多糖,对其化学组成和结构进行初步表征和鉴定,并借助分离纯化技术制备得到两种高纯度牛大力多糖组分;其次,通过核磁共振等分析手段解析多糖组分的精细结构,采用RAW264.7细胞模型探究其免疫调节活性及作用机制,同时研究了其对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞损伤的保护作用;接着,考察牛大力多糖在油水界面的吸附特性,探索其作为乳化剂的潜力,研究其稳定乳液的性能和机制;最后,采取共价接枝乙酰基的策略,解决牛大力多糖乳化能力差的问题,探究具有不同尺度结构的乙酰化牛大力多糖的乳化稳定机制。本论文主要研究结果如下:(1)经过水提-醇沉、脱色、脱蛋白等步骤,制备得到浅黄色絮状牛大力多糖MSCP;FTIR显示MSCP具有一般多糖的特征官能团;MSCP中总糖、蛋白质、糖醛酸和水分含量分别为80.25%、9.89%、0.07%和5.33%;MSCP的平均分子量为1.56×10~4 Da;XRD结果表明MSCP主要以无定型结构存在;SEM显示MSCP的微观形貌主要成片状聚集体,表面平整但含有一些小空隙。AFM观察发现MSCP为类圆柱状结构,其直径约为50~90 nm,高度约为4~6 nm;MSCP经过DEAE-52和Sephadex G-100柱层析纯化后得到MSCP1和MSCP2两个均一组分。(2)MSCP1的平均分子量(Mw=0.94×10~4 Da,PDI=1.47)明显小于MSCP2(Mw=2.85×10~4 Da,PDI=1.82),但其分子量的分布更加集中;MSCP2的单糖组成和糖苷键类型比MSCP1更为丰富,其由岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)五种单糖组成(摩尔比0.03:0.04:0.05:1.16:0.06),同时包含T-Glcp,1,4-Glcp,1,4-Xylp,1,6-Galp,T-Araf,1,3,4-Fucp和1,4-Glcp A七种糖苷键;而MSCP1仅由Glc和Xyl组成(摩尔比1.31:0.01),其含有1,4-Glcp、T-Glcp,1,4,6-Glcp和1,4-Xylp四种糖苷键;MSCP1和MSCP2在微观形貌上的差异也较大,MSCP1呈现一些碎片状和类球状结构,而MSCP2呈现长短不一的棒状形态;此外,MSCP1和MSCP2都不具有三股螺旋构象。(3)在RAW264.7细胞模型中,MSCP1和MSCP2都可以显著增强巨噬细胞的胞饮能力并刺激细胞分泌活性氧(ROS),同时通过上调细胞因子mRNA的表达来提高一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌水平,表明MSCP1和MSCP2都具有免疫调节活性,但MSCP2的活性要显著高于MSCP1;抗体封闭实验结果表明MSCP1能够通过巨噬细胞膜表面TOLL样受体4(TLR4)和β-葡聚糖受体(GR)的识别来诱导细胞活化,而MSCP2则通过TLR4、GR和清道夫受体(SR)的识别来激活免疫应答。此外,MSCP1和MSCP2对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤具有显著的保护效果,其作用机制与提高受损PC12细胞的存活率,降低ROS的分泌和细胞早期凋亡比例,抑制线粒体膜电位(MMP)下降以及提高胞内抗氧化酶活力有关。(4)界面张力测试表明MSCP能够显著降低油水两相间的界面张力。界面层厚度测试结果表明MSCP在油水界面形成了多层吸附,构建了较厚的界面层。通过改变MSCP浓度(c)或油相比例(Φ)可以实现对乳液液滴尺寸、微观结构、流变特性以及稳定性的有效调控。在广泛的离子强度范围(0~500 m M)以及加热处理(50~90℃)下,MSCP制备的乳液比阿拉伯胶(GA)或辛烯基琥珀酸酐(OSA)改性淀粉等多糖制备的乳液具有更好的稳定性;此外,MSCP能够显著减少油相中氢过氧化物(LH)和丙二醛(MDA)产生,表明MSCP具有抑制乳液中脂质氧化的作用。(5)采用乙酰基对MSCP进行共价修饰,成功制备了具有不同尺度结构的乙酰化牛大力多糖AC-MSCP;虽然AC-MSCP的热稳定性以及清除自由基能力发生下降,但降低界面张力的能力得到显著提高,其乳化能力和乳化稳定性都要强于MSCP;其中,AC-MSCP2和AC-MSCP3的乳化能力优于商业化多糖乳化剂GA;相比于AC-MSCP1~2制备的乳液,AC-MSCP3制备的乳液在储存30 d后的粒径变化最小,表现出较好的稳定性。AC-MSCP1~2表现出与MSCP相似的LH和MDA抑制能力,但AC-MSCP3对MDA的抑制能力要弱于MSCP。综上所述,牛大力多糖不仅具有调节免疫和保护神经的作用,还能作为一种天然乳化剂,在功能性食品、药品或化妆品中具有巨大的应用潜力;此外,乙酰基共价修饰被证实是一种提高亲水性多糖乳化性能的有效策略,具有不同尺度结构的乙酰化牛大力多糖可以适用于不同需求的乳液体系。本研究对于填补牛大力相关研究的空白、拓宽其应用范围、促进牛大力产业的发展具有非常重要的学术价值和实践意义。 摘要译文